缺氧腫瘤來(lái)源的外泌體miR-31-5p促進(jìn)肺腺癌轉(zhuǎn)移

外泌體已經(jīng)成為細(xì)胞間通訊的重要媒介。缺氧被廣泛認(rèn)為是腫瘤侵襲性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，并顯著影響腫瘤細(xì)胞的外泌體釋放。然而，人們對(duì)來(lái)自低氧肺腺癌(LUAD)細(xì)胞的外泌體的作用知之甚少。2021年6月發(fā)表于Journal of Experimental & Clinical Cancer Research（IF=11.161）的文章“Hypoxic tumor-derived exosomal miR-31-5p promotes lung adenocarcinoma metastasis by negatively regulating SATB2-reversed EMT and activating MEK/ERK signaling”對(duì)此展開(kāi)了研究。我們發(fā)現(xiàn)低氧LUAD細(xì)胞來(lái)源的外泌體（HExo）能顯著增強(qiáng)常氧LUAD細(xì)胞的遷移和侵襲。MiRNA測(cè)序結(jié)果顯示miR-31-5p在HExo內(nèi)大量?jī)?nèi)化，可被常氧LUAD細(xì)胞攝取。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體miR-31-5p可直接靶向SATB2誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并顯著增加MEK/ERK信號(hào)的激活，從而促進(jìn)體外和體內(nèi)腫瘤進(jìn)展。此外，在LUAD患者，特別是轉(zhuǎn)移性疾病患者中檢測(cè)到較高水平的循環(huán)外泌體miR-31-5p。我們的研究結(jié)果表明，外泌體miR-31-5p在LUAD進(jìn)展中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，可以作為LUAD的診斷生物標(biāo)志物。

技術(shù)路線

結(jié)果：

1）來(lái)自LUAD細(xì)胞條件培養(yǎng)基的外泌體的鑒定

將LUAD細(xì)胞在缺氧(1% O2)或常氧(20% O2)條件下培養(yǎng)48小時(shí)。我們發(fā)現(xiàn)缺氧條件下HIF-1α的表達(dá)水平顯著升高(圖1a)，這表明我們已經(jīng)成功建立了一個(gè)供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用的缺氧模型。然后，用超離心法從LUAD條件培養(yǎng)基中分離外泌體。透射電鏡觀察純化后的外泌體形態(tài)，具有典型的外泌體形態(tài)，粒徑分布為50-150 nm(圖1b)。NTA數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)，大多數(shù)顆粒直徑約為100 nm(圖1c)，缺氧條件下釋放的外泌體濃度遠(yuǎn)高于常氧條件下釋放的外泌體濃度(圖1d)。此外，我們?cè)噲D通過(guò)western blot驗(yàn)證純化的外泌體上是否存在外泌體標(biāo)記物，結(jié)果顯示CD63、TSG101和Flotillin在外泌體中高表達(dá) (圖1e)。這些結(jié)果表明，我們能夠分離純化的外泌體，缺氧促進(jìn)外泌體的分泌。

2）HExo增強(qiáng)了常氧細(xì)胞的遷移和侵襲能力

為了探究HExo對(duì)LUAD細(xì)胞的生物學(xué)作用，我們用HExo處理A549和H1299細(xì)胞，觀察其表型變化。用熒光PKH67標(biāo)記HExo，這將使我們能夠通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)到它們被LUAD細(xì)胞內(nèi)化(圖2a)。我們檢測(cè)了EMT相關(guān)標(biāo)記物的變化，發(fā)現(xiàn)HExo顯著降低了E-cadherin的表達(dá)，而增加了Vimentin的表達(dá)(圖2b)。與NExo和PBS對(duì)照組相比，劃痕試驗(yàn)顯示，經(jīng)HExo處理的腫瘤細(xì)胞顯著減少了開(kāi)放空間(圖2c)。相似的是，在transwell實(shí)驗(yàn)中，HExo處理促進(jìn)了LUAD細(xì)胞的遷移(圖2d)。除了遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果外，與HExo共培養(yǎng)的LUAD細(xì)胞顯示出顯著增加的侵襲能力(圖2e)。這些數(shù)據(jù)表明，HExo可促進(jìn)體外常氧細(xì)胞的遷移和侵襲。

