神經(jīng)元中FTH的敲除抵消了褪黑素對創(chuàng)傷性腦損傷鐵死亡的保護作用

創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）是重要的健康問題，每年有超過5000萬新發(fā)TBI病例。在TBI的病理生理過程中，會發(fā)生各種形式的細胞死亡，包括細胞凋亡，壞死，程序性壞死，自噬，焦亡和鐵死亡。目前尚未充分挖掘TBI中鐵死亡的發(fā)病機理。今天我們講一篇蘇州大學(xué)團隊在JOURNAL OF PINEAL RESEARCH（IF=14.526）期刊發(fā)表的題名為Deletion of ferritin H in neurons counteracts the protective effect of melatonin against traumatic brain injury-induced ferroptosis的文獻。該文獻主要講述褪黑素通過FTH調(diào)節(jié)TBI中鐵死亡。

1. 褪黑素可減輕TBI引起的鐵死亡

為了確定褪黑素是否可以挽救TBI引起的鐵死亡，在相應(yīng)的高峰表達（例如1天和3天）進行了與鐵死亡相關(guān)蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析。發(fā)現(xiàn)褪黑素給藥在TBI后1天抑制了TBI誘導(dǎo)的xCT，Cox2，Tfr1，Fpn和Nox2蛋白表達的上調(diào)。同樣，褪黑素治療在TBI后3天阻止了Fth，Ftl和4HNE蛋白的表達。用促鐵蛋白抑制劑liproxstatin-1（Lip-1）也獲得了相似的結(jié)果。此外，免疫組化染色顯示，與對照組相比在TBI后第7天，褪黑素和Lip-1的處理減少了神經(jīng)元中4HNE陽性細胞的數(shù)量，表明褪黑素對TBI誘導(dǎo)的脂質(zhì)具有神經(jīng)保護作用過氧化。褪黑素和Lip-1均抑制TBI誘導(dǎo)的皮質(zhì)GSH水平降低。褪黑素和Lip-1抑制TBI誘導(dǎo)3天后損傷皮層中MDA含量的上調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明，TBI導(dǎo)致了與鐵死亡相關(guān)蛋白表達的時間變化，以及同側(cè)皮層中某些受推定的鐵死亡生物標志物的變化，但是用褪黑素有效地挽救了TBI誘導(dǎo)的鐵死亡。

2. 褪黑素可挽救TBI后皮層的鐵蓄積和神經(jīng)元損傷

為了進一步研究褪黑素在TBI后鐵蓄積和神經(jīng)元損傷中的假定作用，在TBI后第3天，在受傷的皮層中觀察到了Fe^{2 +}，Fe³⁺，總鐵含量顯著增加。而褪黑素或Lip-1抑制TBI誘導(dǎo)的血清和同側(cè)皮層中鐵含量的上調(diào)的。Perls的藍色染色表明，TBI后第7天鐵陽性細胞的數(shù)量顯著增加，褪黑素或Lip-1治療組的鐵陽性細胞少于對照組。鑒于TBI誘導(dǎo)的鐵超載伴隨著Fth表達的上調(diào)，使用免疫熒光染色觀察了TBI后神經(jīng)元中Fth的表達。發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組相比，模型組中Fth陽性神經(jīng)元的顯著增加，而褪黑素和Lip-1處理顯著降低了Fth陽性神經(jīng)元。與假手術(shù)組相比，受傷的神經(jīng)元的細胞體在TBI后7天出現(xiàn)胞質(zhì)萎縮或核固縮。褪黑素和Lip-1處理可減輕這些組織病理學(xué)變化。TBI后第7天， FJB染色測定腦部神經(jīng)元變性，發(fā)現(xiàn)TBI導(dǎo)致大腦皮層變性神經(jīng)元的數(shù)量增加，但是褪黑素和Lip-1給藥明顯減少了變性神經(jīng)元的數(shù)量。這些數(shù)據(jù)表明褪黑素可防止TBI誘導(dǎo)的鐵蓄積并防止同側(cè)皮質(zhì)的神經(jīng)元損傷。

