細胞外囊泡蛋白分析用于監(jiān)測和預測轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療反應

2021年5月，北京生物納米技術工程研究中心，國家納米科技中心，中國科學院大學未來技術學院，中國人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心乳腺癌科和中國人民解放軍總醫(yī)院第二醫(yī)學中心檢驗科團隊合作在Nature communications（IF=12.121） 雜志上發(fā)表了文章“Protein analysis of extracellular vesicles to monitor and predict therapeutic response in metastatic breast cancer”。此報道探索EV蛋白標記物在MBC診斷、治療反應監(jiān)測和使用TAS平臺的預后預測中的效用。設計了一種機器學習算法基于8個乳腺癌相關EV蛋白 marker的表達水平來識別EV signature。EV signature提供了較高的準確性來區(qū)分MBC與非轉(zhuǎn)移性乳腺癌(NMBC)和健康供體(HD)，并在培訓、驗證和前瞻性隊列中監(jiān)測MBC治療反應。EV signature也與接受治療的MBC患者的無進展生存期(PFS)相關。

轉(zhuǎn)移性乳腺癌(MBC)是一種異質(zhì)性疾病，包括多個不同的亞型，仍然是世界范圍內(nèi)女性癌癥死亡的主要原因之一。對于MBC患者，實時監(jiān)測和預測治療反應對于最佳個性化治療方案至關重要。雖然組織活檢已被用于MBC的診斷，但其侵襲性帶來了風險和發(fā)病率，患者在進展時可能沒有足夠的組織可供4。計算機斷層掃描(CT)串行成像在監(jiān)測治療反應時敏感性降低，不能用于預測疾病進展。因此，迫切需要可靠的、無創(chuàng)的MBC診斷、監(jiān)測和預后工具。

通過以微創(chuàng)和可重復的方式分析循環(huán)腫瘤相關生物標志物，血液檢測為MBC管理提供了一個有吸引力的替代方案。癌抗原15-3 (ca15 -3)是MBC監(jiān)測中最廣泛使用的血漿/血清生物標志物，但其反應僅在一半的患者中與疾病反應相一致。循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)和循環(huán)腫瘤DNA (ctDNA)的定量和遺傳特征與腫瘤負荷監(jiān)測的放射學測量具有良好的一致性，可預測MBC患者的疾病進展和生存。然而，由于外周血中ctc和ctDNA的豐度較低，ctc和ctDNA的分析往往需要大的采樣量和復雜的方法才能達到滿意的靈敏度。

腫瘤來源的細胞外囊泡(EVs)最近作為一種重要的循環(huán)生物標志物出現(xiàn)在癌癥診斷中。EVs結(jié)合蛋白已被證明在BC進展和轉(zhuǎn)移的關鍵過程中發(fā)揮重要作用，包括腫瘤血管化，靶向治療耐藥性，基質(zhì)重塑，免疫逃逸和轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成。因此，血液中EV蛋白標記物的連續(xù)取樣可能有助于MBC的診斷和監(jiān)測，但仍有待臨床隊列研究的發(fā)現(xiàn)。

離心分離EV，缺乏超靈敏和特異性的檢測方法，不受非囊泡污染的干擾。為了直接應對上述挑戰(zhàn)，我們之前開發(fā)了一種直接、敏感、經(jīng)濟有效的熱電泳適體傳感器(TAS)來測定癌癥患者血清EV的表面蛋白譜，而不需要預先分離EV。TAS的工作原理是依賴于大小依賴的熱電泳富集(103倍)適配體結(jié)合EV，產(chǎn)生放大的熒光信號，其強度指示EV表面蛋白的表達水平。應用機器學習算法，定義了7種蛋白質(zhì)標記物的EV簽名，用于6種不同癌癥類型的早期檢測和分類。

