circSDHC-腎細(xì)胞癌的治療靶點(diǎn)

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2021-04-27
越來(lái)越多的證據(jù)表明,circRNAs在癌癥的發(fā)展和進(jìn)展中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用;然而,circRNAs在腎細(xì)胞癌(RCC)中的表達(dá)模式和生物學(xué)功能在......


越來(lái)越多的證據(jù)表明,circRNAs在癌癥的發(fā)展和進(jìn)展中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用;然而,circRNAs在腎細(xì)胞癌(RCC)中的表達(dá)模式和生物學(xué)功能在很大程度上仍不清楚。小編今天給大家?guī)?lái)發(fā)表于影響因子為15.302的雜志Molecular Cancer上的文章Circular RNA circSDHC serves as a sponge for miR-127-3p to promote the proliferation and metastasis of renal cell carcinoma via the CDKN3/E2F1 axis。

 

在本研究中,我們對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)表的circRNA芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,確定circSDHC可能在RCC的發(fā)展和進(jìn)展中起致癌作用。通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn),我們證明circSDHC作為miRNA-127-3p的海綿,從而調(diào)控CDKN3/E2F1軸。因此,circSDHC是一個(gè)很有前景的RCC患者潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

技術(shù)路線

 

結(jié)果
1
RCC中致癌circRNA的發(fā)現(xiàn)和circSDHC的表征

我們利用circRNA芯片分析人體組織樣本的兩個(gè)GEO數(shù)據(jù)集(GSE137836GSE100186),研究了circRNARCC發(fā)展和進(jìn)展中的作用。我們選擇了log2 foldchange > 1<?1p < 0.05circRNA,如圖1a所示。我們提取了兩個(gè)數(shù)據(jù)集重疊的circRNA,這些circRNA代表了RCC中一致的調(diào)節(jié)模式,產(chǎn)生了434個(gè)circRNA子集(1b)。我們選擇了20個(gè)最顯著上調(diào)的circRNA,繪制了熱圖(1c)。相關(guān)分析表明,circSDHC表達(dá)與臨床病理參數(shù)TNM分期相關(guān)。此外,單因素和多因素Cox分析均表明,較高的circSDHC表達(dá)與不良生存結(jié)局相關(guān)。circSDHC來(lái)源于第1染色體上的SDHC基因,由外顯子2、3、45的反剪接產(chǎn)生(385 bp)。我們通過(guò)Sanger測(cè)序確認(rèn)了circSDHC的反剪接連接(1d)。與正常腎上皮細(xì)胞系HK2相比,4個(gè)RCC細(xì)胞系(Caki-1, A498, 786-O, 769P)circSDHC表達(dá)升高(1e)。PCR分析證實(shí),不同的引物可以從cDNA中擴(kuò)增circSDHC,但不能從gDNA中擴(kuò)增(1f)。此外,circSDHC對(duì)RNase R處理更耐藥,而SDHC mRNA在此處理下顯著降解(1g)。CircSDHC的半衰期也比SDHC mRNA長(zhǎng),放線菌素D處理證實(shí)了這一點(diǎn)(1h)。此外,通過(guò)FISH實(shí)驗(yàn)分析了circSDHC786-O細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位,表明大部分circSDHC定位于細(xì)胞質(zhì)(1i)

2CircSDHC促進(jìn)RCC增殖和侵襲性

為了評(píng)估CircSDHCRCC中的生物學(xué)作用,我們進(jìn)行了功能測(cè)定。為了操縱circSDHC的表達(dá),我們構(gòu)建了針對(duì)反剪接連接的siRNA(2a)。在circSDHC水平最高的兩株RCC細(xì)胞系(786-OA498)中,利用sirna成功敲低了circSDHC的表達(dá),且不改變SDHC mRNA的線性表達(dá)(2b)。敲低circSDHC顯著減少了786-OA498細(xì)胞遷移和入侵的能力 (2 c, e)。此外,敲除circSDHC后,這些細(xì)胞的增殖也受到抑制(2 d, f)。為了進(jìn)一步研究其功能,我們構(gòu)建了一個(gè)circSDHC過(guò)表達(dá)載體,該載體在另一個(gè)RCC細(xì)胞系769P中顯著上調(diào)了circSDHC的水平(2 g)。與敲除實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致的是,circSDHC過(guò)表達(dá)可增加769P細(xì)的遷移、侵襲和增殖率(2h, i)。

 

3)腫瘤抑制因子miR-127-3pcircSDHCRCC中的一個(gè)靶點(diǎn)

