在乳腺癌中，INPP4B促進(jìn)pi3k α依賴的晚期核內(nèi)體形成和Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

磷酸肌醇3-激酶(PI3K)信號(hào)通路在癌癥中經(jīng)常過度激活。在胞外刺激下，I類PI3K在質(zhì)膜內(nèi)葉上轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PI(3,4,5)P3)，通過肌醇聚磷酸5-磷酸酶快速轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇3,4-二磷酸(PI(3,4)P2)。PI(3,4,5)P3和PI(3,4)P2共同增加了致癌PI3K信號(hào)的中樞效應(yīng)蛋白激酶AKT2,3的招募和激活。PI(3,4,5) P3/PI(3,4)P2信號(hào)通路激活質(zhì)膜上的許多其他效應(yīng)因子，包括蛋白激酶PDK1，該蛋白激酶進(jìn)而磷酸化AKT和其他AGC激酶，如SGK34。腫瘤抑制因子，磷酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)，將PI(3,4,5)P3轉(zhuǎn)化為PI(4,5)P2，從而抑制PI3K/AKT信號(hào)。II類肌醇多磷酸4-磷酸酶(INPP4B)可使I類PI3K下游的PI(3,4)P2去磷酸化，形成磷脂酰肌醇3-磷酸(PI(3)P)，也可抑制AKT信號(hào)，并被認(rèn)為在某些癌癥中起抑癌作用。

編碼PI3Kα p110α亞基的PIK3CA在多達(dá)40%的乳腺癌中發(fā)生突變，最常見的是雌激素受體陽性(ER+)腫瘤。突變的PIK3CA在校正ER陽性等有利風(fēng)險(xiǎn)變量時(shí)并不是預(yù)后的獨(dú)立標(biāo)記物，但它是改善晚期ER+乳腺癌內(nèi)分泌和PI3K聯(lián)合治療應(yīng)答的預(yù)測生物標(biāo)記物。有趣的是，與PTEN等其他PI3K通路改變的腫瘤相比，pikca突變ER+乳腺癌顯示出極少的AKT激活和對AKT信號(hào)的依賴。

NPP4B抑制AKT信號(hào)，并在三陰性(ER /PR /HER2)和基底樣乳腺癌中表現(xiàn)出腫瘤抑制活性。此外，INPP4B蛋白在黑色素瘤、卵巢癌和前列腺癌中表達(dá)減少。在小鼠模型中，Inpp4b消融與Tp53/Brca1缺失共同增加了乳腺腫瘤外顯率，并與Pten雜合子缺失共同促進(jìn)體內(nèi)甲狀腺腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。值得注意的是，INPP4B通過降解PI(3,4)P2，抑制早期核內(nèi)體的局部AKT2信號(hào)通路和EGFR降解。

最近的研究表明INPP4B可能在與化療耐藥性相關(guān)的急性髓系白血病(AML)中起致癌作用，以及在黑素瘤和結(jié)腸癌中起致癌作用。而且可能與環(huán)境有關(guān)。例如，在乳腺癌中，SGK3被擴(kuò)增，它的激酶活性依賴于致癌的PI3K和INPP4B。最近，INPP4B被確定為與ER+乳腺癌和腫瘤分級(jí)相關(guān)的頂級(jí)基因。

2021年5月，在Nature communications 雜志上發(fā)表了文章“INPP4B promotes PI3Kα-dependent late endosome  formation and Wnt/β-catenin signaling in breast  cancer”。此報(bào)道探討了INPP4B在ER+乳腺癌中的作用，揭示了一組pik3c突變ER+乳腺癌表現(xiàn)出INPP4B表達(dá)增加。盡管同時(shí)抑制AKT信號(hào)，但過表達(dá)INPP4B可以促進(jìn)pik3a突變ER+乳腺癌細(xì)胞系的增殖和腫瘤生長。為了研究這一明顯的悖論，使用了蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和先進(jìn)的細(xì)胞成像的綜合方法來闡明INPP4B促進(jìn)pik3a突變ER+乳腺癌發(fā)生的分子機(jī)制。結(jié)果顯示INPP4B刺激晚期核內(nèi)體上pi3k α依賴的信號(hào)樞紐，指導(dǎo)Wnt/β-catenin的激活。這些研究揭示了促進(jìn)細(xì)胞增殖和腫瘤生長的兩種致癌信號(hào)通路之間的串?dāng)_機(jī)制。

