circPDE4B-關(guān)節(jié)炎的靶點

  circRNAs已經(jīng)成為重要的生物調(diào)節(jié)因子。小編今天給大家?guī)?/span>2021年5月發(fā)表于影響因子為16.102的Ann Rheum Dis雜志上題為"circPDE4B prevents articular cartilage degeneration and promotes repair by acting as a scaffold for RIC8A and MID1"的文章。在本研究中，作者旨在闡明circPDE4B的作用，據(jù)報道，該circRNAs在骨關(guān)節(jié)炎(OA)組織中下調(diào)。我們體外研究了circPDE4B在人和小鼠軟骨細(xì)胞中的作用。通過RNA下拉-質(zhì)譜分析、免疫共沉淀、谷胱甘肽- S-轉(zhuǎn)移酶下拉、RNA免疫共沉淀，驗證了circPDE4B與RIC8A)/ MID1復(fù)合物的相互作用。采用小鼠OA模型證實了circPDE4B在體內(nèi)OA發(fā)病機(jī)制中的作用。本研究強(qiáng)調(diào)了circPDE4B-RIC8A軸在OA關(guān)節(jié)中的功能及其對MAPK-p38的調(diào)控，提示這一軸可能是OA的治療靶點。

 技術(shù)路線

結(jié)果

1）circPDE4B在OA組織中表達(dá)較低

我們之前對3個臨床OA和3個對照樣本的軟骨細(xì)胞核糖體RNA缺失的總RNA進(jìn)行了RNA-seq分析。在數(shù)量最多的50個顯著調(diào)控異常的circRNA中，circPDE4B的表達(dá)水平排名第一。我們評估了每個病例的OA嚴(yán)重程度(圖1A)。同時，我們進(jìn)行了組織形態(tài)學(xué)和熒光原位雜交實驗，結(jié)果顯示軟骨降解程度增加對應(yīng)軟骨細(xì)胞中circPDE4B的表達(dá)降低(圖1B)。RT- qPCR檢測到嚴(yán)重OA組織軟骨細(xì)胞中circPDE4B RNA水平下調(diào)，而mPDE4B mRNA水平保持相對一致(圖1C)。綜上所述，circPDE4B的表達(dá)與OA的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。

考慮到circPDE4B在人和小鼠之間是保守的，我們也檢測了circPDE4B在人/小鼠軟骨細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)IL-1β和TNF-α處理顯著降低了HCs（人）/MCs（鼠）中circPDE4的表達(dá)，且呈時間依賴性(圖1D)。核分離實驗結(jié)合RT- qPCR分析和FISH分析發(fā)現(xiàn)，circPDE4B/circPde4b主要位于HCs/MCs的細(xì)胞質(zhì)中(圖1E、F)。綜上所述，circPDE4B在OA中被下調(diào)，因此可能參與了OA的進(jìn)展。

我們接下來試圖識別circPDE4B上游調(diào)節(jié)器。我們首先對circPDE4B側(cè)翼序列進(jìn)行RNA pull-down-MS檢測，發(fā)現(xiàn)兩個與RNA剪接相關(guān)的RBP，包括DExH-box helicase 9和FUS(圖1G)。RT-qPCR結(jié)果顯示，FUS敲除后，HCs中circPDE4B表達(dá)下調(diào)，而pPDE4B和mPDE4B沒有明顯變化(圖1H)。此外，感染兩種FUS shRNA慢病毒只降低了circPDE4B的表達(dá)(圖1I)，而過表達(dá)FUS則上調(diào)了circPDE4B的表達(dá)(圖1I)。接下來，RIP分析顯示FUS與外顯子相鄰的位點結(jié)合，而其他遠(yuǎn)端位點則可以忽略(圖1J，K)。我們還尋找了可能的FUS響應(yīng)元素，發(fā)現(xiàn)了兩個可能的motifs，A位于上游，B位于下游。我們進(jìn)一步設(shè)計了兩個短的circPDE4B微基因，包括circPDE4B-s和circPDE4B-s-del(圖1L)。RIP顯示FUS與circPDE4B-s之間存在明顯的相互作用，但與circPDE4B-s-del之間沒有相互作用(圖1M)，表明FUS需要周圍內(nèi)含子中的假定位點來結(jié)合。我們接下來在表達(dá)circPDE4B-s/del的HCs中敲除FUS，發(fā)現(xiàn)與circPDE4B-del相比，circPDE4B-s顯著減少了FUS敲除的circPDE4B轉(zhuǎn)錄本(圖1N)。值得注意的是，在HCs中FUS被TNF-α下調(diào)(圖1O)。綜上所述，在OA中circPDE4B的下調(diào)至少部分是由FUS的抑制引起的。

