circMAPK1編碼的一種新的蛋白MAPK1-109aa參與胃癌的進(jìn)展

circRNA是一種新型的非編碼RNA，已被報(bào)道通過多種機(jī)制參與疾病的發(fā)生和發(fā)展。MAPK通路是一種常見的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與細(xì)胞增殖、炎癥和凋亡，在癌癥中起著特別重要的作用。然而，與MAPK通路相關(guān)的circRNA在胃癌中的作用尚未被探索。因此，小編為大家?guī)硪黄?/span>2021年4月發(fā)表于影響因子為15.302的雜志Molecular Cancer上的文章“A novel protein encoded by circMAPK1 inhibits progression of gastric cancer by suppressing activation of MAPK signaling”。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)circMAPK1在胃癌組織中較鄰近正常組織表達(dá)下調(diào)。重要的是，較低的circMAPK1表達(dá)預(yù)示著GC患者較差的生存。CircMAPK1在體內(nèi)外均能抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲。接下來，我們發(fā)現(xiàn)circMAPK1編碼了一個長度為109個氨基酸的新蛋白。通過一系列功能實(shí)驗(yàn)，我們證實(shí)了circMAPK1通過編碼的蛋白MAPK1-109aa發(fā)揮了抑制腫瘤的作用。在機(jī)制上，腫瘤抑制因子MAPK1-109aa通過競爭性結(jié)合MEK1來抑制MAPK1的磷酸化，從而抑制MAPK1及其下游因子在MAPK通路中的激活。

技術(shù)路線

結(jié)果：

1）circMAPK1的鑒定和circMAPK1的臨床特征

由于MAPK信號通路在腫瘤發(fā)生和進(jìn)展中起著重要的病理作用，我們首先根據(jù)在線數(shù)據(jù)庫circBase中的circRNA測序數(shù)據(jù)分析了來自MAPK通路相關(guān)基因的circRNA。然后我們清點(diǎn)了MAPK 通路相關(guān)的circRNAs，發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞系可以表達(dá)數(shù)以百計(jì)的MAPK通路的circRNAs(圖1a)。在來源于MAPK1的circRNA中，circ-0006203、circ0004872和circ-0008870在超過三個獨(dú)立的測序數(shù)據(jù)集中被廣泛檢測。我們利用qRT-PCR檢測了這三種circRNA在胃癌患者的胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平(圖1b)。結(jié)果顯示circ-0004872的表達(dá)變化最為顯著。circ-0004872在癌組織/細(xì)胞中的reads明顯低于正常組織/細(xì)胞(圖1c)。此外，GSE121445和GSE100170數(shù)據(jù)庫中也證實(shí)了GC中circMAPK1的下調(diào)(圖1d)。這些數(shù)據(jù)提示circ-0004872具有潛在的抑制作用，從而促使我們進(jìn)一步研究其在胃癌惡性腫瘤中的作用。

Circ-0004872(本研究稱為““circMAPK1”)來自MAPK1基因的第2-4個外顯子，形成一個490 nt的重疊環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本(圖1e)。Sanger測序證實(shí)了擴(kuò)增的circMAPK1的頭尾剪接(圖1f)。接下來，我們研究了circMAPK1在GC細(xì)胞系中的表達(dá)水平。如圖1g所示，與正常的胃粘膜上皮細(xì)胞系相比，培養(yǎng)的GC細(xì)胞系中circMAPK1表達(dá)顯著下調(diào)。另外，circMAPK1僅從cDNA中擴(kuò)增，而不是從gDNA中擴(kuò)增(圖1h)，說明circMAPK1的環(huán)結(jié)構(gòu)是由back-splicing產(chǎn)生的。然后我們進(jìn)一步評估了circMAPK1的穩(wěn)定性和定位。經(jīng)過放線菌素D處理后，circMAPK1的半衰期明顯長于線性MAPK1(圖1i)。與MAPK1 mRNA的線性形式相比，circMAPK1對RNase R的降解具有抗性(圖1j)。隨后的細(xì)胞組分qRT-PCR分析(圖1k)和熒光原位雜交分析(圖1l)顯示，circMAPK1主要定位于細(xì)胞質(zhì)而不是細(xì)胞核。

