鐵死亡誘導(dǎo)Ca2+通量和ESCRT-III激活來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡動(dòng)力學(xué)

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2021-08-13
目前有作者研究了不同細(xì)胞模型中Erastin-1和RSL3引發(fā)的Ferroptosis中質(zhì)膜滲透的分子機(jī)制。利用活細(xì)胞成像和流式細(xì)胞......

 

鐵死亡(Ferroptosis)是一種不依賴(lài)caspase的調(diào)控細(xì)胞壞死形式,其特征是在細(xì)胞膜上產(chǎn)生鐵依賴(lài)的脂質(zhì)過(guò)氧化物。Ferroptosis發(fā)生的一個(gè)基本步驟是破壞質(zhì)膜。然而,導(dǎo)致Ferroptosis質(zhì)膜完整性喪失的分子機(jī)制以及膜損傷的性質(zhì)和大小尚未得到深入研究。其他形式的細(xì)胞死亡如壞死、焦亡或毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡會(huì)導(dǎo)致離子通量的激活。在這些情況下,Ca2+通量與膜修復(fù)機(jī)制的激活有關(guān),同時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)體(ESCRT)發(fā)揮了關(guān)鍵的平衡作用,可以延緩壞死和焦亡癥中的細(xì)胞死亡。目前有作者研究了不同細(xì)胞模型中Erastin-1RSL3引發(fā)的Ferroptosis中質(zhì)膜滲透的分子機(jī)制。利用活細(xì)胞成像和流式細(xì)胞術(shù),跟蹤了Ferroptosis不同特征的動(dòng)力學(xué)。該研究發(fā)表于20213月《Cell Death & Differentiation》期刊上,IF:10.717。


技術(shù)路線(xiàn):



主要結(jié)果如下:

1. 細(xì)胞內(nèi)Ca2+持續(xù)增加是ferroptosis的標(biāo)志

胞漿Ca2+增加、細(xì)胞腫脹以及質(zhì)膜破裂被認(rèn)為是壞死和焦亡的標(biāo)志。為了評(píng)估這些細(xì)胞改變是否也發(fā)生在ferroptosis期間,作者通過(guò)活細(xì)胞共聚焦成像(1A-B)和流式細(xì)胞術(shù)(1C-H)檢測(cè)了用Erastin-1RSL3處理的小鼠成纖維細(xì)胞(NIH-3T3)的胞漿Ca2+水平,同時(shí)檢測(cè)了細(xì)胞形態(tài)和質(zhì)膜破裂的變化。作者使用fluo-4am作為Ca2+指示劑的熒光形式,以可視化細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平,并使用熒光DNA插入劑PI作為不可逆質(zhì)膜破壞和細(xì)胞死亡的標(biāo)記。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在使用Erastin-1RSL3處理后,NIH-3T3細(xì)胞胞質(zhì)Ca2+濃度明顯增加(1A, B)。胞漿內(nèi)Ca2+增加、細(xì)胞圓化和質(zhì)膜破裂可被ferroptosis特異性抑制劑ferrostatin-1fer1)抑制(1A-F)。


