Tempol：超氧化物歧化酶模擬物可用于改善多囊卵巢綜合征

多囊卵巢綜合征（PCOS）是一種復(fù)雜的內(nèi)分泌和代謝紊亂疾病，通常伴有氧化應(yīng)激。Tempol是一種超氧化物歧化酶（SOD）模擬物，可預(yù)防由氧化應(yīng)激引起的多種疾病。但是，目前尚不清楚tempol對PCOS的影響。本文通過腸道微生物組的16S rDNA測序和非靶向代謝組學(xué)分析脫氫表雄酮（DHEA）誘發(fā)的PCOS卵巢功能障礙和葡萄糖耐量減輕的大鼠模型回答了該問題，并于2021年2月發(fā)表在《Redox Biol》IF：9.986。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1. Tempol減輕DHEA誘導(dǎo)的PCOS大鼠卵巢功能障礙和細(xì)胞凋亡

實(shí)驗(yàn)過程設(shè)計如圖1A所示。用發(fā)情周期觀察DHEA和/或tempol對卵巢功能的影響，如圖1B所示，oil+ PBS組大鼠的動情周期為4 ~ 5天，而DHEA + PBS組大鼠大多處于動情期(圖1B)。經(jīng)tempol處理后，發(fā)情周期紊亂得到改善(圖1B)。H&E染色顯示oil+ PBS組卵巢在不同發(fā)育階段均出現(xiàn)卵泡和少量新鮮黃體(圖1C)。與對照組相比，DHEA + PBS組的囊泡數(shù)量較多，黃體數(shù)量較少。另一方面，tempol處理減少了囊泡的數(shù)量，增加了黃體的形成(圖1C-E)。檢測了血清睪酮、eE2、LH、PRGE、FSH 5種性類固醇激素水平。DHEA + PBS組血清睪酮水平明顯高于oil+ PBS組。Tempol顯著降低PCOS大鼠血清睪酮和eE2水平，但對血清LH、PRGE、FSH水平無明顯影響(圖1F)。DHEA處理的大鼠血清膽汁酸水平顯著降低，但這種減弱在DHEA + tempol組消失了(圖1G)。在DHEA + PBS組大鼠卵巢中，cleaved caspase-3的表達(dá)增加，而在tempol作用下，cleaved caspase-3的表達(dá)減少(圖1H)。TUNEL染色顯示，tempol顯著降低DHEA處理大鼠的凋亡細(xì)胞比例(圖1I)。提示tempol可改善PCOS大鼠卵巢功能障礙及卵巢組織病理損傷。

圖1 Tempol減輕DHEA誘導(dǎo)的PCOS大鼠卵巢功能障礙和細(xì)胞凋亡

2. Tempol能中度改善DHEA誘導(dǎo)的PCOS大鼠的糖耐量

由于多囊卵巢綜合征與代謝紊亂密切相關(guān)，評估了不同組的胰島素敏感性和葡萄糖穩(wěn)態(tài)。DHEA + PBS組大鼠的空腹血糖水平雖然沒有明顯差異，但其空腹血清胰島素水平和HOMA-IR值均高于油+ PBS組。Tempol顯著降低了空腹胰島素水平，而對PCOS大鼠的空腹血糖水平和HOMA-IR值無顯著影響(圖2A-C)。OGTTs顯示PCOS大鼠葡萄糖清除延遲和曲線下面積增加，這表明DHEA處理降低了葡萄糖排泄能力。經(jīng)tempol治療后，糖耐量受損情況得到改善(圖2D)。ITTs證明，三組大鼠對胰島素的反應(yīng)相同(圖2E)。

圖2 Tempol對PCOS大鼠葡萄糖耐量和胰島素敏感性的影響 

3. Tempol可改善PCOS大鼠全身和腸道的氧化應(yīng)激

DHEA + PBS組大鼠血清MDA水平明顯高于油+ PBS組，血清T-AOC水平明顯低于oil+PBS組。給藥Tempol可顯著降低PCOS大鼠血清MDA水平，提高血清T-AOC水平(圖3A-B)。研究發(fā)現(xiàn)，DHEA聯(lián)合或不聯(lián)合tempol對血清3’-NT和AGEs水平均無影響(圖3C-D)。

