外泌體miR-101-3p和miR-423-5p抑制成髓細(xì)胞瘤的發(fā)生

外泌體miRNAs與多種腫瘤的發(fā)展和進(jìn)展有關(guān)。然而，它們是否有助于髓母細(xì)胞瘤(MB)的發(fā)生仍有待闡明。我們發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比，MB患者血漿分離的外泌體中有35個(gè)miRNA上調(diào)，5個(gè)miRNA下調(diào)。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在擴(kuò)大隊(duì)列中，MB患者血漿外泌體中miR-101-3p和miR-423-5p的表達(dá)明顯高于健康對(duì)照組，這些外泌體miRNAs可以通過(guò)外泌體傳遞到腫瘤細(xì)胞。miR-101-3p和miR-423-5p的體外功能分析表明，用相應(yīng)的模擬物處理MB細(xì)胞可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、集落形成能力、遷移能力和侵襲能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，miR-101-3p和miR-423-5p被發(fā)現(xiàn)通過(guò)直接靶向一個(gè)共同的基因FOXP4。miR-101-3p還靶向組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2，增強(qiáng)其抑瘤作用。利用MB裸鼠異種移植模型，我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miR-101-3p和miR-423-5p過(guò)表達(dá)抑制了體內(nèi)腫瘤的發(fā)生。該文于2021年7月發(fā)表于Cell Death & Differentiation（IF= 15.828）雜志上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）MB患者血漿來(lái)源的外泌體中miR-101-3p和miR-423-5p水平上調(diào)，這些miRNA可通過(guò)外泌體轉(zhuǎn)移到腫瘤細(xì)胞中

在初步篩選中，使用超離心法從MB患者和健康對(duì)照組的血漿中分離出外泌體。通過(guò)透射電子顯微鏡分析分離出的外泌體，確定外泌體的平均大小和形態(tài)，顯示出典型的直徑<150 nm的雙層球形結(jié)構(gòu)(圖1A)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證我們的外泌體制劑，我們通過(guò)western blot檢測(cè)了外泌體標(biāo)志物CD9、CD63和GM130的表達(dá)。分離的顆粒外泌體核心蛋白標(biāo)記CD9和CD63陽(yáng)性，GM130陰性(圖1B)。此外，我們通過(guò)miRNA-seq研究了血漿外泌體的miRNA表達(dá)譜。我們發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照組相比，MB患者中有35個(gè)miRNA上調(diào)，5個(gè)miRNA下調(diào)(圖1C)。研究發(fā)現(xiàn)，MB患者血漿來(lái)源的外泌體中miR-101-3p、miR-320b-3p、miR-20a-5p和miR-423-5p的表達(dá)高于健康對(duì)照組血漿來(lái)源的外泌體(圖1 D)。然后，我們通過(guò)qPCR檢測(cè)了擴(kuò)展隊(duì)列中差異表達(dá)的miRNA的表達(dá)水平。與健康對(duì)照組相比，MB患者血漿來(lái)源的外泌體中miR-101-3p和miR-423-5p的表達(dá)上調(diào)(圖1E)。我們還比較了MB患者和健康對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-101-3p和miR-423-5p的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MB患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-101-3p和miR-423-5p的表達(dá)水平更高(圖1F)。外周血來(lái)源的外泌體可被腫瘤細(xì)胞內(nèi)化（圖1G，1H）?？傊@些結(jié)果表明miR-101-3p和miR-423-5p在來(lái)源于MB患者血漿的外泌體中富集，并且可以通過(guò)這些外泌體輸送到腫瘤細(xì)胞。

2）MiR-101-3p和MiR-423-5p在體外MB細(xì)胞中作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用

我們使用CCK-8分析了miR-101-3p和miR-423-5p對(duì)MB細(xì)胞增殖能力的影響。與對(duì)照組相比，Daoy和D283 Med細(xì)胞中miR-101-3p或miR-423-5p的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖率降低（圖2A，B）。通過(guò)CCK-8分析，我們進(jìn)一步評(píng)估了添加來(lái)自MB患者血漿的外泌體對(duì)Daoy和D283 Med細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明，兩種細(xì)胞系的腫瘤細(xì)胞的增殖能力均受到顯著抑制（圖2C）。接下來(lái)，我們研究了miR-101-3p和miR-423-5p對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。與陰性對(duì)照組相比，任一miRNA的過(guò)表達(dá)都導(dǎo)致Daoy和D283 Med細(xì)胞的凋亡率顯著增加（圖2D，E）。此外，miR-101-3p或miR-423-5p的過(guò)表達(dá)抑制Daoy細(xì)胞的侵襲和遷移能力（圖2F-H）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)證實(shí)miR-101-3p和miR-423-5p在MB細(xì)胞中均發(fā)揮抗腫瘤作用，并且任一miRNA的上調(diào)均可抑制MB細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，同時(shí)也可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