由于circMAPK1在GC細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)，我們推測circMAPK1可能是一種適合GC診斷或預(yù)后的標(biāo)志物。qRT-PCR顯示circMAPK1在癌組織中的表達(dá)低于匹配的非癌組織(圖1m)。Kaplan-Meier生存分析顯示胃癌組織中circMAPK1水平較高的患者總生存期顯著延長(圖1n)。綜上所述，circMAPK1是一種穩(wěn)定表達(dá)的circRNA，可作為有效的診斷和預(yù)后標(biāo)志物，值得進(jìn)一步研究。

2）CircMAPK1在體外抑制GC細(xì)胞的增殖和遷移

為了研究circMAPK1在GC中的生物學(xué)功能，我們進(jìn)行了一系列細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。隨CCK8實(shí)驗(yàn)(圖2a)、集落形成實(shí)驗(yàn)(圖2b)和EdU實(shí)驗(yàn)(圖2c) 結(jié)果表明，沉默circMAPK1可顯著增強(qiáng)GC細(xì)胞的增殖能力。我們發(fā)現(xiàn)circMAPK1的減少增加了S期GC細(xì)胞的數(shù)量(圖2d)。Transwell(圖2e)試驗(yàn)顯示circMAPK1的干擾促進(jìn)了GC細(xì)胞的遷移。此外，過表達(dá)circMAPK1顯著削弱了GC細(xì)胞的增殖能力。同樣，過表達(dá)circMAPK1時，S期GC細(xì)胞的數(shù)量顯著減少，細(xì)胞遷移受到抑制。綜上所述，circMAPK1在GC細(xì)胞的增殖和遷移中起著重要作用。

3）CircMAPK1在體內(nèi)抑制胃癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移

為了進(jìn)一步證實(shí)體外研究結(jié)果，我們在體內(nèi)驗(yàn)證了circMAPK1在影響致瘤性方面的生物學(xué)作用。circMAPK1的沉默可顯著促進(jìn)腫瘤的生長。相比之下，過表達(dá)circMAPK1顯著抑制了皮下腫瘤的生長(圖3a)。接下來，我們通過對增殖細(xì)胞標(biāo)記物Ki67的染色來監(jiān)測異種移植瘤的增殖。穩(wěn)定敲除circMAPK1的腫瘤組織表現(xiàn)出更強(qiáng)的Ki67染色，而過表達(dá)circMAPK1的腫瘤組織表現(xiàn)出更弱的Ki67染色(圖3b和c)。為了研究circMAPK1在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移潛能，我們用熒光素酶質(zhì)粒穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染上述細(xì)胞系，然后注射到裸鼠的尾靜脈中。結(jié)果顯示，circMAPK1的敲低有效地增加了肺轉(zhuǎn)移病灶的數(shù)量和大小。相比之下，生物發(fā)光成像(圖3d和e)和H&E染色(圖3f和g)顯示，過表達(dá)circMAPK1減少了肺轉(zhuǎn)移病變。