1 Ferroptosis伴隨著細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加和細(xì)胞死亡


2.
脂質(zhì)氧化先于胞質(zhì)Ca2+的增加和質(zhì)膜的破壞

體積細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中Ferroptosis特征之間的詳細(xì)時(shí)間關(guān)系被治療后群體細(xì)胞發(fā)生Ferroptosis的異質(zhì)性所掩蓋。為了解決這個(gè)問(wèn)題,作者使用活細(xì)胞共聚焦顯微鏡在單細(xì)胞水平上量化了Fluo-4 AM信號(hào)、細(xì)胞圓度和PI攝入量的增加。從單個(gè)細(xì)胞獲得的動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)(2C, F, K)中,計(jì)算出每個(gè)ferroptotic表型(t50)實(shí)現(xiàn)50%變化所需的時(shí)間,這使得可以設(shè)置Ferroptosis各過(guò)程之間的滯后時(shí)間(2D, G, L)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與所使用的Ferroptosis觸發(fā)器無(wú)關(guān),胞漿Ca2+的增加先于細(xì)胞圓縮和質(zhì)膜完全坍塌(2A, B)。從流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)(1G)可以看出,Erastin-1存在時(shí),胞質(zhì)Ca2+的增加是一個(gè)雙相行為的兩步過(guò)程(2C)。第一個(gè)事件在最大Ca2+信號(hào)的40%左右達(dá)到飽和,與不相關(guān)的鈣(Ca2+un)增加相對(duì)應(yīng),因?yàn)樗鼪](méi)有受到Ferroptosis的抑制(1G)。第二次Ca2+升高,與RSL3處理常見(jiàn),并被Fer-1抑制,對(duì)應(yīng)的是針對(duì)鐵下垂的胞質(zhì)Ca2+增加(Ca2+sp) (2F)。在Erastin-1處理后,Ca2+un增加,隨后Ca2+sp上升,細(xì)胞周?chē)妥罱K的PI攝入(2C-E)。相比之下,RSL3處理的細(xì)胞具有獨(dú)特和特定的Ca2+上升,隨后細(xì)胞圓整和最終的PI攝入(2F-H)。通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化傳感器C11 BODIPY 581/591觀察到RSL3處理促進(jìn)了質(zhì)膜和亞細(xì)胞膜上的脂質(zhì)過(guò)氧化(圖2I),脂質(zhì)過(guò)氧化先于細(xì)胞圓化(2J, K)??紤]到胞質(zhì)Ca2+增加到細(xì)胞圓化之間的滯后時(shí)間始終低于脂質(zhì)過(guò)氧化到細(xì)胞圓化之間的滯后時(shí)間,可以估計(jì)Ca2+的增加發(fā)生在脂質(zhì)過(guò)氧化之后(2M)。這一估計(jì)是基于fluo- 4am(2F-H)BODIPY氧化比(2K, L)的獨(dú)立動(dòng)力學(xué)之間的推斷。


2 在質(zhì)膜破裂之前,胞質(zhì)Ca2+和脂質(zhì)氧化增加


3.
滲透活性劑保護(hù)細(xì)胞防止ferroptosis

氣孔形成是不同類(lèi)型調(diào)控細(xì)胞死亡的共同特征。質(zhì)膜孔的打開(kāi)導(dǎo)致水分子的流入,這是由于無(wú)法通過(guò)膜孔的高濃度細(xì)胞內(nèi)大分子造成的滲透失衡的結(jié)果(3A)。這種效果可以通過(guò)添加不能夠通過(guò)孔進(jìn)入細(xì)胞的適當(dāng)大小的滲透保護(hù)劑peg來(lái)阻止,從而平衡細(xì)胞內(nèi)滲透壓、水流入和隨后的細(xì)胞坍塌(3B)。加入1.8?nmpeg并不能阻止胞質(zhì)Ca2+的增加、細(xì)胞圓化或細(xì)胞死亡(3C-F)。相比之下,在peg(2.3nm2.7nm)的存在下,胞質(zhì)Ca2+水平的增加和細(xì)胞死亡均以尺寸依賴(lài)的方式延遲(3D, F)。PEG(2.7nm)對(duì)ferroptosis的保護(hù)作用在洗滌后恢復(fù),這表明膜損傷隨時(shí)間的推移是穩(wěn)定的(3G)。我們還發(fā)現(xiàn),PEG(2.7nm)并不能阻止RSL3處理的NIH-3T3細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化(3H, I)。對(duì)于使用的所有PEG大小,NIH-3T3細(xì)胞處理較長(zhǎng)時(shí)間(24 h)后細(xì)胞死亡恢復(fù)(3J)。PEG對(duì)ferroptosis動(dòng)力學(xué)的抑制作用也隨著RSL3濃度的增加而降低(3K, L)。最終作者以在較低濃度RSL3下能夠起到保護(hù)作用的PEG尺寸作為參考,得出質(zhì)膜穿孔部分的半徑約為2.5 nm(3L)。

