circSDHC-腎細(xì)胞癌的治療靶點(diǎn)

越來(lái)越多的證據(jù)表明，circRNAs在癌癥的發(fā)展和進(jìn)展中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用；然而，circRNAs在腎細(xì)胞癌(RCC)中的表達(dá)模式和生物學(xué)功能在很大程度上仍不清楚。小編今天給大家?guī)?lái)發(fā)表于影響因子為15.302的雜志“Molecular Cancer”上的文章“Circular RNA circSDHC serves as a sponge for miR-127-3p to promote the proliferation and metastasis of renal cell carcinoma via the CDKN3/E2F1 axis”。

在本研究中，我們對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)表的circRNA芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，確定circSDHC可能在RCC的發(fā)展和進(jìn)展中起致癌作用。通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，我們證明circSDHC作為miRNA-127-3p的海綿，從而調(diào)控CDKN3/E2F1軸。因此，circSDHC是一個(gè)很有前景的RCC患者潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

技術(shù)路線

結(jié)果
1）RCC中致癌circRNA的發(fā)現(xiàn)和circSDHC的表征

我們利用circRNA芯片分析人體組織樣本的兩個(gè)GEO數(shù)據(jù)集(GSE137836和GSE100186)，研究了circRNA在RCC發(fā)展和進(jìn)展中的作用。我們選擇了log2 foldchange > 1或<?1，p < 0.05的circRNA，如圖1a所示。我們提取了兩個(gè)數(shù)據(jù)集重疊的circRNA，這些circRNA代表了RCC中一致的調(diào)節(jié)模式，產(chǎn)生了434個(gè)circRNA子集(圖1b)。我們選擇了20個(gè)最顯著上調(diào)的circRNA，繪制了熱圖(圖1c)。相關(guān)分析表明，circSDHC表達(dá)與臨床病理參數(shù)TNM分期相關(guān)。此外，單因素和多因素Cox分析均表明，較高的circSDHC表達(dá)與不良生存結(jié)局相關(guān)。circSDHC來(lái)源于第1染色體上的SDHC基因，由外顯子2、3、4和5的反剪接產(chǎn)生(385 bp)。我們通過(guò)Sanger測(cè)序確認(rèn)了circSDHC的反剪接連接(圖1d)。與正常腎上皮細(xì)胞系HK2相比，4個(gè)RCC細(xì)胞系(Caki-1, A498, 786-O, 769P)的circSDHC表達(dá)升高(圖1e)。PCR分析證實(shí)，不同的引物可以從cDNA中擴(kuò)增circSDHC，但不能從gDNA中擴(kuò)增(圖1f)。此外，circSDHC對(duì)RNase R處理更耐藥，而SDHC mRNA在此處理下顯著降解(圖1g)。CircSDHC的半衰期也比SDHC mRNA長(zhǎng)，放線菌素D處理證實(shí)了這一點(diǎn)(圖1h)。此外，通過(guò)FISH實(shí)驗(yàn)分析了circSDHC在786-O細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位，表明大部分circSDHC定位于細(xì)胞質(zhì)(圖1i)。

2）CircSDHC促進(jìn)RCC增殖和侵襲性

為了評(píng)估CircSDHC在RCC中的生物學(xué)作用，我們進(jìn)行了功能測(cè)定。為了操縱circSDHC的表達(dá)，我們構(gòu)建了針對(duì)反剪接連接的siRNA(圖2a)。在circSDHC水平最高的兩株RCC細(xì)胞系(786-O和A498)中，利用sirna成功敲低了circSDHC的表達(dá)，且不改變SDHC mRNA的線性表達(dá)(圖2b)。敲低circSDHC顯著減少了786-O和A498細(xì)胞遷移和入侵的能力 (圖2 c, e)。此外，敲除circSDHC后，這些細(xì)胞的增殖也受到抑制(圖2 d, f)。為了進(jìn)一步研究其功能，我們構(gòu)建了一個(gè)circSDHC過(guò)表達(dá)載體，該載體在另一個(gè)RCC細(xì)胞系769P中顯著上調(diào)了circSDHC的水平(圖2 g)。與敲除實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致的是，circSDHC過(guò)表達(dá)可增加769P細(xì)的遷移、侵襲和增殖率(圖2h, i)。

3）腫瘤抑制因子miR-127-3p是circSDHC在RCC中的一個(gè)靶點(diǎn)

由于我們的數(shù)據(jù)表明circSDHC定位于細(xì)胞質(zhì)，我們?cè)噲D確定它是否可以作為miRNA海綿。首先，我們利用兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了可能受circSDHC調(diào)控的下游miRNAs。四個(gè)miRNAs，包括miR-3612、miR650、miR-519a-3p和miR-127-3p，在兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中都被鑒定為circSDHC的潛在靶標(biāo)(圖3a)。為了進(jìn)一步評(píng)估circSDHC與miRNAs之間的關(guān)系，我們構(gòu)建了生物素標(biāo)記的circSDHC探針，qRT-PCR證實(shí)了該探針可以特異性下拉circSDHC(圖3b, c)。接下來(lái)，使用該探針下拉786-O和A498細(xì)胞中與circSDHC結(jié)合的miRNAs。隨后的qRT-PCR證實(shí)miR-127-3p可以在786-O和A498細(xì)胞中與circSDHC結(jié)合(圖3d)。接下來(lái)，我們進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)，結(jié)果證實(shí)了之前的研究結(jié)果(圖3e)。此外，生物素標(biāo)記的miR-127-3p比陰性對(duì)照探針捕獲的circSDHC更多(圖3f)，在786-O細(xì)胞中的FISH分析顯示，circSDHC和miR-127-3p共定位于細(xì)胞質(zhì)中(圖3g)。此外，我們對(duì)ccRCC患者數(shù)據(jù)的分析顯示，miR-127-3p與circSDHC呈負(fù)相關(guān)(圖3h)。這些結(jié)果表明，circSDHC可以與miR-127-3p結(jié)合，充當(dāng)miR-127-3p的海綿。最后，在786-O和A498細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-127-3p可降低攻擊性和增殖(圖3i-l)。