4）CircMAPK1編碼109個氨基酸的新蛋白MAPK1-109aa

根據(jù)在線數(shù)據(jù)庫circRNADb的預(yù)測結(jié)果，circMAPK1序列中包含一個開放閱讀框，起始密碼子為ATG，IRES位于274-327 nt。這一觀察結(jié)果表明circMAPK1具有編碼109aa蛋白的潛能，本研究將其命名為MAPK1-109aa(圖4a)。為了驗(yàn)證預(yù)測的IRES在circMAPK1中的活性，我們進(jìn)行了雙熒光素酶檢測，結(jié)果顯示野生型IRES報(bào)告基因的熒光素酶活性明顯高于突變型IRES報(bào)告基因的熒光素酶活性(圖4b)。為了進(jìn)一步證實(shí)MAPK1-109aa的存在，我們將circMAPK1 IRES突變質(zhì)粒和circMAPK1過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HEK293T細(xì)胞。銀染色結(jié)果顯示，在分子量為13 kDa時存在明顯的蛋白帶，與MAPK-109aa的預(yù)測大小一致。MS檢測到AMEIMLNSKLCL序列，與MAPK1-109aa含有特定C端序列LCL的氨基酸序列一致(圖4c)。為了檢測該多肽產(chǎn)物，我們使用了一種識別MAPK1中間部分的抗體(圖4d)。Western Blot檢測40對胃癌組織(圖4e)和細(xì)胞系(圖4f)中MAPK1-109aa和MAPK1的水平。通過半定量分析，胃癌組織中MAPK1-109aa水平較正常胃組織中降低。Kaplan-Meier生存分析顯示，MAPK1-109aa表達(dá)水平較高的胃癌患者總生存期明顯長于MAPK1-109aa表達(dá)水平較低的胃癌患者(圖4h)。一系列GC細(xì)胞系中MAPK1-109aa的含量也明顯低于正常胃粘膜細(xì)胞系GES-1。在內(nèi)源性circMAPK1水平較低且?guī)缀鯖]有MAPK1-109aa表達(dá)的MKN45細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染circMAPK1和MAPK1-109aa質(zhì)粒均產(chǎn)生預(yù)測的MAPK1-109aa帶，而過表達(dá)circMAPK1 IRES突變質(zhì)粒則沒有產(chǎn)生預(yù)測的MAPK1-109aa帶(圖4i)。相反，在內(nèi)源性circMAPK1和MAPK1-109aa更高表達(dá)的GES-1細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)兩種特異性靶向circMAPK1連接的shRNA顯著降低了MAPK1-109aa的表達(dá)(圖4j)。使用anti-flag抗體進(jìn)行免疫熒光檢測，證實(shí)MAPK1-109aa-Flag位于過表達(dá)MAPK1-109aa-Flag質(zhì)粒的MKN45細(xì)胞的胞質(zhì)中，如圖4k所示。

5）MAPK1-109aa對胃癌有抑制作用

為了進(jìn)一步研究MAPK1-109aa的生物學(xué)功能，我們將circMAPK1 ATG突變質(zhì)粒、circMAPK1 IRES突變質(zhì)粒和circMAPK1過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到MKN45和BGC823細(xì)胞中。如預(yù)期的那樣，當(dāng)轉(zhuǎn)染ATG突變質(zhì)粒和IRES突變質(zhì)粒時，沒有出現(xiàn)circMAPK1編碼的MAPK1-109aa 13-kDa帶(圖5a)。CCK8實(shí)驗(yàn)(圖5b)、集落形成實(shí)驗(yàn)(圖5c，d)和EdU實(shí)驗(yàn)(圖5e，f)顯示過表達(dá)circMAPK1明顯抑制了細(xì)胞的增殖能力。流式細(xì)胞術(shù)顯示，處于S期的GC細(xì)胞數(shù)量也明顯減少(圖5g)。然而，當(dāng)circMAPK1的ATG或IRES序列發(fā)生突變時，MKN45和BGC823細(xì)胞的增殖能力沒有明顯變化。同樣，Transwell實(shí)驗(yàn)(圖5h)也證明了腫瘤細(xì)胞的遷移能力。綜上所述，circMAPK1在沒有其編碼蛋白MAPK1-109aa的情況下，不能抑制GC細(xì)胞的惡性表型。隨后，為了進(jìn)一步驗(yàn)證MAPK1-109aa的功能，我們在SGC7901和MGC803細(xì)胞中恢復(fù)了MAPK1-109aa的表達(dá)，無論是否穩(wěn)定敲除circMAPK1，Western blot驗(yàn)證了這一點(diǎn)(圖6a)。將MAPK1-109aa質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到SGC7901和MGC803細(xì)胞株后，細(xì)胞的增殖能力(圖6b-g)和遷移能力(圖6h)得到了有效的抑制。在轉(zhuǎn)染了shcirMAPK1的細(xì)胞系中，恢復(fù)了MAPK1-109aa的表達(dá)也逆轉(zhuǎn)了穩(wěn)定敲除circMAPK1所導(dǎo)致的惡性表型。綜上所述，上述結(jié)果表明circMAPK1對GC細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的抑制作用依賴于其編碼蛋白MAPK1-109aa。

