細(xì)胞外囊泡蛋白分析用于監(jiān)測和預(yù)測轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療反應(yīng)

2021年5月，北京生物納米技術(shù)工程研究中心，國家納米科技中心，中國科學(xué)院大學(xué)未來技術(shù)學(xué)院，中國人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心乳腺癌科和中國人民解放軍總醫(yī)院第二醫(yī)學(xué)中心檢驗(yàn)科團(tuán)隊(duì)合作在Nature communications（IF=12.121） 雜志上發(fā)表了文章“Protein analysis of extracellular vesicles to monitor and predict therapeutic response in metastatic breast cancer”。此報(bào)道探索EV蛋白標(biāo)記物在MBC診斷、治療反應(yīng)監(jiān)測和使用TAS平臺(tái)的預(yù)后預(yù)測中的效用。設(shè)計(jì)了一種機(jī)器學(xué)習(xí)算法基于8個(gè)乳腺癌相關(guān)EV蛋白 marker的表達(dá)水平來識(shí)別EV signature。EV signature提供了較高的準(zhǔn)確性來區(qū)分MBC與非轉(zhuǎn)移性乳腺癌(NMBC)和健康供體(HD)，并在培訓(xùn)、驗(yàn)證和前瞻性隊(duì)列中監(jiān)測MBC治療反應(yīng)。EV signature也與接受治療的MBC患者的無進(jìn)展生存期(PFS)相關(guān)。

轉(zhuǎn)移性乳腺癌(MBC)是一種異質(zhì)性疾病，包括多個(gè)不同的亞型，仍然是世界范圍內(nèi)女性癌癥死亡的主要原因之一。對(duì)于MBC患者，實(shí)時(shí)監(jiān)測和預(yù)測治療反應(yīng)對(duì)于最佳個(gè)性化治療方案至關(guān)重要。雖然組織活檢已被用于MBC的診斷，但其侵襲性帶來了風(fēng)險(xiǎn)和發(fā)病率，患者在進(jìn)展時(shí)可能沒有足夠的組織可供4。計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)串行成像在監(jiān)測治療反應(yīng)時(shí)敏感性降低，不能用于預(yù)測疾病進(jìn)展。因此，迫切需要可靠的、無創(chuàng)的MBC診斷、監(jiān)測和預(yù)后工具。

通過以微創(chuàng)和可重復(fù)的方式分析循環(huán)腫瘤相關(guān)生物標(biāo)志物，血液檢測為MBC管理提供了一個(gè)有吸引力的替代方案。癌抗原15-3 (ca15 -3)是MBC監(jiān)測中最廣泛使用的血漿/血清生物標(biāo)志物，但其反應(yīng)僅在一半的患者中與疾病反應(yīng)相一致。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)和循環(huán)腫瘤DNA (ctDNA)的定量和遺傳特征與腫瘤負(fù)荷監(jiān)測的放射學(xué)測量具有良好的一致性，可預(yù)測MBC患者的疾病進(jìn)展和生存。然而，由于外周血中ctc和ctDNA的豐度較低，ctc和ctDNA的分析往往需要大的采樣量和復(fù)雜的方法才能達(dá)到滿意的靈敏度。

腫瘤來源的細(xì)胞外囊泡(EVs)最近作為一種重要的循環(huán)生物標(biāo)志物出現(xiàn)在癌癥診斷中。EVs結(jié)合蛋白已被證明在BC進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵過程中發(fā)揮重要作用，包括腫瘤血管化，靶向治療耐藥性，基質(zhì)重塑，免疫逃逸和轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成。因此，血液中EV蛋白標(biāo)記物的連續(xù)取樣可能有助于MBC的診斷和監(jiān)測，但仍有待臨床隊(duì)列研究的發(fā)現(xiàn)。

離心分離EV，缺乏超靈敏和特異性的檢測方法，不受非囊泡污染的干擾。為了直接應(yīng)對(duì)上述挑戰(zhàn)，我們之前開發(fā)了一種直接、敏感、經(jīng)濟(jì)有效的熱電泳適體傳感器(TAS)來測定癌癥患者血清EV的表面蛋白譜，而不需要預(yù)先分離EV。TAS的工作原理是依賴于大小依賴的熱電泳富集(103倍)適配體結(jié)合EV，產(chǎn)生放大的熒光信號(hào)，其強(qiáng)度指示EV表面蛋白的表達(dá)水平。應(yīng)用機(jī)器學(xué)習(xí)算法，定義了7種蛋白質(zhì)標(biāo)記物的EV簽名，用于6種不同癌癥類型的早期檢測和分類。

