小體積大能量：糞便微生物改善脊髓損傷
脊髓損傷（Spinal cord injury, SCI）患者表現(xiàn)出腸道菌群紊亂，而腸道失調(diào)加重SCI模型中的神經(jīng)損傷。大量數(shù)據(jù)支持腸道微生物組在SCI中發(fā)揮重要作用。本文作者推測(cè)：來(lái)源于健康未損傷小鼠的糞便微生物移植至SCI小鼠可以發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用改善SCI。本研究于2021年3月發(fā)表在《Microbiome》IF: 11.607期刊。
技術(shù)路線(xiàn)：
本文主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
1. FMT處理可以改善脊髓損傷小鼠的運(yùn)動(dòng)恢復(fù)
為了探究腸道微生物群對(duì)SCI的影響，將健康未損傷小鼠來(lái)源的FMT轉(zhuǎn)移至SCI損傷小鼠中（圖1a）。在用抗生素取出微生物后，小鼠隨機(jī)分為4組：sham, sham+FMT, SCI, SCI+FMT。結(jié)果表明，與SCI組比較，在FMT處理14天后即顯著提高了后肢的運(yùn)動(dòng)功能，并且提高了開(kāi)放運(yùn)動(dòng)（BMS）得分和BMS亞得分（圖1b, c）；FMT處理后站立階段的行走時(shí)間百分比顯著減少(圖1d)。此外，步幅長(zhǎng)度增加，步幅頻率降低，而FMT處理逆轉(zhuǎn)了這一趨勢(shì)(圖1e, f)。FMT能在一定程度上改善脊髓損傷所致的步態(tài)異常，增強(qiáng)步態(tài)的協(xié)調(diào)性。SCI小鼠的握力在損傷后逐漸持續(xù)恢復(fù)。損傷后7天，14天，和21天，SCI組與FMT組的握力無(wú)明顯差異。僅在損傷后28 天時(shí)，與SCI組相比，FMT組表現(xiàn)出了具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的改善(圖1g)?？傊c未接受FMT治療的受傷小鼠相比，接受FMT治療的小鼠表現(xiàn)出相對(duì)更大的運(yùn)動(dòng)恢復(fù)。
圖1 FMT治療對(duì)運(yùn)動(dòng)恢復(fù)的影響
2. FMT處理可以促進(jìn)下行運(yùn)動(dòng)通路的恢復(fù)
隨后，為了檢測(cè)運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)到后肢運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的下行通路的功能，在傷后4周記錄了運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位(MEPs)（圖2）。MEPs，反應(yīng)神經(jīng)肌肉單元連通性的，電刺激運(yùn)動(dòng)皮層后，記錄腸道肌肉的MEPs（圖2a）。在Sham組和Sham+FMT組，檢測(cè)到典型的MEPs波形。受傷后，MEPs大多被消除，表明神經(jīng)肌肉單元的破壞。與未使用FMT治療的SCI小鼠相比，使用FMT治療的SCI小鼠表現(xiàn)出更大的振幅(圖2b)。不同組的振幅量化如圖2c所示。此外，SCI小鼠MEP潛伏期(至17.8 ms)明顯高于Sham組(4.63 ms)。SCI與SCI+FMT組MEP潛伏期無(wú)顯著差異(圖2d)。這些觀(guān)察結(jié)果表明，FMT治療是有益的，并可能進(jìn)一步促進(jìn)脊髓損傷后的功能恢復(fù)。
圖2 FMT治療對(duì)脊髓傳導(dǎo)能力的影響
3. FMT處理促進(jìn)神經(jīng)元存活和突觸重建
