circSDHC-腎細胞癌的治療靶點

越來越多的證據(jù)表明，circRNAs在癌癥的發(fā)展和進展中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用；然而，circRNAs在腎細胞癌(RCC)中的表達模式和生物學(xué)功能在很大程度上仍不清楚。小編今天給大家?guī)戆l(fā)表于影響因子為15.302的雜志“Molecular Cancer”上的文章“Circular RNA circSDHC serves as a sponge for miR-127-3p to promote the proliferation and metastasis of renal cell carcinoma via the CDKN3/E2F1 axis”。

在本研究中，我們對GEO數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的circRNA芯片數(shù)據(jù)進行了生物信息學(xué)分析，確定circSDHC可能在RCC的發(fā)展和進展中起致癌作用。通過體外和體內(nèi)實驗，我們證明circSDHC作為miRNA-127-3p的海綿，從而調(diào)控CDKN3/E2F1軸。因此，circSDHC是一個很有前景的RCC患者潛在的預(yù)后生物標志物和治療靶點。

技術(shù)路線

結(jié)果
1）RCC中致癌circRNA的發(fā)現(xiàn)和circSDHC的表征

我們利用circRNA芯片分析人體組織樣本的兩個GEO數(shù)據(jù)集(GSE137836和GSE100186)，研究了circRNA在RCC發(fā)展和進展中的作用。我們選擇了log2 foldchange > 1或<?1，p < 0.05的circRNA，如圖1a所示。我們提取了兩個數(shù)據(jù)集重疊的circRNA，這些circRNA代表了RCC中一致的調(diào)節(jié)模式，產(chǎn)生了434個circRNA子集(圖1b)。我們選擇了20個最顯著上調(diào)的circRNA，繪制了熱圖(圖1c)。相關(guān)分析表明，circSDHC表達與臨床病理參數(shù)TNM分期相關(guān)。此外，單因素和多因素Cox分析均表明，較高的circSDHC表達與不良生存結(jié)局相關(guān)。circSDHC來源于第1染色體上的SDHC基因，由外顯子2、3、4和5的反剪接產(chǎn)生(385 bp)。我們通過Sanger測序確認了circSDHC的反剪接連接(圖1d)。與正常腎上皮細胞系HK2相比，4個RCC細胞系(Caki-1, A498, 786-O, 769P)的circSDHC表達升高(圖1e)。PCR分析證實，不同的引物可以從cDNA中擴增circSDHC，但不能從gDNA中擴增(圖1f)。此外，circSDHC對RNase R處理更耐藥，而SDHC mRNA在此處理下顯著降解(圖1g)。CircSDHC的半衰期也比SDHC mRNA長，放線菌素D處理證實了這一點(圖1h)。此外，通過FISH實驗分析了circSDHC在786-O細胞中的亞細胞定位，表明大部分circSDHC定位于細胞質(zhì)(圖1i)。

2）CircSDHC促進RCC增殖和侵襲性

為了評估CircSDHC在RCC中的生物學(xué)作用，我們進行了功能測定。為了操縱circSDHC的表達，我們構(gòu)建了針對反剪接連接的siRNA(圖2a)。在circSDHC水平最高的兩株RCC細胞系(786-O和A498)中，利用sirna成功敲低了circSDHC的表達，且不改變SDHC mRNA的線性表達(圖2b)。敲低circSDHC顯著減少了786-O和A498細胞遷移和入侵的能力 (圖2 c, e)。此外，敲除circSDHC后，這些細胞的增殖也受到抑制(圖2 d, f)。為了進一步研究其功能，我們構(gòu)建了一個circSDHC過表達載體，該載體在另一個RCC細胞系769P中顯著上調(diào)了circSDHC的水平(圖2 g)。與敲除實驗結(jié)果一致的是，circSDHC過表達可增加769P細的遷移、侵襲和增殖率(圖2h, i)。

3）腫瘤抑制因子miR-127-3p是circSDHC在RCC中的一個靶點

由于我們的數(shù)據(jù)表明circSDHC定位于細胞質(zhì)，我們試圖確定它是否可以作為miRNA海綿。首先，我們利用兩個數(shù)據(jù)庫預(yù)測了可能受circSDHC調(diào)控的下游miRNAs。四個miRNAs，包括miR-3612、miR650、miR-519a-3p和miR-127-3p，在兩個數(shù)據(jù)庫中都被鑒定為circSDHC的潛在靶標(圖3a)。為了進一步評估circSDHC與miRNAs之間的關(guān)系，我們構(gòu)建了生物素標記的circSDHC探針，qRT-PCR證實了該探針可以特異性下拉circSDHC(圖3b, c)。接下來，使用該探針下拉786-O和A498細胞中與circSDHC結(jié)合的miRNAs。隨后的qRT-PCR證實miR-127-3p可以在786-O和A498細胞中與circSDHC結(jié)合(圖3d)。接下來，我們進行了熒光素酶報告基因檢測，結(jié)果證實了之前的研究結(jié)果(圖3e)。此外，生物素標記的miR-127-3p比陰性對照探針捕獲的circSDHC更多(圖3f)，在786-O細胞中的FISH分析顯示，circSDHC和miR-127-3p共定位于細胞質(zhì)中(圖3g)。此外，我們對ccRCC患者數(shù)據(jù)的分析顯示，miR-127-3p與circSDHC呈負相關(guān)(圖3h)。這些結(jié)果表明，circSDHC可以與miR-127-3p結(jié)合，充當miR-127-3p的海綿。最后，在786-O和A498細胞中過表達miR-127-3p可降低攻擊性和增殖(圖3i-l)。