作者測定卵巢中氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物的水平，PCOS大鼠卵巢MDA、3-NT、AGEs水平高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖3E-G)，PCOS大鼠卵巢T-AOC水平未見明顯下降(圖3H)；然而，這些大鼠的SOD活性降低(圖3I)。WB分析顯示，PCOS大鼠卵巢中SOD1表達(dá)下降，而SOD2表達(dá)未發(fā)生變化(圖3J)。Tempol對PCOS大鼠這些氧化應(yīng)激標(biāo)志物的水平?jīng)]有明顯影響，甚至進(jìn)一步降低了卵巢SOD活性(圖3E-I)，這表明Tempol對卵巢氧化應(yīng)激沒有直接影響。

由于腸道微生物群在多囊卵巢綜合征的起始和發(fā)展中起著重要作用，作者還研究DHEA和tempol是否影響腸道的氧化還原狀態(tài)。腸道MDA、3-NT和AGEs水平在PCOS大鼠中顯著高于對照組和氧化生物標(biāo)記的增加被tempol處理消除(圖3K-M)。此外，tempol顯著增加PCOS大鼠的腸道SOD1和SOD2表達(dá)(圖3N)。因此，這些結(jié)果表明tempol能夠降低PCOS大鼠的腸道氧化應(yīng)激。

圖3 Tempol對PCOS大鼠全身、卵巢和腸道氧化應(yīng)激的影響

4. Tempol減輕PCOS大鼠腸道微生物失調(diào)

隨后，通過rarefaction和Shannon曲線(Fig. 4A-B)，以及4個α-多樣性指數(shù)(ACE)、Shannon、Simpson和Chao1來評估細(xì)菌群落的豐度和多樣性。當(dāng)序列增加到2000時多個樣本稀疏曲線往往是平坦的，這表明測序數(shù)據(jù)的數(shù)量是合理的(圖4C-F)。在多個樣本Shannon曲線也觀察到類似的結(jié)果(圖4 g)，表明大多數(shù)樣本多樣性被測序覆蓋。有趣的是，rarefaction和Shannon曲線以及4個α-多樣性指數(shù)的結(jié)果在不同組間沒有差異(圖4A-F)，這表明DHEA處理或tempol干預(yù)對腸道微生物群α-多樣性沒有明顯影響。

其次，采用UPGMA、PCoA和NMDS評估不同群體的腸道菌群β-多樣性。UPGMA聚類方法將對照組和PCOS大鼠樣本分為兩組，表明PCOS大鼠和對照組的腸道微生物分布不同。雖然DHEA + tempol組不能完全與DHEA + PBS組分離，但與DHEA + PBS組有所不同，說明給藥tempol影響了PCOS大鼠的腸道微生物分布(圖4G)。PCoA和NMDS分析進(jìn)一步顯示，三組大鼠腸道總體微生物組成不同(圖4H-I)，而Permanova/ Anosim分析表明，三組間差異顯著(圖4J)。上述結(jié)果表明，DHEA和tempol處理可影響腸道微生物的β-多樣性。

圖4 Tempol對腸道微生物多樣性的影響

采用LEfSe方法分析經(jīng)DHEA和tempol處理后顯著改變的關(guān)鍵系統(tǒng)發(fā)育類型。Desulfovibrionaceae屬富集于oil+ PBS組，而Muribaculaceae 和Alloprevotella屬富集于DHEA+ PBS和DHEA+ tempol組 (圖5A-B)，這表明tempol可以重塑微生物PCOS大鼠的腸道微生物群的結(jié)構(gòu)。