3）單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞來(lái)源的外泌體miR-101-3p和miR-423-5p可轉(zhuǎn)移到MB細(xì)胞中

我們發(fā)現(xiàn)miR-101-3p和miR-423-5p在從MB患者血漿分離的PBMC和外泌體中均上調(diào)（圖1E，F），而這兩種miRNA在腫瘤組織中的表達(dá)低于相鄰正常腦組織（圖3A）。這表明含有這兩種miRNA的外泌體來(lái)源于免疫細(xì)胞，而不是腫瘤細(xì)胞。為了確定含有miR-101-3p和miR-423-5p的外泌體的來(lái)源，我們從THP-1單核細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分離外泌體，并檢測(cè)miR-101-3p和miR-423-5p的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)miR-101-3p和miR-423-5p在分離的外泌體中的表達(dá)高于THP-1細(xì)胞（圖3B）。然后，我們用來(lái)源于轉(zhuǎn)染miR-101-3p/miR-423-5p模擬物或miR-NC的THP-1細(xì)胞的外體培養(yǎng)Daoy細(xì)胞，并且觀察到這些外泌體也可以轉(zhuǎn)移到Daoy細(xì)胞中，培養(yǎng)后miR-101-3p和miR-423-5p的表達(dá)水平更高（圖3C，D）。與對(duì)照組相比，來(lái)自轉(zhuǎn)染miR101/miR-423模擬物的THP-1細(xì)胞上清液的外泌體顯著抑制Daoy細(xì)胞的增殖能力（圖3E）。我們用轉(zhuǎn)染miR-101-3p/miR-423-5p的THP-1單核細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)一步培養(yǎng)Daoy細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Daoy細(xì)胞的增殖能力受到顯著抑制，而在含GW4869的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后則無(wú)明顯變化（圖3F）。這些結(jié)果表明，對(duì)細(xì)胞增殖的影響至少部分歸因于外泌體的存在，并且GW4869處理可部分逆轉(zhuǎn)這些影響。與THP-1細(xì)胞類似，我們發(fā)現(xiàn)HMO6細(xì)胞也能分泌含有miR-101-3p和miR-423-5p的外泌體， MB組織中存在CD68+細(xì)胞（圖3G）。最后，我們從MB患者和健康對(duì)照者的外周血中分離CD14單核細(xì)胞。與對(duì)照組相比，在MB患者來(lái)源的CD14單核細(xì)胞培養(yǎng)上清中，外體miR-101-3p和miR-423-5p的表達(dá)更高（圖3H）?？傊?，這些結(jié)果表明MB患者的單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞分泌含有miR-101-3p和miR-423-5p的外泌體，這些外泌體可以轉(zhuǎn)移到MB細(xì)胞。

4）FOXP4是miR-101-3p和miR-423-5p的靶點(diǎn)

為了進(jìn)一步了解miR-101-3p和miR-423-5p如何影響腫瘤進(jìn)展，我們使用TargetScan和RNA22預(yù)測(cè)工具確定了它們的潛在靶點(diǎn)。我們選擇了6個(gè)在兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中均被miRNA調(diào)控的基因作為潛在靶點(diǎn)進(jìn)行評(píng)估，分別是FOXP4、PLCB1、ANKRD52、ANGPTL2、DLGAP3、a和DCUN1D3(圖4A)。由于FOXP4已知在胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生中有作用，因此選擇該基因進(jìn)行進(jìn)一步研究。經(jīng)western blotting檢測(cè)，轉(zhuǎn)染miR-101-3p或miR-423-5p的Daoy細(xì)胞顯示內(nèi)源性FOXP4蛋白表達(dá)降低(圖4B, C)。此外，HEK293T細(xì)胞中的熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示，這兩種miRNA的過(guò)表達(dá)均顯著抑制FOXP4-3'UTR驅(qū)動(dòng)的熒光素酶活性。然而，miR-101-3p或miR-423-5p與FOXP4 3'UTR共轉(zhuǎn)染后，熒光素酶活性未見(jiàn)顯著變化(圖4D)。這表明FOXP4可能是MB中miR-101-3p和miR423-5p的直接和功能靶點(diǎn)。