技術(shù)路線：

一、在pik3a突變的ER+乳腺癌中，INPP4B的表達(dá)增加

INPP4B被確定為人類乳腺癌er陽性標(biāo)記物.INPP4B在三陰性乳腺癌中表達(dá)缺失，然而，它作為其他癌癥中潛在的致癌基因的出現(xiàn)，促使我們檢測其在ER+乳腺癌中的相對表達(dá)和功能。INPP4B蛋白表達(dá)缺失與三陰性乳腺癌相關(guān)(圖1a, b) 增加INPP4B蛋白表達(dá)在14 40%的乳腺癌相對于正常組織與ER / PR-positivity和腔內(nèi)(ER +和/或PR+)乳腺癌亞型(圖1 a, b和補(bǔ)充圖1 b, c)。在mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)不能用于這些cohorts使用組織掃描乳腺癌cDNA陣列I IV (OriGene)檢測130例原發(fā)人類乳腺癌和16例正常乳腺組織的INPP4B mRNA表達(dá)(圖1c)。INPP4B表達(dá)降低與三陰性乳腺癌相關(guān)，而顯著增加的INPP4B表達(dá)在25%的乳腺癌中與ER/ propositivity和luminal亞型相關(guān)(圖1c, d和補(bǔ)充圖1d, e)。使用METABRIC和TCGA數(shù)據(jù)集，我們發(fā)現(xiàn)只有1%的乳腺癌表現(xiàn)出INPP4B基因改變，如突變、截?cái)?、擴(kuò)增或缺失。INPP4B mRNA表達(dá)與PTEN或AKT1突變無關(guān)，但與pik3a突變狀態(tài)正相關(guān)(圖1e和補(bǔ)充圖1f)。在PIK3CA多突變的乳腺癌中，INPP4B的表達(dá)也顯著升高(補(bǔ)充圖1g)。進(jìn)一步分層研究發(fā)現(xiàn)，INPP4B高表達(dá)與pik3c突變ER+乳腺癌亞型特異性相關(guān)(圖1f)。

二、INPP4B增強(qiáng)pik3a突變ER+乳腺癌和乳腺上皮細(xì)胞增殖

GFP-INPP4B在MCF-7和T47D ER+乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)，這兩種細(xì)胞分別有PIK3CAE545K和PIK3CAH1047R高活化突變.癌細(xì)胞進(jìn)行非錨定細(xì)胞生長的能力是細(xì)胞轉(zhuǎn)化的一個(gè)標(biāo)志。GFP-INPP4B顯著增加了軟瓊脂中MCF-7細(xì)胞集落大小(2.1倍)和T47D細(xì)胞集落大小(1.8倍)，但對集落數(shù)量沒有影響(圖2a-c)。與細(xì)胞增殖增加相一致。與載體對照相比，GFP-INPP4B在血清剝奪后增強(qiáng)了MCF-7細(xì)胞的增殖(1.7倍)(圖2d, e)，但不影響在含血清培養(yǎng)基中生長的MCF-7細(xì)胞的增殖。過表達(dá)GFPINPP4B的MCF-7細(xì)胞中，egf刺激的AKTS473和AKTT308磷酸化水平略有降低(圖2f-h)。表達(dá)MCF-10A腺泡的Myc-INPP4BWT而不是Myc-INPP4BC842A (PI (3,4)P2 4-磷酸酶死亡)的腺泡(補(bǔ)充圖2k)顯示增殖細(xì)胞的百分比明顯高于病媒控制的腺泡(1.5倍)(圖2i, j)。在第7天，腺泡的大小沒有明顯變化(圖2k)。第14天，Myc-INPP4BWT而不是MycINPP4BC842A表達(dá)MCF-10A的細(xì)胞形成了更大的腺泡(1.8倍)，每個(gè)腺泡的細(xì)胞數(shù)量比載體對照增加了1.4倍(圖2l n)。過表達(dá)INPP4B促進(jìn)MCF-10A細(xì)胞增殖，但不影響細(xì)胞的尖基底極性和細(xì)胞凋亡。與此一致的是，過表達(dá)Myc-INPP4BWT而不是Myc-INPP4BC842A在血清剝奪后的單層培養(yǎng)中增強(qiáng)了MCF-10A細(xì)胞的增殖(1.7倍)(圖2o, p)。

總之，這一數(shù)據(jù)與INPP4B以PI(3,4)P2 -磷酸酶依賴的方式促進(jìn)pik3a突變體ER+乳腺癌和pik3a野生型乳腺上皮細(xì)胞增殖的解釋相一致。

