神經(jīng)元中FTH的敲除抵消了褪黑素對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷鐵死亡的保護(hù)作用

創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）是重要的健康問題，每年有超過5000萬新發(fā)TBI病例。在TBI的病理生理過程中，會(huì)發(fā)生各種形式的細(xì)胞死亡，包括細(xì)胞凋亡，壞死，程序性壞死，自噬，焦亡和鐵死亡。目前尚未充分挖掘TBI中鐵死亡的發(fā)病機(jī)理。今天我們講一篇蘇州大學(xué)團(tuán)隊(duì)在JOURNAL OF PINEAL RESEARCH（IF=14.526）期刊發(fā)表的題名為Deletion of ferritin H in neurons counteracts the protective effect of melatonin against traumatic brain injury-induced ferroptosis的文獻(xiàn)。該文獻(xiàn)主要講述褪黑素通過FTH調(diào)節(jié)TBI中鐵死亡。

1. 褪黑素可減輕TBI引起的鐵死亡

為了確定褪黑素是否可以挽救TBI引起的鐵死亡，在相應(yīng)的高峰表達(dá)（例如1天和3天）進(jìn)行了與鐵死亡相關(guān)蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析。發(fā)現(xiàn)褪黑素給藥在TBI后1天抑制了TBI誘導(dǎo)的xCT，Cox2，Tfr1，Fpn和Nox2蛋白表達(dá)的上調(diào)。同樣，褪黑素治療在TBI后3天阻止了Fth，Ftl和4HNE蛋白的表達(dá)。用促鐵蛋白抑制劑liproxstatin-1（Lip-1）也獲得了相似的結(jié)果。此外，免疫組化染色顯示，與對(duì)照組相比在TBI后第7天，褪黑素和Lip-1的處理減少了神經(jīng)元中4HNE陽性細(xì)胞的數(shù)量，表明褪黑素對(duì)TBI誘導(dǎo)的脂質(zhì)具有神經(jīng)保護(hù)作用過氧化。褪黑素和Lip-1均抑制TBI誘導(dǎo)的皮質(zhì)GSH水平降低。褪黑素和Lip-1抑制TBI誘導(dǎo)3天后損傷皮層中MDA含量的上調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明，TBI導(dǎo)致了與鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)的時(shí)間變化，以及同側(cè)皮層中某些受推定的鐵死亡生物標(biāo)志物的變化，但是用褪黑素有效地挽救了TBI誘導(dǎo)的鐵死亡。

2. 褪黑素可挽救TBI后皮層的鐵蓄積和神經(jīng)元損傷

為了進(jìn)一步研究褪黑素在TBI后鐵蓄積和神經(jīng)元損傷中的假定作用，在TBI后第3天，在受傷的皮層中觀察到了Fe^{2 +}，Fe³⁺，總鐵含量顯著增加。而褪黑素或Lip-1抑制TBI誘導(dǎo)的血清和同側(cè)皮層中鐵含量的上調(diào)的。Perls的藍(lán)色染色表明，TBI后第7天鐵陽性細(xì)胞的數(shù)量顯著增加，褪黑素或Lip-1治療組的鐵陽性細(xì)胞少于對(duì)照組。鑒于TBI誘導(dǎo)的鐵超載伴隨著Fth表達(dá)的上調(diào)，使用免疫熒光染色觀察了TBI后神經(jīng)元中Fth的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組相比，模型組中Fth陽性神經(jīng)元的顯著增加，而褪黑素和Lip-1處理顯著降低了Fth陽性神經(jīng)元。與假手術(shù)組相比，受傷的神經(jīng)元的細(xì)胞體在TBI后7天出現(xiàn)胞質(zhì)萎縮或核固縮。褪黑素和Lip-1處理可減輕這些組織病理學(xué)變化。TBI后第7天， FJB染色測(cè)定腦部神經(jīng)元變性，發(fā)現(xiàn)TBI導(dǎo)致大腦皮層變性神經(jīng)元的數(shù)量增加，但是褪黑素和Lip-1給藥明顯減少了變性神經(jīng)元的數(shù)量。這些數(shù)據(jù)表明褪黑素可防止TBI誘導(dǎo)的鐵蓄積并防止同側(cè)皮質(zhì)的神經(jīng)元損傷。