2）circPDE4B調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞活力和ECM代謝

為了評估circPDE4B在ECM代謝中的作用，我們分別用三種circPDE4B siRNA轉(zhuǎn)染HCs(圖2A)。我們使用CCK-8方法評估了circPDE4B對軟骨細(xì)胞活力的影響。結(jié)果顯示，敲低circPDE4B的表達(dá)降低了軟骨細(xì)胞的活力(圖2B)。此外，shRNA腺病毒抑制circPDE4B顯著提高了MMP3、MMP13和ADAMTS4的表達(dá)，而SOX9、COL2A1(或COL2蛋白)和aggrecan在HCs/MCs中的表達(dá)下調(diào)(圖2C和圖2D)。免疫熒光進(jìn)一步證實，circPDE4B敲除影響了HCs/MCs的MMP3、MMP13、COL2和aggrecan水平(圖2E、F)。同時，HCs的阿爾新藍(lán)染色顯示，circPDE4B抑制導(dǎo)致軟骨細(xì)胞功能障礙，蛋白多糖藍(lán)染較少(圖2G)。然后通過CCK-8實驗(圖2H)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)circPDE4B增加了軟骨細(xì)胞的活力。在過表達(dá)circPDE4B -HCs中，MMP3、MMP13和ADAMTS4的mRNA和蛋白水平下調(diào)，SOX9、COL2A1(或COL2蛋白)和aggrecan的mRNA和蛋白水平上調(diào)(圖2I-L)。此外，HCs的阿爾新藍(lán)染色表明，與單獨IL-1β治療相比，circPDE4B過表達(dá)和IL-1β共處理減少了軟骨破壞(圖2M)。這些數(shù)據(jù)表明，circPDE4B/ circPde4b在HCs中可以促進(jìn)細(xì)胞活力，抑制分解代謝作用。

3）RIC8A與circPDE4B相互作用，參與OA

為了鑒別與circPDE4B相互作用的蛋白，我們采用RPD-MS(圖3A)，共鑒定出112個與circPDE4B相互作用的蛋白(圖3B)，確定了RIC8A。HCs中的RNA-蛋白共定位也證實了RIC8A和circPDE4B之間的相互作用(圖3C)。RPD實驗表明，體外線性轉(zhuǎn)錄的circPDE4B能夠拉下重組RIC8A(圖3D)。然后，我們使用catRAPID工具預(yù)測circPDE4B和RIC8A的相互作用區(qū)域(圖3E)。為了識別預(yù)測的結(jié)合位點，我們將FL circPDE4B截短為3個片段。根據(jù)預(yù)測，RIP結(jié)果顯示只有FL和S3被RIC8A拉下(圖3F)。有綜合來看，這些結(jié)果表明circPDE4B在HCs中與RIC8A相互作用。我們進(jìn)一步的研究表明，circPDE4B調(diào)控RIC8A蛋白水平，而不是mRNA水平或穩(wěn)定性(圖3G-I)。我們還阻斷了RIC8A蛋白的合成，并觀察到sh-陰性對照(NC)和sh-circPDE4B 的HCs之間的RIC8A蛋白半衰期有明顯差異(圖3J)，說明circPDE4B降低了RIC8A蛋白的穩(wěn)定性。經(jīng)PS341處理后，RIC8A在circPDE4B過表達(dá)和下調(diào)細(xì)胞中均未發(fā)生變化(圖3K,L)，表明circPDE4B通過蛋白酶體活性調(diào)節(jié)RIC8A。無論內(nèi)源性還是外源性RIC8A, RIC8A的多泛素化在circPDE4B耗盡后均下降，在過表達(dá)circPDE4B后則上升(圖3O)。綜上所述，circPDE4B翻譯后影響蛋白酶體介導(dǎo)的RIC8A的降解和周轉(zhuǎn)。