技術(shù)路線：

一、熱泳適體傳感器（Thermophoretic aptasensor ）用于EV蛋白標(biāo)記物的敏感分析

A-C. TAS平臺(tái)用于分析ev上的特異性蛋白，具有臨床可行性(圖1)。臨床血漿樣本(1 L，)與cy5偶聯(lián)的適配體孵育2小時(shí)，使適配體能夠與靶EV蛋白結(jié)合(補(bǔ)充表2和3)。使用適配體而不是抗體進(jìn)行蛋白檢測具有更高的熱穩(wěn)定性和成本效益。然后，將孵育后的樣品進(jìn)行10分鐘的局部激光加熱，以獲得大小相關(guān)的ev熱泳積累(模式尺寸約為100 nm)，以放大適體結(jié)合ev的熒光信號(hào)。

D. 小尺寸(幾納米大小)的可溶性蛋白不能被TAS積累和檢測，因?yàn)樗鼈兊哪蜔嵝暂^弱.

從ev衰竭血漿(樣本i)中發(fā)出的熒光信號(hào)很弱，與加入可溶性蛋白如ca15 -3 (25 U mL 1)、ca125 (35 U mL 1)或CEA (5 ng mL 1)(樣本ii)的ev衰竭血漿中的熒光信號(hào)相似。

相比之下，在樣品iii中觀察到熒光強(qiáng)度增加了4倍，該樣品iii是通過將來自未治療MBC患者(2 109 mL 1)的血漿ev注入樣品ii中制成的(圖1d)。

E.   TAS可以檢測EV蛋白標(biāo)記物，而不受可溶性對(duì)應(yīng)物的干擾。TAS對(duì)ev的檢出限為3.8 ×10⁷ mL ^-1 (LoD，高于空白值3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差)，是ELISA的10²倍。

F.   G. 通過測量不同BC細(xì)胞系(BT-474、SK-BR-3和MDA-MB- 231)和良性乳腺上皮細(xì)胞系(MCF-10A)上8種蛋白標(biāo)記物的表達(dá)水平來表征TAS的性能。不同細(xì)胞系ev的數(shù)量用NTA定量，實(shí)驗(yàn)中ev的數(shù)量相同(10¹⁰ mL ^-1).

二、乳腺癌患者的EV蛋白譜

A.   B. 在EV為基礎(chǔ)的癌癥診斷中，收集了36例MBC患者搶救治療前、21例NMBC患者手術(shù)治療前和66例年齡匹配的HD患者的123份血漿樣本。8種蛋白標(biāo)記物在血漿ev上的表達(dá)模式由TAS檢測。熱泳積累后，適體標(biāo)記EV的熒光圖像反映了MBC或NMBC患者的8種EV標(biāo)記物水平高于HD患者.

C.D MBC和NMBC患者EV蛋白標(biāo)記物表達(dá)均存在顯著異質(zhì)性。PrecisionRecall Curves (PRC)顯示，EV上的ca15 -3和EpCAM對(duì)BC和HD具有較高的區(qū)分能力.

E.F只有58.3%的MBC患者(21 / 36)和14.3%的NMBC患者(3 / 21)顯示血漿CA 15-3水平升高。此外，我們的數(shù)據(jù)顯示任何一對(duì)EV蛋白標(biāo)記物之間的相關(guān)性較弱(Pearson中值相關(guān)系數(shù)r = 0.31，圖2f)，以及EV上血漿ca15 -3和ca15 -3之間的相關(guān)性較弱(r = 0.29，圖2f)

三、建立EV^DX signature用于MBC診斷

為了提高EV在區(qū)分MBC、NMBC和HD組方面的性能，我們利用機(jī)器學(xué)習(xí)方法來編譯所有EV蛋白標(biāo)記物譜.

A.   B. EV^DX signature,  代表了通過線性判別分析(LDA, Supplementary Software)識(shí)別的 CA 15-3, CA 125, CEA, HER2, EGFR, PSMA, EpCAM, 和VEGF 信號(hào)。

C.EV^DX signature在三個(gè)類別上的總體準(zhǔn)確率為91.1%.

