circPLCE1編碼的NF-κB調(diào)控因子抑制結(jié)直腸癌進(jìn)展

NF-κB信號(hào)的組成性激活在結(jié)直腸癌(CRC)的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。然而，NF-κB信號(hào)通路過度激活的潛在機(jī)制在很大程度上尚不清楚。circPLCE1編碼的一種新蛋白circPLCE1-411被鑒定為NF-κB激活的關(guān)鍵蛋白。機(jī)制上，circPLCE1-411通過直接結(jié)合HSP90α/RPS3復(fù)合物促進(jìn)RPS3從復(fù)合物中分離，促進(jìn)了關(guān)鍵NF-κB調(diào)節(jié)因子RPS3的泛素依賴性降解，從而減少了CRC細(xì)胞中NF-κB核轉(zhuǎn)位。在功能上，circPLCE1抑制CRC細(xì)胞中的腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移，以及患者來源的異種移植瘤和原位異種移植瘤模型。臨床上，circPLCE1在CRC組織中下調(diào)，并與晚期臨床階段和低生存率相關(guān)。本文于2021年8月發(fā)表在Molecular Cancer（IF=27.401）期刊上。

技術(shù)路線

結(jié)果：

1）CRC中circPLCE1的特征及臨床意義

為了識(shí)別CRC中差異表達(dá)的circRNA，我們使用正常的人類腸道上皮細(xì)胞系和CRC細(xì)胞系進(jìn)行了總RNA測序。我們確定研究對象為circPLCE1 (hsa_circ_0019223，命名為circPLCE1)。我們分析了85對CRC樣本中的circPLCE1表達(dá)，證實(shí)了88.2%(75/85)的CRC患者中circPLCE1表達(dá)下調(diào)(圖1A和B)。進(jìn)一步分析顯示，circPLCE1在晚期臨床期或T期患者中表達(dá)下調(diào)(圖1C和D)。使用qRT-PCR分析circPLCE1在正常人腸上皮細(xì)胞株和CRC細(xì)胞株中的表達(dá)水平差異，得到了相似的結(jié)果(圖1E)。circPLCE1由PLCE1外顯子2反向剪接而成。通過Sanger測序證實(shí)了circPLCE1的反向拼接連接(圖1F)。PLCE1的環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本只能通過擴(kuò)增引物在cDNA中擴(kuò)增(圖1G)。circPLCE1還能抵抗RNase R酶切(圖1G和H)。半衰期試驗(yàn)進(jìn)一步表明，circPLCE1比circPLCE1線性mRNA更穩(wěn)定(圖1I)。通過核質(zhì)量分離試驗(yàn)和熒光原位雜交(FISH)檢測了circPLCE1的定位，結(jié)果顯示circPLCE1在CRC細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中富集(圖1J和K)。此外，circPLCE1在臨床晚期或T期患者中表達(dá)較低(圖1L)。Kaplan Meier曲線結(jié)果顯示，CRC患者circPLCE1表達(dá)較低與較差的生存率相關(guān)(圖1M)。這些數(shù)據(jù)驗(yàn)證了circPLCE1的特征和臨床意義。

2）circPLCE1體外抑制CRC細(xì)胞增殖和遷移

為了闡明circPLCE1在CRC中的功能，我們構(gòu)建了穩(wěn)定過表達(dá)circPLCE1的CRC細(xì)胞系。circPLCE1過表達(dá)抑制了CRC細(xì)胞集落形成、球體形成和不依賴于錨定的生長(圖2A-C)。此外，我們在兩個(gè)患者來源的器官(PDOs)中過表達(dá)了circPLCE1，結(jié)果也表明，circPLCE1降低了PDOs的生長(圖2D)。過表達(dá)circPLCE1也抑制細(xì)胞遷移和侵襲(圖2E和F)。此外，circPLCE1敲低顯著促進(jìn)了CRC細(xì)胞的生長、遷移和侵襲(圖2G-K)。綜上所述，circPLCE1在CRC細(xì)胞的增殖和遷移中發(fā)揮重要作用。

