YTHDF1通過控制FZD7的翻譯促進(jìn)胃癌發(fā)生

2021年5月，最新一篇發(fā)表在cancer research（IF=12.7000）的文章（YTHDF1 Promotes Gastric Carcinogenesis by Controlling Translation of FZD7）。此研究分析了cBioPortal (cBio cancer Genomics Portal)630例原發(fā)性胃腺癌數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)YTHDF1（m6A讀取蛋白）的突變主要是基因擴(kuò)增，導(dǎo)致其過表達(dá)。YTHDF1的高表達(dá)與更具侵襲性的腫瘤進(jìn)展和較差的總生存期相關(guān)。抑制YTHDF1在體內(nèi)外均可抑制胃癌細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生。在機(jī)制上，YTHDF1以m6依賴的方式促進(jìn)了Wnt關(guān)鍵受體frizzled7 (FZD7)的翻譯，突變的YTHDF1增強(qiáng)了FZD7的表達(dá)，導(dǎo)致Wnt/b-catenin通路的過度激活，促進(jìn)了胃癌的發(fā)生。我們的研究結(jié)果表明，YTHDF1及其m6a介導(dǎo)的Wnt/b-catenin信號(hào)通路在胃癌中的致癌作用，為靶向此類表觀遺傳調(diào)控因子提供了一種新的方法

背景：超過100個(gè)不同的RNA修改特征已經(jīng)在過去的幾十年里,其中,該N6-methyladenosine (m6A)修改是最豐富的形式在真核mRNA。不同的m6A讀者蛋白優(yōu)先區(qū)分轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)的RNA m6A景觀。在細(xì)胞質(zhì)中，大多數(shù)YTH (YTHDF1-3和YTHDC2)和IGF2BP (IGF2BP1- 3)家族蛋白與m6a修飾的mrna結(jié)合并調(diào)節(jié)其穩(wěn)定性和翻譯。此外，其他蛋白質(zhì)可以結(jié)合m6a修飾的前體rna在細(xì)胞核內(nèi)，并影響其加工。

m6a相關(guān)基因缺陷影響多種生物過程。例如，metttl3的缺失導(dǎo)致受損的胚胎干細(xì)胞退出自我更新走向分化;抑制METTL14導(dǎo)致明顯的胚胎生長遲緩;斑馬魚胚胎中YTHDF2的消融延遲了早期胚胎發(fā)育中的母-合子過渡。特別是，RNA m6a相關(guān)基因正在成為在各種癌癥中促進(jìn)腫瘤啟動(dòng)和進(jìn)展的關(guān)鍵調(diào)控因子，包括肺癌中的metttl3、肝癌中的metttl14、白血病中的FTO和乳腺癌中的ALKBH5。然而，m6A如何調(diào)節(jié)癌變以及下游通路和機(jī)制如何傳遞這些信號(hào)尚不完全清楚。

技術(shù)路線：

YTHDF1的增加通過加速Wnt受體基因FZD7的翻譯促進(jìn)胃癌的發(fā)生，導(dǎo)致Wnt通路以m6a依賴的方式激活

一、YTHDF1在胃癌中的過表達(dá)

通過評(píng)估YTHDF1突變的分布，我們發(fā)現(xiàn)65%的突變是基因擴(kuò)增，這通常會(huì)導(dǎo)致基因產(chǎn)物的過表達(dá)(圖1A).通過對(duì)TCGA數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)YTHDF1在胃癌患者中的表達(dá)確實(shí)明顯高于正常組織(圖1B)。YTHDF1的高表達(dá)與胃癌進(jìn)展(圖1C)和較差的總生存期(圖1D)相關(guān)。對(duì)正常胃組織和胃癌標(biāo)本進(jìn)行免疫組化分析，證實(shí)腫瘤組織中YTHDF1蛋白表達(dá)上調(diào)(圖1F)。此外，YTHDF1在胃癌患者中的異常高表達(dá)與更嚴(yán)重的臨床病理特征(如神經(jīng)周圍侵犯、侵襲性腫瘤分期(III/IV期vs. I/II期)、靜脈侵犯等顯著相關(guān)(圖1G）。Kaplan Meier生存分析也顯示，YTHDF1高表達(dá)的胃癌患者4年總生存期較差。