4）circPDE4B促進(jìn)了RIC8A和MID1之間的三元配合物的形成，促進(jìn)了RIC8A的降解

我們試圖鑒定參與RIC8A蛋白酶體降解的E3連接酶。有趣的是，MS結(jié)果顯示circPDE4B也結(jié)合了兩個E3連接酶，包括RNF2和MID1。然而，由于RNF2定位于細(xì)胞核內(nèi)，我們選擇MID1進(jìn)行進(jìn)一步研究。實際上，通過免疫沉淀分析，MID1被發(fā)現(xiàn)與RIC8A結(jié)合(圖4A)。RIC8A和MID1的免疫熒光染色也證實了它們在HCs中共定位(圖4B)。IP結(jié)果表明，MID1敲低有效地削弱了RIC8A和MID1過表達(dá)的泛素化作用，增加了RIC8A泛素化作用(圖4C)。Co- IP實驗也顯示，與對照組相比，circPDE4B敲低細(xì)胞中RIC8A和MID1的結(jié)合減少，而過表達(dá)circPDE4B則有相反的作用(圖4D)。此外，circPDE4B不影響MID1水平(圖4E)。RPD和序列IP分析都顯示circPDE4B促進(jìn)了RIC8A和MID1的結(jié)合(圖4F，G)。與這一發(fā)現(xiàn)相一致的是，體外結(jié)合試驗表明，circPDE4B增加了重組RIC8A和MID1蛋白之間的關(guān)聯(lián)(圖4H)。通過co-IP，MID1與RIC8A在N端調(diào)控域結(jié)合(圖4I)。此外，我們檢測了RIC8A的功能位點。在HCs中免疫沉淀RIC8A并進(jìn)行MS分析，證實了RIC8A中氨基酸殘基的泛素化(圖4J)。在RIC8A、K143和K187中鑒定出10個泛素化位點，并且在人類和小鼠之間并不保守(圖4J)。因此，我們將保守的RIC8A位點從賴氨酸(K)突變?yōu)榫彼?/span>(R)，以排除泛素化。IP結(jié)果表明，與WT相比，K415的取代大大降低了RIC8A的泛素化位點(圖4K)。有趣的是，K415在哺乳動物中高度保守(圖4L，M)。此外，在K415突變后，circPDE4B過表達(dá)或抑制不再調(diào)節(jié)RIC8A的泛素化水平(圖4N)。這些結(jié)果表明circPDE4B可以作為促進(jìn)RIC8A和MID1之間聯(lián)系的支架。