3.  MT2受體可能參與褪黑素對TBI引起的鐵死亡的保護作用

為了闡明褪黑素的保護TBI作用是否依賴于褪黑素受體，首先確定了TBI后褪黑素受體（MT1和MT2）的表達模式。從12小時到14天觀察到皮質(zhì)MT1和MT2表達顯著降低。此外，褪黑素可在24小時顯著改善褪黑素治療的TBI小鼠大腦中MT1和MT2的損失。為了確定褪黑素的受體是否參與褪黑素對TBI引起的鐵死亡的保護作用，當用Luzindole（褪黑素受體拮抗劑）或4P-PDOT（一種選擇性MT2受體拮抗劑）預(yù)處理小鼠時，我們發(fā)現(xiàn)用Luzindole和4P-PDOT進行的預(yù)處理均消除了TBI后24小時褪黑素對MT1和Cox2表達的影響。值得注意的是，用4P-PDOT預(yù)處理消除了褪黑素對MT2表達和GSH含量的修復(fù)作用，以及褪黑素對xCT和4HNE的影響。本研究的數(shù)據(jù)表明，MT2受體是主要的褪黑素受體亞型，可能參與了褪黑素對TBI引起的鐵死亡的保護作用。

4. 褪黑素可減少TBI誘發(fā)的小鼠腦行為缺陷和病變體積

為了利用褪黑素對TBI誘導(dǎo)的神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)果和病變體積的影響，進行了行為分析以及HE染色。關(guān)于線握測試，與假手術(shù)組相比，TBI在第1-8天導(dǎo)致運動表現(xiàn)顯著下降，但與TBI組相比，褪黑素和Lip-1的治療改善了第2-6天的運動表現(xiàn)。在MWM測試中觀察到，與假手術(shù)組相比，TBI在第10-15天導(dǎo)致潛伏期延長，但是褪黑素和Lip-1治療的TBI小鼠均表現(xiàn)出比TBI小鼠明顯更短的逃避潛伏期。曠場試驗中，與假手術(shù)組相比，TBI組的動物的總距離、中心移動距離和花費時間明顯縮短。褪黑素治療可顯著逆轉(zhuǎn)上述參。HE染色顯示，褪黑素和Lip-1治療的TBI組在TBI后第16天的病變體積明顯小于TBI組。兩者合計，結(jié)果提供了褪黑素治療小鼠中TBI后改善運動，記憶和焦慮結(jié)局以及病變體積的證據(jù)。

5. 在基礎(chǔ)條件下，Fth -KO小鼠皮層中鐵穩(wěn)態(tài)輕度受損

使用蛋白質(zhì)印跡分析，實時PCR和Fth免疫熒光證實了在基礎(chǔ)條件下神經(jīng)元Fth表達的喪失。Fth- KO小鼠的FTH mRNA和蛋白表達較低。我們還通過免疫熒光觀察了Fth的神經(jīng)元水平。從他莫昔芬處理的皮層神經(jīng)元Fth- KO小鼠具有減少的免疫原性FTH的。重要的是，在神經(jīng)元中觀察到幾乎罕見FTH陽性細胞Fth- KO小鼠。有趣的是，神經(jīng)元中Fth的喪失并未導(dǎo)致Ftl表達的代償性增加。接下來，檢查了神經(jīng)元Fth在鐵代謝和氧化還原穩(wěn)態(tài)中的假定作用。Fth-KO組與對照組相比，皮質(zhì)Fe2 +，Fe3+，總鐵水平顯著增加。Perls的藍色染色顯示在生理條件下，在Fth- KO中觀察到的鐵陽性細胞相對較少。這些結(jié)果表明，Fth- KO小鼠具有活力和繁殖力，但鐵代謝發(fā)生了改變，這提供了神經(jīng)元鐵蛋白的鐵存儲功能在維持皮質(zhì)鐵穩(wěn)態(tài)基礎(chǔ)條件中起重要作用的證據(jù)。