3）HExo介導(dǎo)的miR-31-5p向常氧細(xì)胞的轉(zhuǎn)移

先前的一項(xiàng)研究證實(shí)，含有miRNA的外泌體可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞并影響細(xì)胞功能。為了研究這種轉(zhuǎn)移是否會(huì)發(fā)生在LUAD細(xì)胞中，我們提取HExo和NExo的總RNA，使用Illumina HiSeq平臺(tái)進(jìn)行miRNA-seq分析。我們發(fā)現(xiàn)miR-31-5p表達(dá)水平最高，并且在LUAD細(xì)胞系中穩(wěn)定上調(diào)(圖3a)。因此我們選擇miR-31-5p進(jìn)行進(jìn)一步研究。為了確認(rèn)miR-31-5p是否被外泌體包裹，我們添加了可以降解游離RNA的RNase A和增加細(xì)胞膜通透性的Triton X-100。不出所料，RNase A處理組的miR-31-5p表達(dá)水平與對(duì)照組一致。然而，在RNase A和Triton X-100組中，miR-31-5p水平均顯著降低(圖3b)。這些結(jié)果表明，miR-31-5p通過(guò)LUAD細(xì)胞來(lái)源的外泌體傳遞到其他細(xì)胞，并通過(guò)被雙層脂質(zhì)雙層膜包裹而免受降解。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，缺氧條件下，miR-31-5p在HExo中的表達(dá)水平高于在NExo中的表達(dá)水平，但這些水平在GW4869處理下被逆轉(zhuǎn)(圖3c)，這進(jìn)一步表明缺氧條件促進(jìn)了外泌體的分泌和miR-31-5p向受體細(xì)胞的運(yùn)輸。

4）外泌體miR-31-5p直接靶向SATB2促進(jìn)LUAD細(xì)胞遷移和侵襲

為了確定miR-31-5p可能的細(xì)胞靶點(diǎn)，我們使用三個(gè)在線數(shù)據(jù)庫(kù):Targetscan、miRTarbase和miRDB進(jìn)行重疊分析。分析表明SATB2是miR-31-5p的靶點(diǎn)。接下來(lái)，進(jìn)行熒光素酶測(cè)定以驗(yàn)證數(shù)據(jù)庫(kù)分析的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性。我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了miR-31-5p模擬物的A549細(xì)胞的熒光素酶活性與NC組的熒光素酶活性相比顯著降低(圖4a)。此外，在HExo治療組中也觀察到類(lèi)似的結(jié)果(圖4b)。此外，在常氧或缺氧條件下轉(zhuǎn)染miR-31-5p模擬物的細(xì)胞顯示SATB2表達(dá)水平顯著降低(圖4c)，而使用HExo處理也降低SATB2表達(dá)(圖4d)。因此，我們證實(shí)SATB2是miR-31-5p的直接靶點(diǎn)。接下來(lái)，我們用si-SATB2和/或miR-31-5p抑制劑處理LUAD細(xì)胞，以評(píng)估外泌體miR31-5p是否可能通過(guò)靶向SATB2促進(jìn)更具侵襲性的表型。與對(duì)照組相比，miR-31-5p抑制劑組在愈合試驗(yàn)和Transwell侵襲試驗(yàn)中表現(xiàn)出強(qiáng)烈的活性水平下降，而si-SATB2-2處理組在這些試驗(yàn)中表現(xiàn)出相反的趨勢(shì)。然而，在A549和H1299細(xì)胞系中，si-SATB2-2組細(xì)胞的遷移和侵襲能力可以通過(guò)miR31-5p抑制劑的作用而減弱(圖4e-f)。