4）miR-127-3p通過下調(diào)CDKN3/E2F1軸抑制RCC進程

我們利用ENCORI數(shù)據(jù)庫確定miR-127-3p調(diào)控的靶基因和下游通路。Cyclin依賴性激酶抑制劑3 (CDKN3)被鑒定為miR-127-3p調(diào)控的潛在候選基因 (圖4a)。此外，我們進行了雙熒光素酶報告基因檢測，其中含有野生型CDKN3序列的載體與miR-127-3p模擬物共轉(zhuǎn)染，導(dǎo)致熒光素酶活性降低50%以上。相比之下，轉(zhuǎn)染含有突變CDKN3序列的載體對熒光素酶活性沒有影響(圖4b)。Western blot檢測證實了這一調(diào)控(圖4c)。這些結(jié)果表明，miR-127-3p可通過下調(diào)CDKN3抑制RCC進程。此外，RCC細胞中CDKN3基因敲除導(dǎo)致細胞增殖率降低，遷移和侵襲能力減弱(圖4d-g)。為了預(yù)測涉及CDKN3下游的通路，我們使用了基因集富集分析。結(jié)果表明E2F1是一個潛在的參與途徑(圖4h)。E2F1是一種有效的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，參與多種不同類型癌癥的發(fā)展。GEPIA預(yù)測顯示CDKN3與E2F1水平呈正相關(guān)(圖4i)，在786-O和A498細胞中CDKN3敲除后的western blot分析證實了這一關(guān)系(圖4 -k)。

5）circSDHC作為miR-127-3p的海綿，調(diào)節(jié)CDKN3/E2F1，促進RCC進展

為了研究circSDHC是否通過對miR-127-3p的海綿作用促進RCC進展，我們使用miR-127-3p抑制劑和模擬物在circSDHC缺失或過表達后進行拯救實驗。敲低circSDHC抑制786-O細胞的侵襲和增殖；然而，miR- 127-3p抑制劑可以挽救這種抑制作用(圖5 a, c)。在過表達circSDHC的769P細胞中也觀察到類似的效果，這些細胞表現(xiàn)出更強的攻擊性和增殖能力，而miR-127-3p mimic可減弱這些能力(圖5 b, d)。Western blot檢測結(jié)果也與觀察到的功能變化一致，轉(zhuǎn)染circSDHC siRNA后，CDKN3和E2F1通路被激活較少，而miR-127-3p抑制劑可以挽救這一過程(圖5e)。相比之下，轉(zhuǎn)染circSDHC過表達載體可激活CDKN3/E2F1通路，而在769P細胞中引入miR127-3p mimic可降低這一效應(yīng)(圖5f)。

6）敲除circSDHC可抑制RCC的體內(nèi)腫瘤進展

為了評估circSDHC在體內(nèi)的致癌作用，在786-O細胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染靶向circSDHC的shRNA(圖6a)。注射circSDHC敲低癌細胞的小鼠比對照組表現(xiàn)出更少的惡病質(zhì)，表現(xiàn)為小鼠體重的變化(圖6b)。8周后對實驗組和對照組小鼠實施安樂死，收集肺組織。注射了circSDHC敲除癌細胞的小鼠肺的轉(zhuǎn)移灶比對照組少(圖6c)。皮下腫瘤形成評估表明，circSDHC敲除組的總體平均腫瘤體積(圖6d)和腫瘤重量(圖6e)明顯低于對照組。對這些皮下腫瘤的免疫組化分析顯示，circSDHC敲低組CDKN3和E2F1表達水平降低(圖6f)，兩組間CDKN3和E2F1的免疫組化評分顯著(圖6g)。這些結(jié)果表明，敲除circSDHC可在體內(nèi)抑制RCC腫瘤進展。

結(jié)論

綜上所述，circSDHC在ccRCC中過表達，且其過表達與低存活率相關(guān)。此外，circSDHC通過充當miR-127-3p的海綿，促進ccRCC的進展和轉(zhuǎn)移。miR-127-3p是一種腫瘤抑制因子，可下調(diào)CDKN3/E2F1軸的活性。