6.  Fth -KO小鼠易患TBI引起的鐵死亡

為了進一步研究神經(jīng)元Fth在TBI誘導(dǎo)的鐵死亡中的作用，首先研究了神經(jīng)元Fth在TBI誘導(dǎo)的皮質(zhì)鐵超負荷中的作用。與對照小鼠相比，Fth- KO小鼠在TBI后受損皮層和血清中出現(xiàn)了更嚴重的鐵過載。Fth- KO小鼠的皮質(zhì)非血紅素鐵水平更高，并且Fth- KO小鼠Tfr1表達沒有明顯變化，而Fpn表達卻明顯降低。然后，在Fth- KO小鼠皮質(zhì)的SLC7A11 mRNA顯著增加和PTGS2 mRNA無顯著變化。WB分析顯示XCT的顯著增加。th-KO小鼠在第1天之后TBI在降低皮質(zhì)GSH水平F，相對于對照小鼠。發(fā)現(xiàn)TBI后3天，Fth-KO小鼠的皮質(zhì)MDA水平顯著增加。此外， TBI后Fth-KO小鼠受損皮層中4HNE陽性細胞數(shù)量增加，表明脂質(zhì)過氧化水平增加；在TBI后受傷側(cè)的KO小鼠中FJB陽性神經(jīng)元的數(shù)量顯著增加，表明Fth缺乏導(dǎo)致TBI后神經(jīng)元損傷加重。綜上所述，這些結(jié)果表明，由于Fth- KO小鼠對鐵蓄積的敏感性增加，因此更容易受TBI誘導(dǎo)的鐵死亡的影響，這提供了神經(jīng)元Fth喪失導(dǎo)致TBI誘導(dǎo)的鐵死亡的證據(jù)。

7. 在Fth- KO小鼠中， TBI后褪黑素對神經(jīng)的保護作用被大大取消

為了進一步探索神經(jīng)元Fth的喪失是否影響褪黑素對TBI誘導(dǎo)的鐵死亡的影響，測量了鐵死亡的幾種假定的生物標志物。發(fā)現(xiàn)治療KO小鼠上皮層非血紅素鐵的水平?jīng)]有影響。令人驚訝的是，盡管褪黑素治療的和未治療的Fth -KO小鼠的Tfr1 mRNA和蛋白表達水平?jīng)]有顯著差異，但是在褪黑素治療的小鼠中，觀察到Fpn mRNA和蛋白表達水平顯著增加Fth- KO小鼠。值得注意的是，與未治療的Fth- KO小鼠相比，用褪黑素治療Fth- KO小鼠未能顯著改變mRNA（Slc7a11，Ptgs2）和蛋白質(zhì)（xCT，Cox2、4HNE）的表達。另外，用褪黑素治療Fth- KO小鼠并沒有統(tǒng)計學(xué)上降低GSH和MDA以及4HNE的水平，和FJB陽性細胞的數(shù)目。這些結(jié)果表明褪黑素沒有統(tǒng)計學(xué)上減少TBI引起的鐵死亡和神經(jīng)元變性。

8. 褪黑素不能挽救Fth 敲低HT-22細胞中機械性損傷引起的鐵死亡

為了進一步證實褪黑素對Tth小鼠在Fth- KO小鼠中的上述作用，將HT-22細胞系用siRNA轉(zhuǎn)染，然后在體外進行機械刮擦損傷。siRNA敲低Fth可以降低Fth的蛋白質(zhì)水平。鑒于脂質(zhì)過氧化是鐵死亡的標志，使用DCF和BODIRY 581/591 C11作為評估了溶質(zhì)ROS。與對照組+刮擦損傷組相比，siFth +刮擦損傷組細胞的熒光強度顯著增加，表明siFth增強了HT-22細胞中機械刮擦損傷引起的ROS產(chǎn)生的上調(diào)。重要的是，與未經(jīng)治療的siFth組相比，用褪黑素處理siFth轉(zhuǎn)染的HT-22細胞未能顯著減少刮擦損傷后ROS的上調(diào)。另外，相對于對照組，在生理條件下，單獨使用siFth不能顯著增加ROS的產(chǎn)生。對鐵死亡的抗性與抑制BODIRY-C11氧化有關(guān)。與上述ROS結(jié)果一致。測量了鐵死亡的幾種推定生物標志物，包括xCT，Cox2和4HNE表達。如預(yù)期的那樣，與對照組+刮擦損傷組相比，在siFth轉(zhuǎn)染的HT-22細胞中，刮擦損傷的xCT表達顯著下降，而Cox-2和4HNE的表達顯著增加。重要的是，與未經(jīng)治療的siFth組相比，用褪黑素處理siFth轉(zhuǎn)染的HT-22細胞在刮傷后未能顯著改變xCT，Cox2和4HNE的表達。另外，在生理條件下，單獨的siFth與對照組之間上述蛋白質(zhì)的表達沒有顯著差異。這些結(jié)果表明，用siFth轉(zhuǎn)染的HT-22細胞易受機械性刮擦損傷誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化和鐵死亡的影響，而褪黑素在統(tǒng)計學(xué)上并未減輕損傷后的鐵死亡，并且siFth不會影響褪黑素受體的表達。