綜上所述，YTHDF1在胃癌發(fā)生中具有潛在的致瘤作用。

二、YTHDF1缺乏可抑制胃癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移

YTHDF1在不同胃癌細(xì)胞株中的蛋白表達(dá)水平，遠(yuǎn)高于正常胃腺細(xì)胞GES-1。為了進(jìn)一步探討YTHDF1在胃癌中的作用，采用了胃癌細(xì)胞系、細(xì)胞系來源的異種移植(CDX)和PDX模型(圖2A)。首先，通過產(chǎn)生兩種穩(wěn)定的shRNA表達(dá)人胃癌細(xì)胞株MGC-803和HGC-27，研究了YTHDF1的抑制作用，這兩種細(xì)胞株在所有被檢測的胃癌細(xì)胞株中YTHDF1的表達(dá)相對(duì)較高(補(bǔ)充圖S2B)。YTHDF1基因敲除確實(shí)降低了胃癌細(xì)胞的增殖(圖2B)。此外，在MGC-803和HGC-27細(xì)胞中YTHDF1敲除降低細(xì)胞的遷移和侵襲能力(圖2C)。隨后通過皮下注射YTHDF1敲除的MGC-803細(xì)胞到免疫缺陷裸鼠，研究YTHDF1的抑制是否會(huì)影響體內(nèi)胃癌的發(fā)生。YTHDF1水平的降低導(dǎo)致MGC-803移植腫瘤的腫瘤進(jìn)展延遲(補(bǔ)充圖S2D和S2E)；與對(duì)照組相比，YTHDF1缺陷腫瘤的重量和體積顯著減少(圖2D)。因此，在YTHDF1缺陷腫瘤中，增殖標(biāo)記物Ki-67下調(diào)，凋亡標(biāo)記物cleaved caspase-3上調(diào)(圖2E)。通過兩種轉(zhuǎn)移模型探討YTHDF1是否參與了胃癌的體內(nèi)轉(zhuǎn)移。尾靜脈注射MGC-803-sicontrol細(xì)胞導(dǎo)致肺轉(zhuǎn)移，而注射MGC-803-siYTHDF1l細(xì)胞幾乎完全消除轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的形成。最后建立了PDX模型，發(fā)現(xiàn)敲除YTHDF1抑制了腫瘤的生長和重量。

上述結(jié)果表明YTHDF1在胃癌發(fā)生中起重要作用。

三、通過RNA-seq、RIP-seq和MeRIP-seq鑒定ythdf1調(diào)控的轉(zhuǎn)錄本

對(duì)YTHDF1基因敲除MGC-803細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq。RNA圖譜顯示YTHDF1抑制導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄異常(圖3A)?；虮倔w論(GO)分析表明，下調(diào)的基因在血管生成、細(xì)胞遷移、粘附和細(xì)胞生長等方面富集;而定位于負(fù)調(diào)控腫瘤進(jìn)展的基因表達(dá)上調(diào)(圖3B)。RIP-seq獲得了9082個(gè)結(jié)合YTHDF1的候選基因。我們分析了功能富集變化最顯著的前3000個(gè)基因，表明它們高度參與了癌癥相關(guān)途徑(圖3C)。但累積分布分析表明，YTHDF1結(jié)合基因與YTHDF1未結(jié)合基因在轉(zhuǎn)錄水平上沒有顯著差異(圖3D)。這與之前的研究結(jié)果一致，即YTHDF1主要調(diào)控基因翻譯。MeRIP-seq鑒定YTHDF1調(diào)控的m6A修飾的轉(zhuǎn)錄本。2365個(gè)轉(zhuǎn)錄本檢測到m6A修飾，主要發(fā)生在mrna中(98%;圖3 e;補(bǔ)充表S7)，優(yōu)先聚集在外顯子(58%;圖3 e)。與其他n6 -甲基腺苷測序結(jié)果一致，m6A峰在30UTR區(qū)域富集(圖3F)，并僅被典型GGAC基元檢測(圖3G)。將RIP-seq和MeRIP-seq整合的重疊轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行富集分析，發(fā)現(xiàn)Wnt和Hippo信號(hào)通路受到了顯著影響(圖3H）。假設(shè)YTHDF1抑制通過Hippo或Wnt途徑抑制腫瘤生長(圖3I)。

四、FZD7是YTHDF1中真正的m6A修飾靶標(biāo)

對(duì)于顯著腹肌Hippo或Wnt通路的13個(gè)轉(zhuǎn)錄本，我們采用了多步驟篩選策略(圖4A)。使用RIP結(jié)合qPCR驗(yàn)證確定YTHDF1相互作用的轉(zhuǎn)錄本（4B）。Wnt途徑的FZD1、FZD7、CTBP2、MAPK9、MAP3K7等轉(zhuǎn)錄本，以及Hippo途徑的TP53BP1、PARD3、SMAD2、SMAD3等轉(zhuǎn)錄本均被YTHDF1抗體特異性免疫沉淀(4C)。YTHDF1基因敲除僅顯著降低了FZD7、MAPK9、SMAD2、SMAD3和PARD3的蛋白水平(圖4D)，但它們的mRNA未受影響。m6A免疫沉淀反應(yīng)(m6A-IP)和YTHDF1 eCLIP和qPCR證實(shí)YTHDF1 對(duì)FZD7, MAPK9, SMAD2 SMAD3,和PARD3 mrna進(jìn)行m6A修飾。FZD7的翻譯效率下調(diào)最顯著，而其他基因的翻譯效率均出現(xiàn)輕微的抑制(圖4G)。這些結(jié)果共同提示FZD7是YTHDF1在胃癌中真正的直接靶點(diǎn)。