5）外泌體miR-31-5p促進(jìn)體內(nèi)轉(zhuǎn)移

我們假設(shè)來(lái)自HExo的外泌體miR-31-5p可以增加異種移植模型中LUAD細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。在靜脈尾注射后的8周觀察期內(nèi)，我們?nèi)⌒∈蠓谓M織標(biāo)本，用HE染色(圖5a)。通過(guò)統(tǒng)計(jì)染色組織中轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)的數(shù)量，我們發(fā)現(xiàn)HExo組小鼠肺轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)比PBS組小鼠肺轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)多，轉(zhuǎn)染miR-31-5p抑制劑可以消除這種作用。相反，與miR-31-5p抑制劑組相比，HExo聯(lián)合miR-31-5p抑制劑治療增加了轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)量(圖5b)。我們還評(píng)估了接受不同外泌體治療的小鼠的總體生存時(shí)間。令人驚訝的是，HExo組的小鼠總生存時(shí)間比其他三組的小鼠短(圖5c)。此外，我們采用免疫化學(xué)方法檢測(cè)肺組織中EMT相關(guān)標(biāo)志物和SATB2的表達(dá)。在HExo組中檢測(cè)到Vimentin表達(dá)水平升高，E-cadherin和SATB2表達(dá)水平下降，這些表達(dá)變化被miR-31-5p抑制劑減弱(圖5d)。

6）miR-31-5p抑制劑可逆轉(zhuǎn)MEK/ERK信號(hào)通路中HExo誘導(dǎo)的進(jìn)展

MEK/ERK信號(hào)通路已被證明參與了侵襲性肺癌表型的發(fā)展和EMT過(guò)程。因此，為了研究來(lái)自HExo的外泌體miR-31-5p對(duì)MEK/ERK信號(hào)通路的影響，我們?cè)u(píng)估了MEK和ERK的磷酸化水平。如圖6a所示，與NExo和PBS組相比，HExo組MEK和ERK的磷酸化水平明顯增強(qiáng)。然而，轉(zhuǎn)染miR-31-5p抑制劑可消除MEK/ERK信號(hào)活性升高和EMT的影響，而同時(shí)加入HExo和miR-31-5p抑制劑可逆轉(zhuǎn)這些影響(圖6b)。我們也觀察到外泌體miR-31-5p在功能實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮類(lèi)似的作用。轉(zhuǎn)染miR-31-5p抑制劑可抑制LUAD細(xì)胞的遷移和侵襲能力，而轉(zhuǎn)染HExo和miR-31-5p抑制劑可逆轉(zhuǎn)這些能力(圖6c-d)。這些結(jié)果證實(shí)了來(lái)自HExo的外泌體miR-31-5p可以增強(qiáng)EMT過(guò)程和MEK/ERK信號(hào)通路活性。

7）循環(huán)外泌體miR-31-5p可能是LUAD的診斷生物標(biāo)志物

為了探討循環(huán)外泌體miR-31-5p是否可能對(duì)LUAD具有診斷價(jià)值，我們收集了82例LUAD患者和39例健康人的血漿樣本，然后分離出外泌體。透射電鏡照片顯示，樣本含有完整的膜狀顆粒(圖7a)。接下來(lái)，我們從血漿來(lái)源的外泌體中提取miRNA，發(fā)現(xiàn)LUAD患者的外泌體中miR-31-5p水平顯著高于健康對(duì)照組的外泌體(圖7b)。此外，我們發(fā)現(xiàn)所有轉(zhuǎn)移性疾病患者LUAD血漿來(lái)源的外泌體樣本中外泌體miR-31-5p的水平遠(yuǎn)高于非轉(zhuǎn)移性疾病患者的水平(圖7c)。外泌體miR-31-5p的ROC分析顯示，外泌體miR-31-5p在LUAD患者和健康個(gè)體之間具有較高的鑒別能力(圖7d)。以上數(shù)據(jù)提示外泌體miR-315p可作為LUAD的診斷生物標(biāo)志物。

結(jié)論： miR-31-5p在低氧LUAD細(xì)胞衍生的外泌體中大量富集。外泌體miR-31-5p通過(guò)降低SATB2表達(dá)和增加MEK/ERK通路的活性在癌癥進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。外泌體miR-31-5p可能作為LUAD的循環(huán)診斷生物標(biāo)志物。