乳腺癌衍生的外泌體 miR-138-5p 通過抑制 KDM6B 調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的極化

乳腺癌是女性腫瘤中最普遍的惡性腫瘤，近些年乳腺癌發(fā)病率和死亡率逐年增加。乳腺癌微環(huán)境不僅包括腫瘤細(xì)胞，還包括基質(zhì)細(xì)胞和不同的免疫細(xì)胞亞群。其中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞 (TAM) 是腫瘤微環(huán)境的關(guān)鍵組成部分，廣泛參與調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展。今天我們來講一篇關(guān)于乳腺癌外泌體miRNA介導(dǎo)TAM極化的文章，文章題名為：Cancer-derived exosomal miR-138-5p modulates polarization of tumor-associated macrophages through inhibition of KDM6B，發(fā)表于Theranostics期刊（IF=11.55）。

miR-138-5p抑制巨噬細(xì)胞表達(dá)KDM6B

首先檢查了 MB-MDA-231 乳腺癌細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞系 THP-1 中KDM6B表達(dá)的影響。與 MDA-MB-231 懸浮共培養(yǎng) 48 小時(shí)后，THP-1 細(xì)胞中的 KDM6B 水平顯著降低，源自 MDA-MB-231 的條件培養(yǎng)基 (CM) 抑制了 THP-1 細(xì)胞中KDM6B 的表達(dá)，表明乳腺癌細(xì)胞分泌的一種因子是造成這種效應(yīng)的原因。

miRNA 參與填充腫瘤微環(huán)境的不同細(xì)胞類型之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，試圖確定 miRNA 是否有助于KDM6B表達(dá)的調(diào)節(jié)。為此進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和文獻(xiàn)綜述，確定靶向KDM6B 3'-UTR的miRNA。確定了miR-138-5p、miR-146a和miR-20a-3p作為候選miRNA。當(dāng)我們分析與MDA-MB-231細(xì)胞共培養(yǎng)后 THP-1 細(xì)胞中 miRNA 水平的變化時(shí)，發(fā)現(xiàn)miR-138-5p和miR-146a顯著增加，而miR-20a-3p減少?？紤]到 miRNA 水平通常與靶基因的水平呈負(fù)相關(guān)，接下來確認(rèn)了miR-138-5p或miR-146a是否抑制了KDM6B表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)是miR-138-5p而非miR-146a的異位表達(dá)抑制了THP-1細(xì)胞KDM6B的表達(dá)。序列分析表明，miR-138-5p 在KDM6B mRNA的 3-'UTR 中含有兩個(gè)潛在的靶位點(diǎn)。此外，KDM6B mRNA 3-'UTR 中 miR-138-5p 的靶結(jié)合序列在眾多不同物種中高度保守。熒光素酶報(bào)告基因檢測表明，miR-138-5p 的過表達(dá)抑制了KDM6B mRNA的 3'-UTR 驅(qū)動(dòng)的熒光素酶活性，但不會(huì)抑制突變的同源 3'-UTR。這些數(shù)據(jù)表明 miR-138-5p通過與其3'-UTR 結(jié)合來抑制KDM6B表達(dá)。

miR-138-5p介導(dǎo)癌細(xì)胞誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞KDM6B表達(dá)抑制

首先測量了表型不同的乳腺癌細(xì)胞系以及非致瘤細(xì)胞系中的 miR-138-5p 水平。當(dāng)miR-138-5p mimics轉(zhuǎn)染 MCF7 和 T47D 細(xì)胞過表達(dá) miR-138-5p 時(shí)，發(fā)現(xiàn)用MDA-MB-231細(xì)胞的 CM 處理或與過表達(dá) miR-138-5p的MCF7和 T47D細(xì)胞共培養(yǎng)增加了 THP-1 細(xì)胞表達(dá)的 miR-138-5p 水平。此外，與過表達(dá) miR-138-5p的MCF7和T47D細(xì)胞共培養(yǎng)抑制了THP-1細(xì)胞中KDM6B mRNA 和蛋白質(zhì)的表達(dá)。因此，得出結(jié)論，miR-138-5p 介導(dǎo)了THP-1 細(xì)胞與癌細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)的KDM6B表達(dá)抑制。

