tiRNA-Gly誘導(dǎo)可變剪切促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移

現(xiàn)今研究表明tRNA-derived small noncoding RNAs（sncRNAs）主要分為兩類：tRNA halves (tiRNAs)和fragments (tRFs)。前者在人類實(shí)體腫瘤中的的生物學(xué)功能吸引了越來越多的關(guān)注，但是其在腫瘤發(fā)生中的生物學(xué)機(jī)制仍知之甚少。tiRNAs和剪切相關(guān)蛋白之間的相關(guān)作用更是為未可知。本研究首次發(fā)現(xiàn)一個(gè)5’-tRNA halves，即tiRNA-Gly通過與RBM17結(jié)合誘導(dǎo)可變剪切進(jìn)而促進(jìn)乳頭狀甲狀腺癌（PTC）的增殖和遷移。本文于2021年7月發(fā)表在影響因子7.068的《Journal of Experimental and Clinical Cancer Research》期刊上。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、人PTC組織中tRFs和tiRNAs的表達(dá)

為了鑒定人PTC組織中的tRFs和tiRNAs，收集3對PTC癌組織和癌旁組間，用于高通量測序，其結(jié)果比對至tRNA library GtRNAdb文庫，并從中去除線粒體tRNA。最終累計(jì)獲得1723個(gè)tRNA片段，其中594個(gè)片段只存在于腫瘤組織，136個(gè)只存在于癌旁組織（圖1A-B）。成分分析顯示，腫瘤中tiRNAs的數(shù)量遠(yuǎn)超癌旁組織，而tRFs則主要存在于癌旁（圖1C）。火山圖可以看出5個(gè)在腫瘤組織中顯著上調(diào)的tRNA片段：5’-tiRNA-Gly-GCC，5’-tiRNA-Lys-CTT，5’-tiRNA-Glu-CTC，5’-tRF-Val-CAC，pre-tRNA-Ser-TGA (Fig. 1D)。圖1E顯示tRNA片段1260，1293，1297和1385明顯來源于腫瘤組織。tRNA片段1293和1297都是5’-tiRNA-Gly-GCC剪切自tiRNA-Gly-GCC的不同部分的。tRNA片段1260切割自tRNA-Glu-CTC，tRNA片段1358切割自tRNA-Lys-CTT。

為了驗(yàn)證tRFs&tiRNA-Seq數(shù)據(jù)，作者檢測了91對PTC組織和癌旁組織中tRFs&tiRNA的表達(dá)，其中，tiRNA-Gly在人類PTC組織中的表達(dá)水平最高，并顯著高于癌旁組織（圖1F-G）。WB顯示，tiRNA-Gly在PTC腫瘤中蛋白表達(dá)顯著高于癌旁，但是tRNA-Gly的表達(dá)在癌和癌旁中無顯著差異（圖1H）。總之，tiRNA-Gly可能在PTC的進(jìn)展中起致癌作用。

圖1人PTC組織中tRFs和tiRNAs的表達(dá)

2、在小鼠模型中，tiRNA-Gly調(diào)節(jié)PTC細(xì)胞的增殖和遷移，并影響腫瘤生長

首先檢測了tiRNA-Gly在3株PTC細(xì)胞系中的表達(dá)，如圖2A所示，K1細(xì)胞系中tiRNA-Gly的表達(dá)顯著低于BCPAP和TPC-1細(xì)胞系。因此，對于功能獲得性實(shí)驗(yàn)，合成帶有5’磷酸末端的tiRNA-Gly轉(zhuǎn)染至K1細(xì)胞系（圖2B）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，tiRNA-Gly顯著促進(jìn)K1細(xì)胞的增殖和遷移（圖2C-D）。對于功能缺失實(shí)驗(yàn)，在BCPAP和TPC-1細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染siRNA干擾tiRNA-Gly的表達(dá)，結(jié)果顯示細(xì)胞的增殖和遷移都顯著下降（圖2E-G）。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)得出了類似的結(jié)果，干擾tiRNA-Gly表達(dá)導(dǎo)致腫瘤體積減小，Ki67表達(dá)下降?？傊?，體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)都表明tiRNA-Gly是PTC的惡性因子。

圖2 tiRNA-Gly在體內(nèi)外調(diào)節(jié)PTC細(xì)胞的惡性活動(dòng)

3、tiRNA-Gly直接與RBM17相互作用，調(diào)控RBM17在PTC細(xì)胞中的表達(dá)