為了探究所觀(guān)察到的運(yùn)動(dòng)恢復(fù)的解剖學(xué)基礎(chǔ)，我們對(duì)脊髓切片進(jìn)行免疫熒光染色（圖3）。在sham組，前角神經(jīng)元表現(xiàn)正常，胞體大，軸突完整。SCI導(dǎo)致NeuN陽(yáng)性神經(jīng)元顯著喪失。然而，與SCI組相比，FMT組的Neun陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著增加(圖3a, b)。突觸蛋白(SYN)是一種標(biāo)記突觸前膜的囊泡蛋白。免疫染色分析顯示損傷后4周SCI組突觸蛋白染色降低，經(jīng)FMT處理后突觸蛋白染色強(qiáng)度增加(圖3 b, d)。神經(jīng)絲(NF-200)是神經(jīng)元軸突中富含的細(xì)胞特異性蛋白，其染色已被應(yīng)用于評(píng)估神經(jīng)元和軸突損傷。與SCI組相比，損傷后4周，FMT處理后病變區(qū)NF-200染色增加(圖3b, e)。數(shù)據(jù)表明，FMT處理可能促進(jìn)了創(chuàng)傷性脊髓損傷后神經(jīng)元的存活和軸突再生。
圖4 FMT治療對(duì)脊髓損傷后神經(jīng)元存活和突觸再生的影響
在指定的時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測(cè)并比較體重。與SCI組相比，SCI + FMT組體重增加更多，在術(shù)后14，21，和28天均表現(xiàn)出顯著差異（圖4a）。與這些結(jié)果相一致的是，與SCI組比較，在SCI +FMT組中觀(guān)察到食物攝入量和水消耗量的增加，特別是在損傷后第28天(圖4b, c)。間接量熱法測(cè)定平均呼吸交換商（RQ值）在SCI + FMT組恢復(fù)正常(圖4 d, e)。如圖4f, g所示，在脊髓損傷動(dòng)物中，FMT治療也顯著提高了平均能量消耗。這些結(jié)果證實(shí)SCI后的FMT處理導(dǎo)致更多食物和水的消耗，更高的能力消耗，和更大的體重增加。
圖4 FMT治療對(duì)體重、食物攝入、水消耗和新陳代謝的影響
5. FMT處理有利于維持SCI小鼠腸道屏障的完整性
改變腸道屏障完整性和隨后的胃腸道功能障礙被認(rèn)為是SCI的病理生理事件。為了測(cè)試是否FMT處理對(duì)脊髓損傷后小鼠腸道屏障通透性有影響，在損傷后第4周測(cè)定FITC標(biāo)記的葡聚糖(4kd)和血液中FITC水平。與SCI + FMT小鼠相比，SCI小鼠結(jié)腸通透性更嚴(yán)重(圖5a)。腸道緊密連接已被證明與腸道屏障完整性有關(guān)。如圖5b、c所示，ZO-1和occludin表明結(jié)腸表面的破壞和無(wú)序增加，FMT治療穩(wěn)定了緊密連接結(jié)構(gòu)，這可以從ZO-1和occludin的平滑和有組織定位得到證明(圖5b)。結(jié)果表明，FMT處理導(dǎo)致緊密連接蛋白表達(dá)上調(diào)并促進(jìn)SCI后的腸道屏障完整性的維持。
圖5 FMT處理對(duì)腸通透性和緊密連接蛋白表達(dá)的影響
6. FMT處理加速SCI小鼠的胃腸道消化
胃腸道消化，是整體評(píng)估腸道活力的，用鋇劑灌胃后再用x射線(xiàn)成像對(duì)小鼠進(jìn)行評(píng)估。不同組在不同時(shí)間點(diǎn)的代表性圖像如圖6a所示(2、3、8 h)。總的來(lái)說(shuō)，SCI小鼠表現(xiàn)出更高水平的胃腸道充盈，表明胃腸道運(yùn)輸較慢，而FMT處理加速了小鼠損傷后胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)(圖6a)。在結(jié)腸充盈和活力方面，在SCI后顯著降低，但在某些時(shí)間點(diǎn)在SCI + FMT組得到改善(圖6 a, b)。形態(tài)學(xué)分析表明，SCI損傷導(dǎo)致結(jié)腸填充增加，但被FMT處理逆轉(zhuǎn)(圖6 a、c)?？偟膩?lái)說(shuō)，FMT處理可能導(dǎo)致SCI后胃腸道消化活力變快。
圖6 FMT對(duì)SCI小鼠胃腸運(yùn)動(dòng)的影響