癌細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體miR-138-5p下調(diào)巨噬細(xì)胞中KDM6B的表達(dá)

接下來探索miR-138-5p的水平如何增加。為此測量了巨噬細(xì)胞中初級(jí) (pri-) 和前體 (pre-) miR-138 的水平。發(fā)現(xiàn)處理后THP-1細(xì)胞中pri-或pre-miR-138沒有增加，表明miR-138-5p是外源供應(yīng)的。此外，與用 RNase A 加 Triton X-100 處理相比，當(dāng)我們用 RNase A 處理 MDA-MB-23 的 CM 時(shí)，miR-138-5p的水平?jīng)]有變化。這些發(fā)現(xiàn)支持細(xì)胞外miR-138-5p被包裹在膜結(jié)構(gòu)中的結(jié)論。通過觀察到與未處理的CM相比，GW4869 處理的CM或外泌體耗盡的 CM 中miR-138-5p的水平顯著降低，獲得了進(jìn)一步的證據(jù)，表明外泌體miR-138-5p參與了KDM6B表達(dá)的調(diào)節(jié)。這些結(jié)果表明 miR-138-5p 被包裹在乳腺癌細(xì)胞釋放的外泌體中。

接下來研究了來自乳腺癌細(xì)胞的外泌體miR-138-5p是否介導(dǎo)了THP-1細(xì)胞中miR-138-5p水平的增加。發(fā)現(xiàn)外泌體抑制劑GW4869阻斷了由MDA-MB-231 細(xì)胞的CM處理引起的miR-138-5p水平的增加。此外，在THP-1細(xì)胞中檢測到 Cy3標(biāo)記的miR-138-5p，并與Dio標(biāo)記的外泌體膜共定位?？傊?，數(shù)據(jù)表明癌細(xì)胞分泌外泌體miR-138-5p被轉(zhuǎn)移到巨噬細(xì)胞。

當(dāng)測量外泌體miR-138-5p對(duì)巨噬細(xì)胞中KDM6B表達(dá)的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)外泌體的抑制阻斷了通過用 CM 處理細(xì)胞誘導(dǎo)的KDM6B抑制。MDA-MB-231衍生的外泌體的處理增加了THP-1細(xì)胞miR-138-5p的水平并抑制KDM6B的表達(dá)，這種作用在用miR-138-5p inhibitor處理的THP-1細(xì)胞中被消除。用miR-138-5p mimics轉(zhuǎn)染T47D細(xì)胞會(huì)增加外泌體miR-138-5p的水平。來自過表達(dá)miR-138-5p的T47D細(xì)胞的外泌體增加了miR-138-5p水平并抑制了THP-1細(xì)胞中KDM6B 的表達(dá)?？傊?，這些結(jié)果表明癌細(xì)胞分泌的外泌體 miR-138-5p 被遞送到巨噬細(xì)胞，在其中它抑制KDM6B。

外泌體 miR-138-5p 通過抑制KDM6B表達(dá)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化

為了確定miR-138-5p 誘導(dǎo)的KDM6B表達(dá)抑制是否影響巨噬細(xì)胞極化，在不同條件下培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜。首先，與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)抑制了編碼 IL-6、TNF-α和IL-1β的M1相關(guān)基因的表達(dá)，并增加了編碼 CD163、Arg1、IL-10、TGF-β 和M2相關(guān)基因的表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)顯示，MDA-MB-231細(xì)胞與THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)增加了CD163陽性巨噬細(xì)胞的百分比，當(dāng)這些細(xì)胞過表達(dá)KDM6B 時(shí)，CD163 陽性巨噬細(xì)胞的百分比被抑制。類似地，KDM6B 過表達(dá)抑制了用 miR-138-5p mimics轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞誘導(dǎo)的 M2 樣極化。與對(duì)照相比，用從表達(dá) miR-138-5p 的T47D細(xì)胞中分離的外泌體處理THP-1細(xì)胞降低了M1相關(guān)表型。相比之下，巨噬細(xì)胞表達(dá)的 M2 標(biāo)志物隨著巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物中 CD163 陽性細(xì)胞數(shù)量的增加而增加。