三、INPP4B促進(jìn)晚期核內(nèi)體上PI(3,4)P2到PI(3)P的轉(zhuǎn)化

使用了幾種基于無偏性蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)來表征INPP4B在pik3a突變ER+乳腺癌中的下游信號(hào)功能。首先，利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)進(jìn)行全細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究，確定GFP-INPP4B與gfp載體表達(dá)MCF-7細(xì)胞中蛋白水平的差異(2倍)。功能注釋分析顯示，inpp4b過表達(dá)細(xì)胞中上調(diào)的蛋白與內(nèi)溶酶體系統(tǒng)密切相關(guān)，內(nèi)溶酶體系統(tǒng)是介導(dǎo)細(xì)胞外受體和貨物內(nèi)化和降解的囊泡運(yùn)輸途徑(圖3a)。免疫沉淀質(zhì)譜(IP-MS)對受EGF刺激的MCF-7細(xì)胞進(jìn)行GFP-INPP4B蛋白復(fù)合物的分析，以激活I類PI3K信號(hào)。從該分析中鑒定出的最富集的結(jié)合伙伴是RAB7A (Rab7)，這是一種定位于晚期核內(nèi)體的小GTPase(圖3b)。GFP-INPP4B與內(nèi)源性Rab7的共免疫共沉淀證實(shí)了INPP4B與Rab7的結(jié)合(圖3c)。通過免疫電鏡進(jìn)一步分析INPP4B定位于晚期核內(nèi)體，結(jié)果顯示GFPINPP4B定位于晚期核內(nèi)體的限制膜和內(nèi)膜(圖3d)，之前的研究已經(jīng)確定了PI(3,4)P2和PI(3)P。在皂苷處理的MCF-7細(xì)胞中，觀察到內(nèi)源性INPP4B與HARab7WT或HA-Rab7Q67L共同定位于cd63陽性的晚期核內(nèi)體(圖3e)。HA-Rab7T22N是一個(gè)不定位于晚期核內(nèi)體的顯性陰性突變體(補(bǔ)充圖3f)，它的表達(dá)也阻止了內(nèi)源性INPP4B的募集(圖3e)，表明活性的gtp結(jié)合的Rab7是INPP4B亞細(xì)胞定位到晚期核內(nèi)體所必需的。 GFP-INPP4B顯著提高了細(xì)胞內(nèi)PI(3)P水平(1.8倍)(圖3f)，PI(3,4)P2也存在于早期和晚期核內(nèi)體。表達(dá)INPP4B shrna的MCF-7細(xì)胞顯示出更明顯的細(xì)胞內(nèi)PI(3,4)P2斑點(diǎn)，表明INPP4B缺失抑制PI(3,4)P2在核內(nèi)體上的降解，導(dǎo)致其積累(圖3g)。GFP-INPP4B沒有改變PI(3) p陽性早期核內(nèi)體的比例，但顯著增加了PI(3) p陽性晚期核內(nèi)體的比例(1.7倍)(圖3h, i)。

四、INPP4B促進(jìn)pi3k α依賴的晚期核內(nèi)體形成

五、阻斷atm依賴的磷酸化會(huì)損害DNA損傷后PTEN的亞細(xì)胞再分配

對MCF-7細(xì)胞內(nèi)溶酶體室的檢查顯示，GFP-INPP4B不影響eea1陽性的早期內(nèi)溶體，但顯著增加了cd63陽性的晚期內(nèi)溶體(2.5倍)和lamp1陽性的溶酶體(1.7倍)(圖4a, b)。

提示INPP4B促進(jìn)晚期內(nèi)吞體/溶酶體的形成。使用bsa -gold標(biāo)記MCF-7細(xì)胞內(nèi)溶酶體室，在電鏡下進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)分析。GFP-INPP4B增加了類似晚期核內(nèi)體的bsa陽性空泡結(jié)構(gòu)的數(shù)量(圖4c)。利用染料淬滅的BSA (BSA- dq)檢測了運(yùn)往溶酶體的貨物運(yùn)輸，BSA- dq通過液相內(nèi)吞進(jìn)入內(nèi)吞體，溶酶體水解酶隨后促進(jìn)去淬和激活熒光信號(hào)。GFP-INPP4B顯著增加了bsa - dq陽性結(jié)構(gòu)的數(shù)量(2倍)(圖4d, e)，表明INPP4B增強(qiáng)了內(nèi)吞貨物通過晚期內(nèi)吞體到溶酶體的運(yùn)輸。相比之下，使用泛I類PI3K抑制劑BKM120、PI3Kα特異性抑制劑BYL719(補(bǔ)充圖5f)或使用兩種不同的siRNAs耗盡PIK3CA抑制GFP-INPP4B細(xì)胞中晚期核內(nèi)體形成的增加(圖4f, g和補(bǔ)充圖5i, j)。通過在晚期核內(nèi)體上產(chǎn)生PI(3)P, INPP4B通過Hrs促進(jìn)晚期核內(nèi)體的形成。顯著的shrna介導(dǎo)的Hrs耗散(補(bǔ)充圖6a, b)導(dǎo)致gfp載體細(xì)胞中cd63陽性晚期核內(nèi)體減少，并將GFPINPP4B細(xì)胞中晚期核內(nèi)體形成增加的水平逆轉(zhuǎn)為gfp載體控制水平(圖5a, b)。在非錨定細(xì)胞生長試驗(yàn)中，耗用Hrs shRNA對gfp載體軟瓊脂集落的大小沒有影響，但減少了GFP-INPP4B細(xì)胞集落的大小，這與Hrs依賴的細(xì)胞增殖一致(圖5c, d)。將MCF-7細(xì)胞注射到雌性BALB/c裸小鼠腹股溝第四乳腺脂肪墊中，在體內(nèi)檢測腫瘤生長的hrs依賴性。與GFPvector相比，GFP-INPP4B在體內(nèi)腫瘤體積和體外腫瘤重量顯著增加(3倍)(圖5e g)。雖然敲除Hrs沒有影響gfp載體腫瘤的大小和重量，但GFP-INPP4B腫瘤的增強(qiáng)生長被減少Hrs抑制(圖5e g)，表明INPP4B促進(jìn)pik3a突變ER+乳腺癌細(xì)胞的增殖和腫瘤生長以hrsdependence的方式。