7. FMT處理調(diào)節(jié)SCI小鼠的腸道微生物組成
為了檢測(cè)FMT是否調(diào)節(jié)腸道微生物組，進(jìn)行了16S rDNA測(cè)序以分析微生物治療SCI小鼠后的細(xì)菌分類(lèi)組成。如圖7a、b所示，sham組與SCI組的ace、chao指數(shù)存在顯著差異，說(shuō)明SCI對(duì)抗生素治療后的再定殖過(guò)程中微生物群的豐富度有顯著影響，這一觀(guān)察結(jié)果與我們之前發(fā)表的脊髓損傷患者與健康對(duì)照組的臨床數(shù)據(jù)一致。FMT處理顯著增加了SCI小鼠腸道菌群的豐富度。熱圖顯示，在門(mén)水平上，各組的相對(duì)豐度存在顯著差異(圖7c)。與Sham組相比，SCI組Firmicutes厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度降低，而FMT處理逆轉(zhuǎn)了這一趨勢(shì)。相比之下，在SCI小鼠中擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度與SCI小鼠沒(méi)有差異(圖7c)。ANCOM模型對(duì)每個(gè)分類(lèi)單元的分析表明SCI處理顯著降低了Firmicutes門(mén)的Christensenellaceae and Lactobacillus的豐度；FMT處理顯著增加了Christensenellaceae的豐度，但是對(duì)Lactobacillus的影響很小（圖7d）。Bacteroidetes門(mén)的Butyricimonas, Muribaculaceae, and Bacteroides的豐度在sham組和SCI組間顯著改變；FMT處理顯著增加了SCI小鼠的Butyricimonas的豐度（圖7d）?？傊?，這些結(jié)果表明FMT處理可以調(diào)節(jié)SCI小鼠的微生物群組成以改善腸道微生物失調(diào)。
圖7 FMT處理對(duì)脊髓損傷后腸道細(xì)菌組成的影響
8. FMT處理可恢復(fù)SCI小鼠中糞便短鏈脂肪酸(SCFAs)
腸道微生物發(fā)酵的某些最終產(chǎn)物可進(jìn)入血液，影響宿主中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生理功能。在調(diào)控微生物群系腸-腦軸的潛在因子中，微生物代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸（SCFAs）可能是主要的中介因子。檢測(cè)了不同組糞便中乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸和己酸等短鏈脂肪酸的濃度。檢測(cè)的糞便短鏈脂肪酸中，丁酸含量變化最大， SCI組與sham組比較減少了58.6%。與SCI小鼠相比，FMT上調(diào)了糞便丁酸水平46.7%(圖8b)。與丁酸類(lèi)似，與sham組比較，SCI小鼠體內(nèi)丙酸和異丁酸含量也分別下降了21.2%和39.4%，而FMT處理后，SCI小鼠糞便丙酸和異丁酸水平分別顯著提高了21.3%和65.0%(圖8a、c)。SCI小鼠的己酸減少了31.8%，但FMT治療并沒(méi)有顯著改變己酸的數(shù)量(圖8d)。此外，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)乙酸、戊酸和異戊酸的顯著變化(表S1)。這些數(shù)據(jù)表明，FMT治療可能通過(guò)改變糞便短鏈脂肪酸介導(dǎo)宿主的病理生理變化。
圖8 FMT治療對(duì)小鼠糞便短鏈脂肪酸水平的影響
9. 短鏈脂肪酸與運(yùn)動(dòng)恢復(fù)/腸屏障通透性的相關(guān)性