3.  MT2受體可能參與褪黑素對(duì)TBI引起的鐵死亡的保護(hù)作用

為了闡明褪黑素的保護(hù)TBI作用是否依賴于褪黑素受體，首先確定了TBI后褪黑素受體（MT1和MT2）的表達(dá)模式。從12小時(shí)到14天觀察到皮質(zhì)MT1和MT2表達(dá)顯著降低。此外，褪黑素可在24小時(shí)顯著改善褪黑素治療的TBI小鼠大腦中MT1和MT2的損失。為了確定褪黑素的受體是否參與褪黑素對(duì)TBI引起的鐵死亡的保護(hù)作用，當(dāng)用Luzindole（褪黑素受體拮抗劑）或4P-PDOT（一種選擇性MT2受體拮抗劑）預(yù)處理小鼠時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)用Luzindole和4P-PDOT進(jìn)行的預(yù)處理均消除了TBI后24小時(shí)褪黑素對(duì)MT1和Cox2表達(dá)的影響。值得注意的是，用4P-PDOT預(yù)處理消除了褪黑素對(duì)MT2表達(dá)和GSH含量的修復(fù)作用，以及褪黑素對(duì)xCT和4HNE的影響。本研究的數(shù)據(jù)表明，MT2受體是主要的褪黑素受體亞型，可能參與了褪黑素對(duì)TBI引起的鐵死亡的保護(hù)作用。

4. 褪黑素可減少TBI誘發(fā)的小鼠腦行為缺陷和病變體積

為了利用褪黑素對(duì)TBI誘導(dǎo)的神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)果和病變體積的影響，進(jìn)行了行為分析以及HE染色。關(guān)于線握測(cè)試，與假手術(shù)組相比，TBI在第1-8天導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)顯著下降，但與TBI組相比，褪黑素和Lip-1的治療改善了第2-6天的運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)。在MWM測(cè)試中觀察到，與假手術(shù)組相比，TBI在第10-15天導(dǎo)致潛伏期延長(zhǎng)，但是褪黑素和Lip-1治療的TBI小鼠均表現(xiàn)出比TBI小鼠明顯更短的逃避潛伏期。曠場(chǎng)試驗(yàn)中，與假手術(shù)組相比，TBI組的動(dòng)物的總距離、中心移動(dòng)距離和花費(fèi)時(shí)間明顯縮短。褪黑素治療可顯著逆轉(zhuǎn)上述參。HE染色顯示，褪黑素和Lip-1治療的TBI組在TBI后第16天的病變體積明顯小于TBI組。兩者合計(jì)，結(jié)果提供了褪黑素治療小鼠中TBI后改善運(yùn)動(dòng)，記憶和焦慮結(jié)局以及病變體積的證據(jù)。

5. 在基礎(chǔ)條件下，Fth -KO小鼠皮層中鐵穩(wěn)態(tài)輕度受損

使用蛋白質(zhì)印跡分析，實(shí)時(shí)PCR和Fth免疫熒光證實(shí)了在基礎(chǔ)條件下神經(jīng)元Fth表達(dá)的喪失。Fth- KO小鼠的FTH mRNA和蛋白表達(dá)較低。我們還通過免疫熒光觀察了Fth的神經(jīng)元水平。從他莫昔芬處理的皮層神經(jīng)元Fth- KO小鼠具有減少的免疫原性FTH的。重要的是，在神經(jīng)元中觀察到幾乎罕見FTH陽性細(xì)胞Fth- KO小鼠。有趣的是，神經(jīng)元中Fth的喪失并未導(dǎo)致Ftl表達(dá)的代償性增加。接下來，檢查了神經(jīng)元Fth在鐵代謝和氧化還原穩(wěn)態(tài)中的假定作用。Fth-KO組與對(duì)照組相比，皮質(zhì)Fe2 +，Fe3+，總鐵水平顯著增加。Perls的藍(lán)色染色顯示在生理?xiàng)l件下，在Fth- KO中觀察到的鐵陽性細(xì)胞相對(duì)較少。這些結(jié)果表明，Fth- KO小鼠具有活力和繁殖力，但鐵代謝發(fā)生了改變，這提供了神經(jīng)元鐵蛋白的鐵存儲(chǔ)功能在維持皮質(zhì)鐵穩(wěn)態(tài)基礎(chǔ)條件中起重要作用的證據(jù)。