六、INPP4B通過增強(qiáng)GSK3β的溶酶體降解促進(jìn)pi3k依賴的Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

通過nanoString RNA譜分析，我們檢測了GFP-INPP4B和gfp載體表達(dá)MCF-7細(xì)胞中已知的癌癥通路，結(jié)果顯示幾種Wnt/β-catenin通路基因的表達(dá)發(fā)生了改變(圖6a)。定量RTPCR證實(shí)GFP-INPP4B-MCF-7細(xì)胞中Wnt/β-catenin靶基因AXIN2(1.8倍)、LEF1(5.6倍)、DKK1(3.3倍)和MYCN(2倍)的mRNA表達(dá)增加，表明Wnt/β-catenin信號(hào)通路增加(圖6b)。它結(jié)合TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)Wnt靶基因的轉(zhuǎn)錄。Wnt/β-catenin信號(hào)通路被Wnt3a和R-spondin處理激活，在這些條件下，與gfp載體對照相比，GFP-INPP4B細(xì)胞表現(xiàn)出AXIN2 mRNA表達(dá)和非磷酸化-β- catenins33 /S37/T41(活性-β-catenin)水平增加(圖6c, d)。此外，GFP-INPP4B的表達(dá)在基礎(chǔ)和wnt刺激條件下降低了GSK3β蛋白水平，與GSK3β的增強(qiáng)破壞一致(圖6d)。通過Hrs shRNA消耗抑制晚期核內(nèi)體形成后，降低的GSK3β蛋白水平得以恢復(fù)(圖6f, g)。GFP-INPP4B而不是gfp載體細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的GSK3β蛋白酶保護(hù)，這與GSK3β向晚期核內(nèi)體轉(zhuǎn)運(yùn)的增強(qiáng)相一致(圖6h)。免疫熒光證實(shí)了這一點(diǎn)，在GFP-INPP4B中觀察到RFP-GSK3與LysoTracker共定位，這是一種積累在晚期核內(nèi)體/溶酶體中的染料，而不是gfp載體細(xì)胞(圖6i)。

利用METABRIC數(shù)據(jù)集，我們評估了1459例ER+乳腺癌中17個(gè)常見Wnt/β-catenin通路基因的表達(dá)，包括幾個(gè)Wnt靶基因(圖7a)。為了確定INPP4B是否促進(jìn)PI3K和Wnt/β-catenin通路之間的對話，我們用增加劑量的PI3K抑制劑BKM120(0.5和1 M)處理gfp載體和GFPINPP4B MCF-7細(xì)胞，并測量Wnt靶基因AXIN2、LEF1和MYCN的mRNA表達(dá)(圖7b d)。在gfp載體細(xì)胞中，低劑量的BKM120對Wnt靶基因表達(dá)的影響最小，而高劑量的Wnt基因表達(dá)降低。在GFP-INPP4B表達(dá)細(xì)胞中，低濃度的BKM120部分挽救了Wnt基因表達(dá)的增加，在更高濃度時(shí)進(jìn)一步降低?？傊@些發(fā)現(xiàn)與INPP4B促進(jìn)Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而通過增強(qiáng)晚期核內(nèi)體形成促進(jìn)pik3a突變ER+乳腺癌細(xì)胞的增殖的解釋相一致(圖7e)。