3 大尺寸的PEG對(duì)ferroptosis有滲透保護(hù)作用


4. ESCRT-III
復(fù)合物在
ferroptosis期間被激活,并拮抗細(xì)胞死亡

在壞死和焦亡過(guò)程中,依賴(lài)于ESCRT-III復(fù)合物作用的膜修復(fù)可以延緩細(xì)胞死亡。作者使用CHMP4B斑點(diǎn)形成作為代替ESCRT-III激活。最初,CHMP4B主要表現(xiàn)為均勻的胞質(zhì)分布,然而,在RSL3處理后,該蛋白定位于不同的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu),隨著時(shí)間的推移,其數(shù)量和熒光強(qiáng)度都在增加(4A, B)。CHMP4B點(diǎn)的形成大致與胞質(zhì)Ca2+濃度的增加相一致(4C, E)。當(dāng)細(xì)胞修復(fù)機(jī)制最終被淹沒(méi)時(shí),細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平持續(xù)升高、細(xì)胞圓化和ESCRT-III復(fù)合體激活后,細(xì)胞膜最終破裂(4B, E, F)。PEG(2.7nm)處理也阻斷了CHMP4B斑點(diǎn)的形成 (4G-J)。這些結(jié)果證明了ESCRT-III復(fù)合物以Ca2+依賴(lài)的方式被激活來(lái)修復(fù)膜損傷。

為了研究ESCRT-IIIferroptosis中的功能作用,作者評(píng)估了抑制CHMP4B對(duì)NIH-3T3細(xì)胞死亡的影響(5A, B)。與對(duì)照組相比,CHMP4B敲除細(xì)胞的死亡發(fā)生率更高、更快,特別是在早期時(shí)間點(diǎn)(1-3 h),這表明CHMP4B的缺失導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)ferroptosis的敏感性更高。另外,作者使用蛋白質(zhì)組譜儀XL細(xì)胞因子陣列試劑盒(5C),確定ferroptosis是否可以直接調(diào)節(jié)不同細(xì)胞系和不同處理下的細(xì)胞因子分泌。在誘導(dǎo)ferroptosis時(shí),作者檢測(cè)到細(xì)胞因子亞群水平的變化,這些變化與細(xì)胞系和治療有關(guān)。此外,敲除CHMP4B改變了RSL3處理后獲得的細(xì)胞因子譜(5C, D)。這些結(jié)果表明,盡管具體的細(xì)胞因子改變依賴(lài)于治療,但ESCRT-III通常影響ferroptotic細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌。另外,RSL3處理的沉默CHMP4B細(xì)胞的上清能夠增加小鼠巨噬細(xì)胞的CD14表面表達(dá)(5E)。這些結(jié)果表明,與壞死和焦亡相似,ESCRT-III也調(diào)節(jié)ferroptotic細(xì)胞的免疫輸出。


4 膜損傷與CHMP4B活化有關(guān)

 

5 ESCRT-III調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡和嗜鐵細(xì)胞的免疫結(jié)果


結(jié)論:

ESCRT-IIIferroptosis微環(huán)境中調(diào)節(jié)細(xì)胞因子水平,揭示了這一機(jī)制在調(diào)控ferroptosis炎癥的作用。這些發(fā)現(xiàn)支持了一個(gè)普遍的模型,在這個(gè)模型中,質(zhì)膜孔的形成和膜修復(fù)是控制不同類(lèi)型的壞死及其炎癥特征的中心和相反的調(diào)控機(jī)制。


參考文獻(xiàn):

Pedrera L, Espiritu RA, Ros U, Weber J, Schmitt A, Stroh J, Hailfinger S, von Karstedt S, García-Sáez AJ. Ferroptotic pores induce Ca2+ fluxes and ESCRT-III activation to modulate cell death kinetics. Cell Death Differ. 2021, 28(5):1644-1657. doi: 10.1038/s41418-020-00691-x