為了探究tiRNA-Gly在促癌中分子機(jī)制，作者合成了生物素標(biāo)記的tiRNA-Gly及其反義序列，進(jìn)行RNA pull-down實(shí)驗(yàn)，進(jìn)而挖掘K1細(xì)胞中與tiRNA-Gly相互作用的蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一個(gè)50KD左右大小的條帶，選擇經(jīng)質(zhì)譜測定肽數(shù)> 3和獨(dú)特肽數(shù)> 3的蛋白，獲得了5個(gè)可能的tiRNA-Gly相互作用蛋白，其中RBN17通過了WB驗(yàn)證（圖2B）。RIP實(shí)驗(yàn)也證實(shí)tiRNA-Gly在RBM17抗體組富集（圖3C）。進(jìn)一步RIP實(shí)驗(yàn)表明，tiRNA-Gly在RBM17全長序列中顯著富集，但在UHM截?cái)嗪蟮男蛄兄懈患蕊@著下降，表明tiRNA-Gly和RBM17的相互作用依賴UHM（圖3D）。此外，與tiRNA-Gly的相互作用促進(jìn)了K1細(xì)胞RBM17從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，雖然tiRNA-Gly主要定位于細(xì)胞質(zhì)，但同時(shí)導(dǎo)致K1細(xì)胞胞質(zhì)RBM17蛋白水平降低，核RBM17蛋白水平升高（圖3E-G）。因此，這些研究表明tiRNA-Gly與RBM17的UHM結(jié)合促進(jìn)RBM17的核轉(zhuǎn)運(yùn)。

鑒于以上結(jié)果，作者想進(jìn)一步探究tiRNA-Gly與RBM17作用的分子結(jié)果。結(jié)果顯示，tiRNA-Gly可提高總RBM17蛋白的水平，但是不影響RBM17的mRNA水平（圖3H-I）。隨后，用蛋白質(zhì)合成抑制劑環(huán)己胺(CHX)處理細(xì)胞，tiRNA-Gly轉(zhuǎn)染后增加了K1細(xì)胞內(nèi)源性RBM17蛋白的半衰期，而β-actin作為對照（圖3J）。此外，蛋白酶體抑制劑MG132處理后，內(nèi)源性RBM17在轉(zhuǎn)染tiRNA-Gly的K1細(xì)胞中的積累量大大高于轉(zhuǎn)染siRNA-NC的K1細(xì)胞，表明tiRNA-Gly抑制了蛋白酶體依賴性的PTC細(xì)胞中RBM17的降解（圖3K）。此外，tiRNA-Gly的過表達(dá)顯著抑制了泛素化RBM17的水平（圖3L）。綜上所述，tiRNA-Gly可以穩(wěn)定RBM17蛋白通過泛素/蛋白酶體依賴性降解。

圖3tiRNA-Gly直接與RBM17結(jié)合，調(diào)控RBM17在PTC細(xì)胞中的表達(dá)

4、RBM17促進(jìn)PTC細(xì)胞的增殖和遷移，并在PTC腫瘤組織中升高

接下來探究RBM17在PTC細(xì)胞中的功能，RBM17的mRNA和蛋白表達(dá)在K1細(xì)胞系中遠(yuǎn)低于TPC-1和BCPAP細(xì)胞，其表達(dá)趨勢類似于tiRNA-Gly（圖4A-B）。于是構(gòu)建了RBM17過表達(dá)的K1細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)其增殖和遷移曾麗顯著增加（圖4C-F）。RBM17敲低則效果相反（圖4G-J）。此外，RBM蛋白表達(dá)在PTC腫瘤組織中顯著高于癌旁組織（圖4K）。以上結(jié)果表明RBM17的作用和tiRNA-Gly相似，在PTC中促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。

圖4 RBM17促進(jìn)PTC細(xì)胞的增殖和遷移

5、RBM17的衰減抑制了tiRNA-Gly對PTC細(xì)胞的影響，RBM17在PTC組織中的表達(dá)受tiRNA-Gly的調(diào)控

隨后，作者分別檢測了人PTC組織中tiRNA-Gly高表達(dá)和tiRNA-Gly低表達(dá)的組織樣本中RBM17的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與預(yù)期一致，tiRNA-Gly高表達(dá)組RBM17的表達(dá)也顯著高于tiRNA-Gly低表達(dá)組（圖5A）。進(jìn)行了類似于拯救實(shí)驗(yàn)，即過表達(dá)tiRNA-Gly組，敲除RBM17組，以及過表達(dá)tiRNA-Gly的同時(shí)敲除RBM17組，結(jié)果表明，tiRNA-Gly過表達(dá)+siRBM17同時(shí)處理可以部分消除單獨(dú)處理時(shí)引起的TPC-1和BCPAP細(xì)胞增殖和遷移的改變（圖5B-C）。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，tiRNA-Gly敲低導(dǎo)致RBM17的表達(dá)急劇性下降（圖5D）?？傊?/span>tiRNA-Gly對PTC增殖和遷移的作用依賴于RBM17。