D.8個(gè)EV蛋白標(biāo)記的未加權(quán)和(sum)與EV^DX標(biāo)記相比，總體準(zhǔn)確性較低，為79.7% (95% CI = 71.5 86.4%)(補(bǔ)充表6 8)。分級(jí)聚類分析未發(fā)現(xiàn)MBC患者按轉(zhuǎn)移部位進(jìn)行分離(圖3d)。

E.   MBC肺轉(zhuǎn)移患者EVs中EGFR的表達(dá)較高.

F.   在MBC患者中，針對(duì)腫瘤大小的EV簽名顯示出與3到5個(gè)最大可測量病變的腫瘤大小之和有良好的相關(guān)性。在NMBC患者中，EVTS特征也與原發(fā)腫瘤大小相關(guān).

四、監(jiān)測MBC治療反應(yīng)的EV^M signature

評(píng)估了在治療14個(gè)周期后從MBC患者中收集的112份血漿樣本中EV蛋白譜監(jiān)測治療反應(yīng)的能力

A.   總結(jié)了部分緩解(PR, n = 18)、穩(wěn)定(SD, n = 17)和進(jìn)展(PD, n = 10)患者(RECIST, version 1.1) EV蛋白標(biāo)記物表達(dá)水平的相對(duì)變化(ΔIntensity) .

B.   C. EV^M signature 定義為 LDA對(duì)8個(gè)標(biāo)記ΔIntensity的加權(quán)和以及顯示的曲線下面積(AUC)為0.9429。通過受試者工作特征(ROC)分析區(qū)分PD和PR/SD的準(zhǔn)確性為88.9% (95% CI = 76.0 96.3%)。

C.   驗(yàn)證組包括患者血漿樣本MBC保持40%,維生素與簽名實(shí)現(xiàn)了AUC為0.9066

A-C.在35個(gè)血漿樣本的前瞻性隊(duì)列中，使用訓(xùn)練過的LDA模型生成的EVM簽名在PD (n = 7)和PR/SD (n = 20)之間的區(qū)分準(zhǔn)確率達(dá)到了85.2% (95% CI = 66.3 95.8%).

D-E.在培訓(xùn)、驗(yàn)證和前瞻性隊(duì)列中，當(dāng)應(yīng)用于不同的BC亞型時(shí)，EVM簽名在對(duì)治療反應(yīng)進(jìn)行分類方面表現(xiàn)出相似的性能(AUC = 0.9444，激素受體陽性(HR +)的95% CI = 0.8681 1.0000;人表皮生長因子受體2陽性(HER2 +)的AUC = 0.8674, 95% CI = 0.7307 1.0000;三陰性乳腺癌(TNBC)的AUC = 0.9026, 95% CI = 0.7662 1.0000.

五、MBC縱向監(jiān)測的EV^M signature

在縱向研究中，我們比較了EV^M特征和血漿ca15 -3在監(jiān)測至少有三個(gè)治療點(diǎn)的MBC患者對(duì)系統(tǒng)治療的反應(yīng)方面的表現(xiàn)。
在不同的BC亞型中，EVM特征比血漿ca15 -3能更好地捕捉腫瘤負(fù)荷的變化。

PR (P124)在0 ~ 2時(shí)EVM信號(hào)水平下降，而血漿ca15 -3濃度略有升高。對(duì)于HER2 + MBC患者(P112)和轉(zhuǎn)移性TNBC患者(P45)伴有PD的患者，EVM特征水平升高。

在PD發(fā)生時(shí)血漿ca15 -3濃度保持不變甚至下降。血漿CA 3和治療反應(yīng)之間的一致性為80%時(shí)觀察到的最大血漿CA 3水平高于閾值的兩倍(50 U mL ^-1)，而一致性下降到61.8%時(shí)最大血漿CA 3水平was< 50 U mL ^-1

六、EV^P信號(hào)用于預(yù)測MBC無進(jìn)展生存

研究人員對(duì)59例正在接受治療的MBC患者的EV蛋白譜預(yù)測臨床結(jié)果的性能進(jìn)行了研究

A. 在Kaplan Meier分析中(log-rank檢驗(yàn):P = 0.028)，高水平(中位數(shù)以上)的EVP特征(LDA對(duì)8個(gè)標(biāo)志物的基線強(qiáng)度加權(quán)和)與較差的無進(jìn)展生存期(PFS)顯著相關(guān)(圖7a)。EVP值較低時(shí)，中位無進(jìn)展生存期為475天。

B-I.血漿ca15 -3在同一隊(duì)列中沒有顯示預(yù)后價(jià)值(log-rank檢驗(yàn):P = 0.23;單因素Cox回歸:HR = 0.5, 95% CI = 0.2 1.6, P = 0.239;多因素Cox回歸:HR = 0.7, 95% CI = 0.2 2.5, P = 0.6176;補(bǔ)充圖6)。我們還注意到，最好的EV蛋白標(biāo)記物PSMA單獨(dú)與PFS相關(guān)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(log-rank檢驗(yàn):P = 0.015)，并作為PFS的獨(dú)立預(yù)測因子(單因素Cox回歸:HR = 4.0, 95% CI = 1.2 13.1, P = 0.0237;多因素Cox回歸:HR = 4.1, 95% CI = 1.2 14.1, P = 0.0277)。