5）circPDE4B和RIC8A調(diào)控軟骨細(xì)胞中的p38信號通路

為了闡明RIC8A下游的信號通路，我們研究了RIC8A敲低的HCs中MAPKs、NF-κ B和mTOR的磷酸化水平。兩種RIC8A shRNA顯著降低了p38的磷酸化水平(圖5A)。然后用信號分子抑制劑對HCs進(jìn)行預(yù)處理，包括ERK1/2抑制劑、p38抑制劑和JNK抑制劑，然后是RIC8A過表達(dá)。經(jīng)過p38 MAPK抑制劑預(yù)處理的RIC8A過表達(dá)抑制了OA，然而，ERK或JNK抑制劑對其沒有影響(圖5B)。此外，感染RIC8A shRNA或過表達(dá)腺病毒后，p38 MAPK的磷酸化及其定位發(fā)生了異常調(diào)節(jié)(圖5C-E)。這些結(jié)果表明，RIC8A在軟骨細(xì)胞中通過p38信號通路發(fā)揮作用。接下來我們研究了circPDE4B在OA中調(diào)控p38信號通路中的作用。circPDE4B過表達(dá)降低，而circPDE4B敲低激活p38 MAPK信號，同時p38磷酸化和核轉(zhuǎn)位(圖5F-H)。然后我們進(jìn)行了拯救試驗。如圖5I-K所示，RIC8A過表達(dá)挽救了過表達(dá)circPDE4B誘導(dǎo)的p38信號通路的下調(diào)，而抑制RIC8A挽救了敲除circPDE4B誘導(dǎo)的p38信號通路的激活，以及p38的磷酸化和核易位?；谶@些發(fā)現(xiàn)，circPDE4B-RIC8A軸在調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞下游p38 MAPK信號通路中發(fā)揮重要作用。

6）circPde4b和RIC8A影響小鼠OA發(fā)病機(jī)制

為了證實上述發(fā)現(xiàn)，我們進(jìn)一步評估了circPde4b對小鼠OA的影響。圖6A為四組不同AAV感染后circPde4b和RIC8A的RNA表達(dá)情況。從軟骨中提取的ECM相關(guān)蛋白的RT-qPCR和western blot分析也提示在內(nèi)側(cè)半月板不穩(wěn)(DMM)+vector組和DMM+ circPde4b+RIC8A組中OA更嚴(yán)重(圖6B，C)。Safranin O fast green染色(圖6D)發(fā)現(xiàn)，與SHAM+載體組和DMM+circPde4b+RIC8A組相比，DMM+載體組和DMM+circPde4b+RIC8A組的蛋白多糖明顯丟失，表明circPde4b AAV可以挽救由DMM引起的OA進(jìn)展，而RIC8A AAV可以逆轉(zhuǎn)這種挽救。OARSI分級(圖6E)進(jìn)一步提示小鼠SHAM+載體和DMM+circPde4b組軟骨降解較少，而DMM+載體和DMM+circPde4b+RIC8A組軟骨降解情況相反。熱板試驗、膝關(guān)節(jié)伸展試驗和電擊刺激跑步機(jī)試驗顯示，DMM+載體組和DMM+circPde4b+RIC8A組的不適和膝關(guān)節(jié)疼痛多于SHAM+載體組和DMM+circPde4b組(圖6F)。小鼠膝關(guān)節(jié)的三維微CT重建顯示，DMM+NC組和DMM+circPde4b+RIC8A組比SHAM+載體和DMM+circPde4b組有更多的骨贅(圖6G)。此外，四組中RIC8A和p-p38標(biāo)記的免疫組化染色顯示過表達(dá)circPde4b下調(diào)了RIC8A和p-p38的表達(dá)，從而抑制了DMM手術(shù)引起的OA進(jìn)展(圖6H，I)。綜上所述，在小鼠中，circPde4b和RIC8A參與了OA的發(fā)病機(jī)制（圖6J）。

結(jié)論：我們的研究描述了一種新的circRNA在OA中的機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)circPDE4B可以作為蛋白質(zhì)降解的支架，在OA的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。在臨床前動物模型中，CircPDE4B被發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)代謝，阻止軟骨基質(zhì)的形成，證實了其對OA發(fā)生的潛在治療作用。機(jī)制上，circPDE4B可作為促進(jìn)RIC8A-MID1結(jié)合的支架，降低RIC8A依賴的p38信號通路的激活，從而調(diào)節(jié)OA的進(jìn)展。