4）miR-127-3p通過(guò)下調(diào)CDKN3/E2F1軸抑制RCC進(jìn)程

我們利用ENCORI數(shù)據(jù)庫(kù)確定miR-127-3p調(diào)控的靶基因和下游通路。Cyclin依賴性激酶抑制劑3 (CDKN3)被鑒定為miR-127-3p調(diào)控的潛在候選基因 (圖4a)。此外，我們進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)，其中含有野生型CDKN3序列的載體與miR-127-3p模擬物共轉(zhuǎn)染，導(dǎo)致熒光素酶活性降低50%以上。相比之下，轉(zhuǎn)染含有突變CDKN3序列的載體對(duì)熒光素酶活性沒(méi)有影響(圖4b)。Western blot檢測(cè)證實(shí)了這一調(diào)控(圖4c)。這些結(jié)果表明，miR-127-3p可通過(guò)下調(diào)CDKN3抑制RCC進(jìn)程。此外，RCC細(xì)胞中CDKN3基因敲除導(dǎo)致細(xì)胞增殖率降低，遷移和侵襲能力減弱(圖4d-g)。為了預(yù)測(cè)涉及CDKN3下游的通路，我們使用了基因集富集分析。結(jié)果表明E2F1是一個(gè)潛在的參與途徑(圖4h)。E2F1是一種有效的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，參與多種不同類型癌癥的發(fā)展。GEPIA預(yù)測(cè)顯示CDKN3與E2F1水平呈正相關(guān)(圖4i)，在786-O和A498細(xì)胞中CDKN3敲除后的western blot分析證實(shí)了這一關(guān)系(圖4 -k)。

5）circSDHC作為miR-127-3p的海綿，調(diào)節(jié)CDKN3/E2F1，促進(jìn)RCC進(jìn)展

為了研究circSDHC是否通過(guò)對(duì)miR-127-3p的海綿作用促進(jìn)RCC進(jìn)展，我們使用miR-127-3p抑制劑和模擬物在circSDHC缺失或過(guò)表達(dá)后進(jìn)行拯救實(shí)驗(yàn)。敲低circSDHC抑制786-O細(xì)胞的侵襲和增殖；然而，miR- 127-3p抑制劑可以挽救這種抑制作用(圖5 a, c)。在過(guò)表達(dá)circSDHC的769P細(xì)胞中也觀察到類似的效果，這些細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的攻擊性和增殖能力，而miR-127-3p mimic可減弱這些能力(圖5 b, d)。Western blot檢測(cè)結(jié)果也與觀察到的功能變化一致，轉(zhuǎn)染circSDHC siRNA后，CDKN3和E2F1通路被激活較少，而miR-127-3p抑制劑可以挽救這一過(guò)程(圖5e)。相比之下，轉(zhuǎn)染circSDHC過(guò)表達(dá)載體可激活CDKN3/E2F1通路，而在769P細(xì)胞中引入miR127-3p mimic可降低這一效應(yīng)(圖5f)。

6）敲除circSDHC可抑制RCC的體內(nèi)腫瘤進(jìn)展

為了評(píng)估circSDHC在體內(nèi)的致癌作用，在786-O細(xì)胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染靶向circSDHC的shRNA(圖6a)。注射circSDHC敲低癌細(xì)胞的小鼠比對(duì)照組表現(xiàn)出更少的惡病質(zhì)，表現(xiàn)為小鼠體重的變化(圖6b)。8周后對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠實(shí)施安樂(lè)死，收集肺組織。注射了circSDHC敲除癌細(xì)胞的小鼠肺的轉(zhuǎn)移灶比對(duì)照組少(圖6c)。皮下腫瘤形成評(píng)估表明，circSDHC敲除組的總體平均腫瘤體積(圖6d)和腫瘤重量(圖6e)明顯低于對(duì)照組。對(duì)這些皮下腫瘤的免疫組化分析顯示，circSDHC敲低組CDKN3和E2F1表達(dá)水平降低(圖6f)，兩組間CDKN3和E2F1的免疫組化評(píng)分顯著(圖6g)。這些結(jié)果表明，敲除circSDHC可在體內(nèi)抑制RCC腫瘤進(jìn)展。

結(jié)論

綜上所述，circSDHC在ccRCC中過(guò)表達(dá)，且其過(guò)表達(dá)與低存活率相關(guān)。此外，circSDHC通過(guò)充當(dāng)miR-127-3p的海綿，促進(jìn)ccRCC的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。miR-127-3p是一種腫瘤抑制因子，可下調(diào)CDKN3/E2F1軸的活性。