圖5 tiRNA-Gly與RBM17之間的關(guān)系

6、tiRNA-Gly通過RBM17調(diào)節(jié)增殖或遷移相關(guān)基因的選擇性剪接

由于RBM17是一種參與mRNA選擇性剪接的剪接體蛋白，研究tiRNA-Gly在與RBM17結(jié)合時(shí)是否調(diào)節(jié)下游基因的選擇性剪接將是一項(xiàng)有趣的研究。對過表達(dá)tiRNA-Gly后的K1細(xì)胞系進(jìn)行RNA測序，所有的選擇性剪切事件如6A所示，外顯子跳躍（cassette外顯子）占37.67%，A5SSs剪接占6.78%，A3SSs剪接占4.99%，備選第一外顯子(AltStart)剪接占18.19%，備選末端外顯子（AltEnd）剪接占18.74%，互斥事件（MEXs）占5.12%，內(nèi)含子保留剪接（IR）占8.51%。外顯子跳躍顯然是tiRNA-Gly誘導(dǎo)的最頻繁的選擇性剪接事件。MAP4K4、POSTN、HACE1、DPP9和BRCA1是外顯子跳躍導(dǎo)致表達(dá)變化最大的基因。tiRNA-Gly誘導(dǎo)了MAK4K4第16外顯子的跳躍，POSTN第21外顯子的跳躍，HACE1第8外顯子的跳躍，DPP9第21外顯子的跳躍和BRCA1第13外顯子的跳躍（圖6B）。如圖6C-D所示，升高的tiRNA-Gly誘導(dǎo)了MAP4K4一個(gè)截?cái)嘈?/span>(NM_4834.4)的mRNA水平，降低了一個(gè)長型(NM_1242560.1)的mRNA水平，而下調(diào)的RBM17則起相反的作用。重要的是，RBM17的敲除阻斷了由tiRNA-Gly誘導(dǎo)的MAP4K4截?cái)嘧凅w(NM_4834.4)的增加，表明tiRNA-Gly誘導(dǎo)的選擇性剪接依賴于RBM17。

MAP4K4是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的成員，可以通過磷酸蛋白MEKK1激活MAPK通路。構(gòu)建pCMV-NM_4834.4和pCMV-NM_1242560.1質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染K1細(xì)胞，并通過qRT-PCR驗(yàn)證了其轉(zhuǎn)染效率（圖6E）。這兩種變異顯著增強(qiáng)了K1細(xì)胞的增殖和遷移。而截?cái)嘈?/span>(NM_4834.4)比長型(NM_1242560.1)對增殖和遷移的影響更強(qiáng)（圖6F-G）。此外，MEKK1、MKK4、JNK、MEK、ERK的總磷酸化水平未發(fā)生改變，而NM_4834.4和NM_1242560.1兩種變體轉(zhuǎn)染組的磷酸化水平均高于對照組。更重要的是，與NM_1242560.1相比，NM_4834.4對磷酸- MEKK1、MKK4、JNK、MEK、ERK的影響更強(qiáng)，這表明MAP4K4中第16外顯子的剪切影響了MAPK通路下游蛋白的磷酸化（圖6H）。體內(nèi)小鼠模型結(jié)果證明，注射si-tiRNA-Gly組移植瘤中磷酸化蛋白水平明顯降低，而總蛋白水平與生理鹽水組相比沒有變化（圖6I）。這些結(jié)果表明，RBM17介導(dǎo)的tiRNA-Gly誘導(dǎo)的MAP4K4第16外顯子剪接可增強(qiáng)PTC細(xì)胞的增殖和遷移，并對MAPK通路下游蛋白進(jìn)行磷酸化。

圖6 tiRNA-Gly通過RBM17調(diào)控MAP4K4 mRNA的選擇性剪接

總之，本文闡明了tiRNA-Gly結(jié)合RBM17的UHM結(jié)構(gòu)域并促進(jìn)其易位，導(dǎo)致RBM17蛋白增加，從而誘導(dǎo)PTC細(xì)胞中靶基因的選擇性剪接，最終促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。

圖7 理論模型示意圖

參考文獻(xiàn)：

Han Litao., Lai Hejing., Yang Yichen., Hu Jiaqian., Li Zhe., Ma Ben., Xu Weibo., Liu Wanlin., Wei Wenjun., Li Duanshu., Wang Yu., Zhai Qiwei., Ji Qinghai., Liao Tian.(2021). A 5'-tRNA halve, tiRNA-Gly promotes cell proliferation and migration via binding to RBM17 and inducing alternative splicing in papillary thyroid cancer. J Exp Clin Cancer Res, 40(1), 222. doi:10.1186/s13046-021-02024-3