技術路線：

一、熱泳適體傳感器（Thermophoretic aptasensor ）用于EV蛋白標記物的敏感分析

A-C. TAS平臺用于分析ev上的特異性蛋白，具有臨床可行性(圖1)。臨床血漿樣本(1 L，)與cy5偶聯(lián)的適配體孵育2小時，使適配體能夠與靶EV蛋白結(jié)合(補充表2和3)。使用適配體而不是抗體進行蛋白檢測具有更高的熱穩(wěn)定性和成本效益。然后，將孵育后的樣品進行10分鐘的局部激光加熱，以獲得大小相關的ev熱泳積累(模式尺寸約為100 nm)，以放大適體結(jié)合ev的熒光信號。

D. 小尺寸(幾納米大小)的可溶性蛋白不能被TAS積累和檢測，因為它們的耐熱性較弱.

從ev衰竭血漿(樣本i)中發(fā)出的熒光信號很弱，與加入可溶性蛋白如ca15 -3 (25 U mL 1)、ca125 (35 U mL 1)或CEA (5 ng mL 1)(樣本ii)的ev衰竭血漿中的熒光信號相似。

相比之下，在樣品iii中觀察到熒光強度增加了4倍，該樣品iii是通過將來自未治療MBC患者(2 109 mL 1)的血漿ev注入樣品ii中制成的(圖1d)。

E.   TAS可以檢測EV蛋白標記物，而不受可溶性對應物的干擾。TAS對ev的檢出限為3.8 ×10⁷ mL ^-1 (LoD，高于空白值3個標準偏差)，是ELISA的10²倍。

F.   G. 通過測量不同BC細胞系(BT-474、SK-BR-3和MDA-MB- 231)和良性乳腺上皮細胞系(MCF-10A)上8種蛋白標記物的表達水平來表征TAS的性能。不同細胞系ev的數(shù)量用NTA定量，實驗中ev的數(shù)量相同(10¹⁰ mL ^-1).

二、乳腺癌患者的EV蛋白譜

A.   B. 在EV為基礎的癌癥診斷中，收集了36例MBC患者搶救治療前、21例NMBC患者手術治療前和66例年齡匹配的HD患者的123份血漿樣本。8種蛋白標記物在血漿ev上的表達模式由TAS檢測。熱泳積累后，適體標記EV的熒光圖像反映了MBC或NMBC患者的8種EV標記物水平高于HD患者.

C.D MBC和NMBC患者EV蛋白標記物表達均存在顯著異質(zhì)性。PrecisionRecall Curves (PRC)顯示，EV上的ca15 -3和EpCAM對BC和HD具有較高的區(qū)分能力.

E.F只有58.3%的MBC患者(21 / 36)和14.3%的NMBC患者(3 / 21)顯示血漿CA 15-3水平升高。此外，我們的數(shù)據(jù)顯示任何一對EV蛋白標記物之間的相關性較弱(Pearson中值相關系數(shù)r = 0.31，圖2f)，以及EV上血漿ca15 -3和ca15 -3之間的相關性較弱(r = 0.29，圖2f)

三、建立EV^DX signature用于MBC診斷

為了提高EV在區(qū)分MBC、NMBC和HD組方面的性能，我們利用機器學習方法來編譯所有EV蛋白標記物譜.

A.   B. EV^DX signature,  代表了通過線性判別分析(LDA, Supplementary Software)識別的 CA 15-3, CA 125, CEA, HER2, EGFR, PSMA, EpCAM, 和VEGF 信號。

C.EV^DX signature在三個類別上的總體準確率為91.1%.