由于我們的數(shù)據(jù)表明circSDHC定位于細(xì)胞質(zhì),我們?cè)噲D確定它是否可以作為miRNA海綿。首先,我們利用兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了可能受circSDHC調(diào)控的下游miRNAs。四個(gè)miRNAs,包括miR-3612miR650、miR-519a-3pmiR-127-3p,在兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中都被鑒定為circSDHC的潛在靶標(biāo)(3a)。為了進(jìn)一步評(píng)估circSDHCmiRNAs之間的關(guān)系,我們構(gòu)建了生物素標(biāo)記的circSDHC探針,qRT-PCR證實(shí)了該探針可以特異性下拉circSDHC(3b, c)。接下來(lái),使用該探針下拉786-OA498細(xì)胞中與circSDHC結(jié)合的miRNAs。隨后的qRT-PCR證實(shí)miR-127-3p可以在786-OA498細(xì)胞中與circSDHC結(jié)合(3d)。接下來(lái),我們進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè),結(jié)果證實(shí)了之前的研究結(jié)果(3e)。此外,生物素標(biāo)記的miR-127-3p比陰性對(duì)照探針捕獲的circSDHC更多(3f),在786-O細(xì)胞中的FISH分析顯示,circSDHCmiR-127-3p共定位于細(xì)胞質(zhì)中(3g)。此外,我們對(duì)ccRCC患者數(shù)據(jù)的分析顯示,miR-127-3pcircSDHC呈負(fù)相關(guān)(3h)。這些結(jié)果表明,circSDHC可以與miR-127-3p結(jié)合,充當(dāng)miR-127-3p的海綿。最后,在786-OA498細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-127-3p可降低攻擊性和增殖(3i-l)。

 

4miR-127-3p通過(guò)下調(diào)CDKN3/E2F1軸抑制RCC進(jìn)程

我們利用ENCORI數(shù)據(jù)庫(kù)確定miR-127-3p調(diào)控的靶基因和下游通路。Cyclin依賴性激酶抑制劑3 (CDKN3)被鑒定為miR-127-3p調(diào)控的潛在候選基因 (4a)。此外,我們進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè),其中含有野生型CDKN3序列的載體與miR-127-3p模擬物共轉(zhuǎn)染,導(dǎo)致熒光素酶活性降低50%以上。相比之下,轉(zhuǎn)染含有突變CDKN3序列的載體對(duì)熒光素酶活性沒(méi)有影響(4b)。Western blot檢測(cè)證實(shí)了這一調(diào)控(4c)。這些結(jié)果表明,miR-127-3p可通過(guò)下調(diào)CDKN3抑制RCC進(jìn)程。此外,RCC細(xì)胞中CDKN3基因敲除導(dǎo)致細(xì)胞增殖率降低,遷移和侵襲能力減弱(4d-g)。為了預(yù)測(cè)涉及CDKN3下游的通路,我們使用了基因集富集分析。結(jié)果表明E2F1是一個(gè)潛在的參與途徑(4h)。E2F1是一種有效的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,參與多種不同類型癌癥的發(fā)展。GEPIA預(yù)測(cè)顯示CDKN3E2F1水平呈正相關(guān)(4i),在786-OA498細(xì)胞中CDKN3敲除后的western blot分析證實(shí)了這一關(guān)系(4 -k)。

5circSDHC作為miR-127-3p的海綿,調(diào)節(jié)CDKN3/E2F1,促進(jìn)RCC進(jìn)展

為了研究circSDHC是否通過(guò)對(duì)miR-127-3p的海綿作用促進(jìn)RCC進(jìn)展,我們使用miR-127-3p抑制劑和模擬物在circSDHC缺失或過(guò)表達(dá)后進(jìn)行拯救實(shí)驗(yàn)敲低circSDHC抑制786-O細(xì)胞的侵襲和增殖;然而,miR- 127-3p抑制劑可以挽救這種抑制作用(5 a, c)。在過(guò)表達(dá)circSDHC769P細(xì)胞中也觀察到類似的效果,這些細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的攻擊性和增殖能力,而miR-127-3p mimic可減弱這些能力(5 b, d)。Western blot檢測(cè)結(jié)果也與觀察到的功能變化一致,轉(zhuǎn)染circSDHC siRNA后,CDKN3E2F1通路被激活較少,而miR-127-3p抑制劑可以挽救這一過(guò)程(5e)。相比之下,轉(zhuǎn)染circSDHC過(guò)表達(dá)載體可激活CDKN3/E2F1通路,而在769P細(xì)胞中引入miR127-3p mimic可降低這一效應(yīng)(5f)

6)敲除circSDHC可抑制RCC的體內(nèi)腫瘤進(jìn)展

為了評(píng)估circSDHC在體內(nèi)的致癌作用,在786-O細(xì)胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染靶向circSDHCshRNA(6a)。注射circSDHC敲低癌細(xì)胞的小鼠比對(duì)照組表現(xiàn)出更少的惡病質(zhì),表現(xiàn)為小鼠體重的變化(6b)。8周后對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠實(shí)施安樂(lè)死,收集肺組織。注射了circSDHC敲除癌細(xì)胞的小鼠肺的轉(zhuǎn)移灶比對(duì)照組少(6c)。皮下腫瘤形成評(píng)估表明,circSDHC敲除組的總體平均腫瘤體積(6d)和腫瘤重量(6e)明顯低于對(duì)照組。對(duì)這些皮下腫瘤的免疫組化分析顯示,circSDHC敲低組CDKN3E2F1表達(dá)水平降低(6f),兩組間CDKN3E2F1的免疫組化評(píng)分顯著(6g)。這些結(jié)果表明,敲除circSDHC可在體內(nèi)抑制RCC腫瘤進(jìn)展。

 


結(jié)論

綜上所述,circSDHCccRCC中過(guò)表達(dá),且其過(guò)表達(dá)與低存活率相關(guān)。此外,circSDHC通過(guò)充當(dāng)miR-127-3p的海綿,促進(jìn)ccRCC的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。miR-127-3p是一種腫瘤抑制因子,可下調(diào)CDKN3/E2F1軸的活性。