6）MAPK1-109aa通過競爭性結(jié)合MEK1來抑制MAPK1的磷酸化

為了研究MAPK1-109aa抑制GC的分子機(jī)制，我們將標(biāo)記的MAPK1-109aa質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。在flag標(biāo)記的MAPK1-109aa免疫沉淀復(fù)合物中，潛在的相互作用蛋白被拉下(圖7a)。采用蛋白MS分析對差異表達(dá)蛋白進(jìn)行鑒定。在被識別的蛋白質(zhì)列表中，豐度最高的蛋白質(zhì)是MEK1，表明MEK1是MAPK1-109aa潛在的相互作用蛋白(圖7b，c)。此外，flag標(biāo)記的MAPK1-109aa可以與MEK1相互作用，證實(shí)了MAPK1-109aa與MEK1之間的直接相互作用(圖7d)。免疫熒光染色顯示MAPK1-109aa與MEK1共定位(圖7e)。此外，我們采用MEK1抗體免疫共沉淀，探討MAPK1-109aa對MAPK1通路的潛在調(diào)控作用。我們發(fā)現(xiàn)，在circMAPK1穩(wěn)定下調(diào)的SGC7901和MGC803細(xì)胞中，與對照組相比，MAPK1-109aa與MEK1的結(jié)合明顯減少，而MAPK1與MEK1的結(jié)合增加(圖7f)。在MKN45和BGC823細(xì)胞中，IRES突變時MAPK1-109aa不翻譯。因此，MAPK1與MEK1的結(jié)合沒有明顯變化。然而，過表達(dá)circMAPK1后，MAPK1與MEK1的結(jié)合顯著減少，而MAPK1-109aa與MEK1的結(jié)合顯著增加(圖7g)。因此，以上結(jié)果表明MAPK1-109aa與MAPK1競爭結(jié)合MEK1。隨后的Western blot結(jié)果也證實(shí)，在過表達(dá)circMAPK1的細(xì)胞系中，MAPK1-109aa顯著升高，磷酸化的MAPK1/2降低，而在circMAPK1敲低的細(xì)胞中則相反(圖7h)。此外，MAPK1的下游效應(yīng)因子，如p-ELK1、p-c-Fos、p-c-JUN和p-RSK，也被過表達(dá)的circMAPK1顯著抑制(圖7i)。這些結(jié)果表明，circMAPK1編碼的MAPK1-109aa通過抑制MAPK1信號通路發(fā)揮抑癌作用。

MAPK級聯(lián)是人類癌癥最重要的致癌驅(qū)動因子之一，通過靶向抑制劑阻斷這一信號通路是一種重要的抗腫瘤策略。因此，我們用MAPK通路抑制劑PD0325901處理SGC7901和MGC803細(xì)胞。Western blot顯示，PD0325901的加入顯著降低了MAPK1通路下游因子的激活。而添加PD0325901后，MAPK1-109aa的表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化(圖8a)。集落形成(圖8b，c)、EdU(圖8d，e)和Transwell實(shí)驗(yàn)(圖8f)結(jié)果表明PD0325901處理后細(xì)胞的增殖和遷移能力明顯受到抑制。此外，在抑制劑存在的情況下，將shcircRNA轉(zhuǎn)染到SGC7901和MGC803細(xì)胞中，目的是部分提高MAPK通路的活性。然而，當(dāng)細(xì)胞與PD0325901共同處理時，抑制circMAPK1沒有明顯的促癌作用(圖8b-f)。綜上所述，這些結(jié)果證實(shí)了MAPK1-109aa通過與MEK1競爭相互作用抑制MAPK1的磷酸化，通過抑制MAPK通路發(fā)揮腫瘤抑制作用。

結(jié)論

我們在胃癌中發(fā)現(xiàn)了一種來自MAPK1的下調(diào)circRNA。MAPK1-109aa由circMAPK1編碼，通過與MAPK1競爭與上游激酶MEK1結(jié)合發(fā)揮抗癌作用，抑制MAPK1磷酸化和下游致癌因子。我們的研究結(jié)果提示circMAPK1可能作為GC的治療靶點(diǎn)，也為MAPK通路激活引起的疾病提供了新的治療思路。