D.8個EV蛋白標記的未加權和(sum)與EV^DX標記相比，總體準確性較低，為79.7% (95% CI = 71.5 86.4%)(補充表6 8)。分級聚類分析未發(fā)現(xiàn)MBC患者按轉(zhuǎn)移部位進行分離(圖3d)。

E.   MBC肺轉(zhuǎn)移患者EVs中EGFR的表達較高.

F.   在MBC患者中，針對腫瘤大小的EV簽名顯示出與3到5個最大可測量病變的腫瘤大小之和有良好的相關性。在NMBC患者中，EVTS特征也與原發(fā)腫瘤大小相關.

四、監(jiān)測MBC治療反應的EV^M signature

評估了在治療14個周期后從MBC患者中收集的112份血漿樣本中EV蛋白譜監(jiān)測治療反應的能力

A.   總結(jié)了部分緩解(PR, n = 18)、穩(wěn)定(SD, n = 17)和進展(PD, n = 10)患者(RECIST, version 1.1) EV蛋白標記物表達水平的相對變化(ΔIntensity) .

B.   C. EV^M signature 定義為 LDA對8個標記ΔIntensity的加權和以及顯示的曲線下面積(AUC)為0.9429。通過受試者工作特征(ROC)分析區(qū)分PD和PR/SD的準確性為88.9% (95% CI = 76.0 96.3%)。

C.   驗證組包括患者血漿樣本MBC保持40%,維生素與簽名實現(xiàn)了AUC為0.9066

A-C.在35個血漿樣本的前瞻性隊列中，使用訓練過的LDA模型生成的EVM簽名在PD (n = 7)和PR/SD (n = 20)之間的區(qū)分準確率達到了85.2% (95% CI = 66.3 95.8%).

D-E.在培訓、驗證和前瞻性隊列中，當應用于不同的BC亞型時，EVM簽名在對治療反應進行分類方面表現(xiàn)出相似的性能(AUC = 0.9444，激素受體陽性(HR +)的95% CI = 0.8681 1.0000;人表皮生長因子受體2陽性(HER2 +)的AUC = 0.8674, 95% CI = 0.7307 1.0000;三陰性乳腺癌(TNBC)的AUC = 0.9026, 95% CI = 0.7662 1.0000.

五、MBC縱向監(jiān)測的EV^M signature

在縱向研究中，我們比較了EV^M特征和血漿ca15 -3在監(jiān)測至少有三個治療點的MBC患者對系統(tǒng)治療的反應方面的表現(xiàn)。
在不同的BC亞型中，EVM特征比血漿ca15 -3能更好地捕捉腫瘤負荷的變化。

PR (P124)在0 ~ 2時EVM信號水平下降，而血漿ca15 -3濃度略有升高。對于HER2 + MBC患者(P112)和轉(zhuǎn)移性TNBC患者(P45)伴有PD的患者，EVM特征水平升高。

在PD發(fā)生時血漿ca15 -3濃度保持不變甚至下降。血漿CA 3和治療反應之間的一致性為80%時觀察到的最大血漿CA 3水平高于閾值的兩倍(50 U mL ^-1)，而一致性下降到61.8%時最大血漿CA 3水平was< 50 U mL ^-1

六、EV^P信號用于預測MBC無進展生存

研究人員對59例正在接受治療的MBC患者的EV蛋白譜預測臨床結(jié)果的性能進行了研究

A. 在Kaplan Meier分析中(log-rank檢驗:P = 0.028)，高水平(中位數(shù)以上)的EVP特征(LDA對8個標志物的基線強度加權和)與較差的無進展生存期(PFS)顯著相關(圖7a)。EVP值較低時，中位無進展生存期為475天。

B-I.血漿ca15 -3在同一隊列中沒有顯示預后價值(log-rank檢驗:P = 0.23;單因素Cox回歸:HR = 0.5, 95% CI = 0.2 1.6, P = 0.239;多因素Cox回歸:HR = 0.7, 95% CI = 0.2 2.5, P = 0.6176;補充圖6)。我們還注意到，最好的EV蛋白標記物PSMA單獨與PFS相關，且具有統(tǒng)計學意義(log-rank檢驗:P = 0.015)，并作為PFS的獨立預測因子(單因素Cox回歸:HR = 4.0, 95% CI = 1.2 13.1, P = 0.0237;多因素Cox回歸:HR = 4.1, 95% CI = 1.2 14.1, P = 0.0277)。