通過分析細(xì)菌分類在門和屬水平上的相似性程度，進(jìn)一步比較三組腸道菌群的整體組成。在門水平上，厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)是3個類群的優(yōu)勢門(圖5)。DHEA處理增加了放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、Patescibacteria、軟毛桿菌門(Tenericutes)和Verrucomicrobia的豐度，減少了psilonbacteraeota和變形菌門(Proteobacteria)的數(shù)量。然而，在tempol干預(yù)下，放線菌門、Patescibacteria門、變形菌門和Tenericutes門的變化減弱了(圖5D)。在屬水平上，Lachnospiraceae_NK4A136_group和Multibaculaceae為優(yōu)勢屬(圖5E)。DHEA顯著提高了thaauera、葡萄球菌、Ideonella、棒狀桿菌和瘤胃球菌_2的豐度，降低了瘤胃球菌_1的豐度。這些變化被tempol處理抵消了(圖5F)。

圖5在門、屬水平上回腸微生物群落分類組成的變化

5. 腸道微生物群和循環(huán)代謝產(chǎn)物之間的聯(lián)系

采用非靶向代謝組學(xué)方法測量三組血清代謝產(chǎn)物，并研究腸道微生物組和宿主循環(huán)代謝產(chǎn)物之間的關(guān)系。主成分分析(PCA)顯示，三組間主要代謝成分差異顯著(圖6A)。OPLS-DA的監(jiān)督正交投影評分圖也顯示出PCOS大鼠與對照組、DHEA + PBS組與DHEA + tempol組之間的明顯區(qū)別(圖6B)。圖6C列出了三組52種血清代謝物(包括26種脂類及類脂分子)的相對豐度，說明PCOS大鼠大部分血清代謝物的豐度與對照組大鼠完全不同，說明DHEA治療對血清代謝有深遠(yuǎn)的影響。PCOS大鼠服用Tempol后，血清代謝產(chǎn)物的豐度也發(fā)生了顯著變化，引起28種血清代謝物豐度的變化在tempol作用下部分減弱(圖6C)。

圖6 Tempol影響血清代謝組學(xué)

隨后，通過進(jìn)行spearman分析，研究了所有三組循環(huán)代謝產(chǎn)物豐度與腸道微生物群之間的聯(lián)系，以測試33個屬與52個代謝產(chǎn)物之間的關(guān)聯(lián)，其中有11個代謝物與各屬均無顯著相關(guān)(圖7A)。其余甘油磷脂類只與一兩種屬相關(guān)，而多不飽和脂肪酸(8-HETE, 8,9 - DiHETrE, 20-羥基二十甲酸)與至少7個屬顯著相關(guān)。此外，血清水蘇糖與瘤胃球菌1或2之間的相關(guān)性表明，PCOS大鼠血清水蘇糖水平降低與瘤胃球菌1豐度降低和瘤胃球菌2豐度增加有關(guān)(圖7B-C)。當(dāng)tempol干預(yù)改變瘤胃球菌_1和_2的豐度時，PCOS大鼠血清水蘇糖水平升高。

圖7腸道微生物種類和循環(huán)代謝產(chǎn)物之間的聯(lián)系

6. 水蘇糖減輕DHEA誘導(dǎo)的多囊卵巢綜合征大鼠卵巢功能障礙

為了確定水蘇糖是否參與了Tempol對PCOS大鼠的有益作用，DHEA處理的大鼠給予200 mg/kg水蘇糖12天。水蘇糖給藥對體重沒有明顯影響(圖8A)，但改善了PCOS大鼠的動情周期紊亂(圖8B)。H&E染色表明，水蘇糖可減少卵巢囊泡數(shù)量，增加黃體形成(圖8C-E)。水蘇糖還可顯著降低PCOS大鼠血清睪酮水平的升高(圖8F)。上述結(jié)果提示水蘇糖確實(shí)改善了PCOS大鼠卵巢功能障礙，改善了卵巢組織病理損傷。

圖8水蘇糖改善DHEA誘導(dǎo)的多囊卵巢綜合征大鼠卵巢功能障礙

綜上所述，Tempol通過降低腸道氧化應(yīng)激、恢復(fù)腸道失調(diào)、調(diào)節(jié)腸道微生物和宿主代謝產(chǎn)物之間的相互作用來保護(hù)DHEA誘導(dǎo)的多囊卵巢綜合征(PCOS)(圖9)。這些結(jié)果表明Tempol是一種潛在的治療多囊卵巢綜合征的策略。

圖9改善糖耐量和多囊卵巢的潛在信號通路圖