6.  Fth -KO小鼠易患TBI引起的鐵死亡

為了進(jìn)一步研究神經(jīng)元Fth在TBI誘導(dǎo)的鐵死亡中的作用，首先研究了神經(jīng)元Fth在TBI誘導(dǎo)的皮質(zhì)鐵超負(fù)荷中的作用。與對(duì)照小鼠相比，Fth- KO小鼠在TBI后受損皮層和血清中出現(xiàn)了更嚴(yán)重的鐵過載。Fth- KO小鼠的皮質(zhì)非血紅素鐵水平更高，并且Fth- KO小鼠Tfr1表達(dá)沒有明顯變化，而Fpn表達(dá)卻明顯降低。然后，在Fth- KO小鼠皮質(zhì)的SLC7A11 mRNA顯著增加和PTGS2 mRNA無顯著變化。WB分析顯示XCT的顯著增加。th-KO小鼠在第1天之后TBI在降低皮質(zhì)GSH水平F，相對(duì)于對(duì)照小鼠。發(fā)現(xiàn)TBI后3天，Fth-KO小鼠的皮質(zhì)MDA水平顯著增加。此外， TBI后Fth-KO小鼠受損皮層中4HNE陽性細(xì)胞數(shù)量增加，表明脂質(zhì)過氧化水平增加；在TBI后受傷側(cè)的KO小鼠中FJB陽性神經(jīng)元的數(shù)量顯著增加，表明Fth缺乏導(dǎo)致TBI后神經(jīng)元損傷加重。綜上所述，這些結(jié)果表明，由于Fth- KO小鼠對(duì)鐵蓄積的敏感性增加，因此更容易受TBI誘導(dǎo)的鐵死亡的影響，這提供了神經(jīng)元Fth喪失導(dǎo)致TBI誘導(dǎo)的鐵死亡的證據(jù)。

7. 在Fth- KO小鼠中， TBI后褪黑素對(duì)神經(jīng)的保護(hù)作用被大大取消

為了進(jìn)一步探索神經(jīng)元Fth的喪失是否影響褪黑素對(duì)TBI誘導(dǎo)的鐵死亡的影響，測(cè)量了鐵死亡的幾種假定的生物標(biāo)志物。發(fā)現(xiàn)治療KO小鼠上皮層非血紅素鐵的水平?jīng)]有影響。令人驚訝的是，盡管褪黑素治療的和未治療的Fth -KO小鼠的Tfr1 mRNA和蛋白表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異，但是在褪黑素治療的小鼠中，觀察到Fpn mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著增加Fth- KO小鼠。值得注意的是，與未治療的Fth- KO小鼠相比，用褪黑素治療Fth- KO小鼠未能顯著改變mRNA（Slc7a11，Ptgs2）和蛋白質(zhì)（xCT，Cox2、4HNE）的表達(dá)。另外，用褪黑素治療Fth- KO小鼠并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上降低GSH和MDA以及4HNE的水平，和FJB陽性細(xì)胞的數(shù)目。這些結(jié)果表明褪黑素沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上減少TBI引起的鐵死亡和神經(jīng)元變性。

8. 褪黑素不能挽救Fth 敲低HT-22細(xì)胞中機(jī)械性損傷引起的鐵死亡

為了進(jìn)一步證實(shí)褪黑素對(duì)Tth小鼠在Fth- KO小鼠中的上述作用，將HT-22細(xì)胞系用siRNA轉(zhuǎn)染，然后在體外進(jìn)行機(jī)械刮擦損傷。siRNA敲低Fth可以降低Fth的蛋白質(zhì)水平。鑒于脂質(zhì)過氧化是鐵死亡的標(biāo)志，使用DCF和BODIRY 581/591 C11作為評(píng)估了溶質(zhì)ROS。與對(duì)照組+刮擦損傷組相比，siFth +刮擦損傷組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度顯著增加，表明siFth增強(qiáng)了HT-22細(xì)胞中機(jī)械刮擦損傷引起的ROS產(chǎn)生的上調(diào)。重要的是，與未經(jīng)治療的siFth組相比，用褪黑素處理siFth轉(zhuǎn)染的HT-22細(xì)胞未能顯著減少刮擦損傷后ROS的上調(diào)。另外，相對(duì)于對(duì)照組，在生理?xiàng)l件下，單獨(dú)使用siFth不能顯著增加ROS的產(chǎn)生。對(duì)鐵死亡的抗性與抑制BODIRY-C11氧化有關(guān)。與上述ROS結(jié)果一致。測(cè)量了鐵死亡的幾種推定生物標(biāo)志物，包括xCT，Cox2和4HNE表達(dá)。如預(yù)期的那樣，與對(duì)照組+刮擦損傷組相比，在siFth轉(zhuǎn)染的HT-22細(xì)胞中，刮擦損傷的xCT表達(dá)顯著下降，而Cox-2和4HNE的表達(dá)顯著增加。重要的是，與未經(jīng)治療的siFth組相比，用褪黑素處理siFth轉(zhuǎn)染的HT-22細(xì)胞在刮傷后未能顯著改變xCT，Cox2和4HNE的表達(dá)。另外，在生理?xiàng)l件下，單獨(dú)的siFth與對(duì)照組之間上述蛋白質(zhì)的表達(dá)沒有顯著差異。這些結(jié)果表明，用siFth轉(zhuǎn)染的HT-22細(xì)胞易受機(jī)械性刮擦損傷誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化和鐵死亡的影響，而褪黑素在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并未減輕損傷后的鐵死亡，并且siFth不會(huì)影響褪黑素受體的表達(dá)。