接下來(lái)，評(píng)估了丙酸、丁酸和異丁酸的含量是否與運(yùn)動(dòng)恢復(fù)或腸道完整性相關(guān)。多變量方差分析(MANOVA)以各組為自變量，運(yùn)動(dòng)預(yù)后(BMS評(píng)分和BMS亞得分)、腸道滲透率(FITC -葡聚糖)和代謝產(chǎn)物水平(丁酸、丙酸和異丁酸)為因變量。如圖9所示，丙酸含量與BMS得分及BMS亞得分呈正相關(guān)；丁酸數(shù)量與BMS分?jǐn)?shù)和BMS子分?jǐn)?shù)的相關(guān)性也得到了類(lèi)似的結(jié)果。丁酸含量與熒光素標(biāo)記葡聚糖的滲透性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。此外，異丁酸含量與BMS得分呈正相關(guān)。異丁酸含量與BMS評(píng)分/ FITC -葡聚糖滲透性之間的相關(guān)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，某些短鏈脂肪酸的含量對(duì)SCI后的功能恢復(fù)和屏障完整性具有一定的預(yù)測(cè)能力。
圖9 SCFAs與BMS評(píng)分/BMS亞評(píng)分/ FITC -葡聚糖通透性之間的相關(guān)性
10. FMT可能通過(guò)抑制IL-1β/ NF-κB信號(hào)通路來(lái)緩解神經(jīng)炎癥
為了進(jìn)一步探討SCI腸道微生物失調(diào)與神經(jīng)炎癥之間的分子相互作用，應(yīng)用免疫組化和WB分析了TNFα、IL-1β和NF-κB的在脊髓中的表達(dá)(圖10a, b)。從圖10c可以看出，TNFα的表達(dá)在不同組間無(wú)明顯變化。同時(shí)，脊髓損傷4周后，小鼠脊髓組織中IL-1β和NF-κ b陽(yáng)性表達(dá)顯著增加。此外，FMT治療降低IL-1β和NF-κB陽(yáng)性染色（圖10a）。WB結(jié)果顯示，FMT處理明顯降低了損傷后IL-1β和NF-κB的表達(dá)(圖10d, e)，而對(duì)TNFα的表達(dá)無(wú)明顯改變(圖10c)，這與免疫染色結(jié)果一致。
圖10 FMT治療對(duì)脊髓TNF α、IL-1β、NF-κB表達(dá)的影響
11. FMT可能通過(guò)抑制NF -κB信號(hào)通路來(lái)緩解腸道炎癥
作者還調(diào)查了炎癥是否與腸道有關(guān)。免疫組織學(xué)染色顯示TNFα、IL-1β和NF- κ b陽(yáng)性染色主要分布在結(jié)腸黏膜層。WB結(jié)果顯示，結(jié)腸中炎癥分子的相對(duì)表達(dá)似乎低于脊髓中的。圖11顯示，組織染色(圖11a)和WB(圖11b-d)顯示，TNFα和IL-1β的表達(dá)在各組間無(wú)顯著差異，然而，與sham組比較，SCI小鼠結(jié)腸中NF -κB的表達(dá)上調(diào)，SCI + FMT組的小鼠表現(xiàn)出NF –κB表達(dá)下調(diào)，與SCI組相比(圖11 a, b, e)。這些結(jié)果表明，NF -κB信號(hào)通路參與腸道炎癥和神經(jīng)炎癥。最近的研究表明，短鏈脂肪酸在神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用。FMT可能改變SCFA表達(dá)譜，減輕腸道炎癥和神經(jīng)炎癥。
圖11 FMT治療對(duì)結(jié)腸TNF α、IL-1β、NF-κB表達(dá)的影響
FMT治療促進(jìn)了小鼠脊髓功能恢復(fù)，促進(jìn)了神經(jīng)元軸突再生，改善了動(dòng)物體重增加和代謝特征，并增強(qiáng)了腸道屏障完整性和胃腸道運(yùn)動(dòng)。此外，FMT處理顯著改變了腸道菌群組成和糞便短鏈脂肪酸的數(shù)量。此外，FMT還下調(diào)了脊髓IL-1β/NFκb信號(hào)通路和腸道NF-κB信號(hào)通路。這些數(shù)據(jù)表明，FMT對(duì)腸道菌群的重編程改善了SCI小鼠的運(yùn)動(dòng)功能和腸道功能，可能是通過(guò)短鏈脂肪酸的抗炎作用。