5）FOXP4在MB細(xì)胞中起致癌基因的作用

我們首先通過(guò)qPCR檢測(cè)FOXP4在MB腫瘤組織中的表達(dá)水平。FOXP4在MB腫瘤組織中的表達(dá)水平高于相鄰腦組織樣本(圖5A)。為了進(jìn)一步闡明靶向FOXP4是否可以介導(dǎo)MB腫瘤進(jìn)展，我們?cè)?/span>Daoy細(xì)胞中進(jìn)行了一系列功能檢測(cè)。使用siRNA抑制FOXP4表達(dá)(圖5B)導(dǎo)致細(xì)胞增殖、遷移和侵襲減少，而細(xì)胞凋亡率增加(圖5C-H)。這些結(jié)果強(qiáng)烈表明沉默FOXP4表型復(fù)制了miR-101-3p和miR-423-5p過(guò)表達(dá)對(duì)腫瘤進(jìn)展的抑制作用。綜上所述，這些結(jié)果表明FOXP4可能是MB腫瘤發(fā)生中的致癌基因。

6）EZH2在MB腫瘤組織中上調(diào)，是miR-101-3p的功能靶點(diǎn)，在MB腫瘤進(jìn)展中作為癌基因

如圖6A所示，腫瘤組織中EZH2 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織。我們還利用TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)研究了miR-101-3p在EZH2 3'UTR中是否存在匹配位點(diǎn)，并采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)證實(shí)了miR-101-3p與EZH2表達(dá)水平的相關(guān)性。轉(zhuǎn)染miR-101-3p mimic降低了由野生型EZH2 3’UTR驅(qū)動(dòng)的熒光素酶活性，而轉(zhuǎn)染突變型后未見(jiàn)顯著變化（圖6B）。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-101-3p也降低了在Daoy細(xì)胞中EZH2的mRNA和蛋白水平(圖6C, D)。接下來(lái)，為了研究EZH2在MB中的功能，我們使用siRNA下調(diào)其在Daoy細(xì)胞中的表達(dá)(圖6E)。功能檢測(cè)顯示，EZH2的下調(diào)抑制MB細(xì)胞活力、遷移和侵襲，同時(shí)促進(jìn)MB細(xì)胞凋亡(圖6F-K)。綜上所述，這些結(jié)果表明miR-101-3p可以直接靶向EZH2和FOXP4抑制MB。

7）miR-101-3p或miR-423-5p過(guò)表達(dá)抑制體內(nèi)腫瘤的發(fā)生

為了評(píng)價(jià)miR-101-3p和miR423-5p在體內(nèi)的抗腫瘤作用，我們將轉(zhuǎn)染LV16-miR-101-3p、LV16-miR-423-5p或LV16-NC的Daoy細(xì)胞皮下注射Balb/c雄性裸鼠。RT-qPCR檢測(cè)miR-101-3p和miR-423-5p在慢病毒轉(zhuǎn)染的Daoy細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)水平(圖7A)。腫瘤在注射后2周被發(fā)現(xiàn)，小鼠在植入后7周被處死(圖7B, C)。與對(duì)照組相比，LV16-miR-101-3p-和LV16-miR-423-5p處理組的腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制(圖7C, D)。如圖7E所示，miR-101-3p或miR- 423-5p治療后，腫瘤重量也顯著降低。免疫組化檢測(cè)EZH2、FOXP4和Ki67在異種移植瘤組織中的表達(dá)。在表達(dá)LV16-miR-101-3p-和LV16-miR-423-5p的腫瘤組織中FOXP4和Ki-67的水平均下調(diào) (圖7F, G)，而在LV16-miR-101-3p組EZH2也下調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明，miR-101-3p和miR-423-5p通過(guò)抑制FOXP4和EZH2的表達(dá)，在體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)。

   結(jié)論：我們鑒定了兩種外泌體miRNAs, miR-101-3p和miR-423-5p，在體外和體內(nèi)均是MB細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的關(guān)鍵調(diào)控因子，并確定這些作用是通過(guò)與FOXP4 3'UTR直接結(jié)合而發(fā)揮的。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miR-101-3p也可以靶向EZH2。我們的數(shù)據(jù)為MB的治療提供了一種新的治療策略。