五、YTHDF1以m6a依賴的方式調(diào)控FZD7的表達(dá)

   在GC-803和胃癌細(xì)胞株基礎(chǔ)上，進(jìn)行m6A-qPCR和YTHDF1 RIP qPCR的基因特異性分析。確實(shí)，在FZD7 mRNA中觀察到兩個(gè)m6A峰，并且在MGC-803和HGC-27細(xì)胞中證實(shí)了與YTHDF1的關(guān)聯(lián)(圖5A和B)。標(biāo)記YTHDF1突變體(YTHDF1- mut)具有兩個(gè)關(guān)鍵氨基酸突變(K395A, Y397A)以消除其m6binding口袋(44)，將其轉(zhuǎn)染到MGC-803和HGC- 27細(xì)胞中(圖5C)。在YTHDF1野生型(YTHDF1- wt)轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞中觀察到的FZD7表達(dá)上調(diào)在YTHDF1- mut中被消除，但在YTHDF1-WT和YTHDF1-MUT兩種細(xì)胞系中，F(xiàn)ZD7的mRNA水平相當(dāng)(圖5E)。RIP-qPCR分析顯示，F(xiàn)ZD7 mRNA與突變體YTHDF1的相互作用明顯受損(圖5F)。為了進(jìn)一步探討m6A修飾在FZD7 mRNA中的作用，我們構(gòu)建了三種FZD7突變體，其中一種突變體為第一個(gè)m6A峰(FZD7- peak1 Mut)，另一種突變體為第二個(gè)m6A峰(FZD7- Peak2 Mut)，以及雙突變體(FZD7- peak1 &2 Mut;圖5)。與野生型相比FZD7 (FZD7-WT)突變?cè)诘诙6A峰和雙m6A峰值突變(FZD7-Peak2傻瓜和FZD7-Peak1&2Mut)野生型YTHDF1沒有反應(yīng)過度(7和8)圖5 h,面板,建議第二m6A峰FZD7 YTHDF1的主要網(wǎng)站的監(jiān)管。同樣，m6a結(jié)合能力的喪失完全消除了YTHDF1促進(jìn)FZD7 mRNA翻譯的作用(圖5H，圖9 12)。這些結(jié)果表明YTHDF1介導(dǎo)的FZD7的翻譯控制依賴于m6A修飾。

六、THDF1通過FZD7調(diào)控Wnt/b-catenin通路

   A，典型Wnt/b-catenin通路示意圖。B, YTHDF1敲低或過表達(dá)MGC-803和HGC-27細(xì)胞中總(B -catenin)和非磷酸化(Ser33/37/Thr41, activated B -catenin) B -catenin的蛋白水平。C, IF染色分析YTHDF1敲低、過表達(dá)或突變過表達(dá)的MGC-803和HGC-27細(xì)胞中總(紅色)和激活的(綠色)b-catenin的亞細(xì)胞定位。D，免疫印跡分析b-catenin靶基因、HMGA2、cyclin D、CDC25A、COX2、SOX9、VEGFA在YTHDF1敲低、過表達(dá)或突變過表達(dá)MGC-803和HGC-27細(xì)胞中的表達(dá)。E，定量分析YTHDF1敲低和過表達(dá)MGC- 803和HGC-27細(xì)胞中b-catenin靶基因的RNA水平(n =3)。

七、YTHDF1-FZD7-b-catenin軸促進(jìn)胃癌進(jìn)展

   A和B, Western blot分析YTHDF1、FZD7、B -catenin和激活的B -catenin在YTHDF1敲低的MGC-803 (A)和HGC-27 (B)細(xì)胞中轉(zhuǎn)染FZD7構(gòu)建物或空載體對(duì)照。C和D，如上所述MGC-803 (C)和HGC-27 (D)細(xì)胞的增殖。E，如上所述MGC-803(左)和HGC-27(右)細(xì)胞的遷移分析。F，如上所述MGC-803(左)和HGC-27(右)細(xì)胞的侵襲分析。G，熱圖顯示YTHDF1, FZD7，(總)b-catenin在人胃癌樣本中的表達(dá)結(jié)果(n= 79)。H, YTHDF1、FZD7和(總)b-catenin在人胃癌樣本中的表達(dá)的相關(guān)性分析(n= 79;Pearson和Spearman相關(guān)檢驗(yàn))。I，三對(duì)胃腫瘤及鄰近正常組織中YTHDF1、FZD7、活化b-catenin的代表性IHC芯片結(jié)果。J，胃癌患者YTHDF1、FZD7、(total) b-catenin (low, n 39; high, n 40)及總生存率Kaplan Meier分析(log-rank with Mantel Cox test)。K，顯示YTHDF1如何調(diào)節(jié)b-catenin信號(hào)通路促進(jìn)胃癌進(jìn)展的示意圖。