用從 MDA-MB-231 細(xì)胞中分離的外泌體處理 THP-1 細(xì)胞導(dǎo)致 M2 樣極化，這通過抑制 miR-138-5p 表達(dá)來挽救。此外，用 miR-138-5p mimics轉(zhuǎn)染或與過表達(dá) miR-138-5p的T47D 細(xì)胞的 CM 中分離的外泌體孵育增加了THP-1 細(xì)胞的增殖。Transwell 分析顯示，用來自MDA-MB-231 CM外泌體 miR-138-5p 孵育的巨噬細(xì)胞處理后，細(xì)胞的遷移增加。總之，數(shù)據(jù)表明外泌體miR-138-5p 通過抑制巨噬細(xì)胞中KDM6B 的表達(dá)來促進(jìn) M2 樣極化。

KDM6B 去甲基化酶活性促進(jìn) M1 相關(guān)基因表達(dá)

抑制KDM6B的組蛋白去甲基化酶活性會(huì)抑制其靶基因的轉(zhuǎn)錄。因此，使用雙熒光素酶測定來分析M1靶基因的啟動(dòng)子活性。KDM6B 的過表達(dá)特異性刺激了編碼促炎因子 IL-6、IL-1β 和 TNF-α 的基因的啟動(dòng)子活性。相反，沉默 KDM6B 導(dǎo)致其啟動(dòng)子活性受到抑制，并且KDM6B在THP-1細(xì)胞中的過表達(dá)降低了H3K27me3的水平，當(dāng)KDM6B表達(dá)受到抑制時(shí)，H3K27me3 的水平會(huì)增加。ChIP 分析顯示，與對(duì)照相比，THP-1 細(xì)胞中KDM6B 的過表達(dá)或敲低分別顯著增加或減少了 KDM6B 在這些啟動(dòng)子的不同區(qū)域的占有率。與這些發(fā)現(xiàn)一致，當(dāng)KDM6B在THP-1細(xì)胞中過表達(dá)或下調(diào)時(shí)，H3K27me3 向這些啟動(dòng)子的募集減少或增加。因此，KDM6B 的下調(diào)增加了 H3K27me3 的水平和編碼促炎因子的基因的轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制了 M1 極化。

外泌體miR-138-5p促進(jìn)乳腺癌向肺轉(zhuǎn)移

極化巨噬細(xì)胞在決定腫瘤細(xì)胞的表型方面起著重要作用。因此，用外泌體 miR-138-5p處理的M2巨噬細(xì)胞是否有助于乳腺癌小鼠異種移植模型中的腫瘤轉(zhuǎn)移。使用氯膦酸鹽去除小鼠的巨噬細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)移用源自T47D或過表達(dá)miR-138-5p 的T47D細(xì)胞的外泌體處理的Raw264.7細(xì)胞。通過尾靜脈靜脈注射4T1-熒光素酶細(xì)胞建立小鼠模型。使用體內(nèi)成像系統(tǒng)設(shè)施 (IVIS) 系統(tǒng)監(jiān)測轉(zhuǎn)移并計(jì)數(shù)肺中的轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)。與對(duì)照外泌體相比，用T47D-miR-138-5p外泌體處理的巨噬細(xì)胞移植小鼠的肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率顯著更高。當(dāng)確定腫瘤組織中CD206和 Arg1陽性M2巨噬細(xì)胞的百分比時(shí)，發(fā)現(xiàn)使用 T47D-miR-138-5p 外泌體處理的巨噬細(xì)胞增加了 M2 細(xì)胞的百分比?？傊?，這些結(jié)果表明外泌體miR-138-5p誘導(dǎo)的M2巨噬細(xì)胞促進(jìn)了乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移。