3）circPLCE1編碼一種新的蛋白circPLCE1–411

為了研究CRC中circPLCE1的詳細(xì)機(jī)制，我們首先使用編碼潛能評(píng)估工具分析了circPLCE1的編碼潛能，提示circPLCE1的蛋白編碼概率大于0.999。接下來，我們分析了circPLCE1的ORF。在circPLCE1中存在一個(gè)潛在的跨越連接ORF編碼一個(gè)411氨基酸蛋白(以下簡稱circPLCE1-411，圖3A)。通過雙熒光素酶分析驗(yàn)證了驅(qū)動(dòng)ORF翻譯的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的活性(圖3B)。接下來，我們構(gòu)建了flag標(biāo)記的質(zhì)粒以確定circPLCE1-411的存在。通過qRT-PCR檢測circPLCE1和線性PLCE1的表達(dá)(圖3C)。此外，我們發(fā)現(xiàn)PLCE1抗體在circPLCE1-411中具有相同的免疫原序列(圖3D)。Western blot結(jié)果顯示，在不影響PLCE1表達(dá)的情況下，PLCE1和flag抗體可在50 kDa左右檢測到circPLCE1-411 (圖3E)。此外，qRT-PCR和western blot檢測表明，circPLCE1或circPLCE1-411并不影響PLCE1的含量(圖3C和E)。為了鑒定該蛋白，我們用轉(zhuǎn)染了flag標(biāo)記的circPLCE1載體的細(xì)胞裂解液進(jìn)行免疫沉淀分析(圖3F和G)。結(jié)果證明circPLCE1編碼了這種新蛋白(圖3H)。為了探索circPLCE1-411的潛在臨床意義，我們通過western blot分析了CRC樣本和正常鄰近組織中circPLCE1-411的表達(dá)。結(jié)果顯示，circPLCE1-411在大多數(shù)CRC組織中下調(diào)(圖3I)。此外，circPLCE1-411表達(dá)與腫瘤的臨床分期和T分期呈負(fù)相關(guān)(圖3J和K)。

4）circPLCE1通過編碼circPLCE1-411抑制CRC細(xì)胞增殖和遷移

為了探索circPLCE1-411的生物學(xué)功能，我們進(jìn)行了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染circPLCE1或circPLCE1-411的CRC細(xì)胞可抑制集落形成、球的形成、不依賴于錨定的生長和PDOs生長。然而，用帶有起始密碼子突變體的circPLCE1載體(circPLCE1-ATGmut)轉(zhuǎn)染對CRC細(xì)胞增殖沒有影響(圖4A-H)。此外，細(xì)胞遷移和傷口愈合實(shí)驗(yàn)也顯示，轉(zhuǎn)染circPLCE1或circPLCE1-411載體可抑制CRC細(xì)胞遷移和侵襲，而轉(zhuǎn)染circPLCE1-ATGmut對CRC細(xì)胞遷移沒有影響(圖4I-L)。這些數(shù)據(jù)表明，circPLCE1通過編碼circPLCE1-411而不是circPLCE1的circRNA形式來抑制CRC細(xì)胞的增殖和遷移。

5）circPLCE1 - 411與HSP90α/RPS3復(fù)合物結(jié)合，促進(jìn)泛素依賴的RPS3降解，抑制NF - κB信號(hào)通路

根據(jù)前期研究和相關(guān)文獻(xiàn)我們推測circPLCE1-411可能與HSP90α/RPS3復(fù)合物結(jié)合，調(diào)控NF-κB信號(hào)通路，從而抑制CRC的進(jìn)展。我們在HCT8和DLD1細(xì)胞中通過免疫沉淀鑒定了circPLCE1-411和HSP90α/RPS3復(fù)合物之間的相互作用(圖5A)。我們發(fā)現(xiàn)RPS3蛋白水平隨著circPLCE1-411表達(dá)的增加而顯著降低(圖5B，上)。然而，RPS3 mRNA水平的豐度并沒有隨著circPLCE1-411表達(dá)的增加而改變(圖5B，底部)。這提示circPLCE1-411可能通過轉(zhuǎn)錄后機(jī)制調(diào)控RPS3。經(jīng)蛋白合成抑制劑環(huán)己亞胺CHX處理后，與對照組相比，HCT8和DLD1細(xì)胞中RPS3蛋白降解更快，circPLCE1-411表達(dá)增加(圖5C)。此蛋白酶體抑制劑MG132的作用減弱了circPLCE1-411對RPS3蛋白水平的影響(圖5D)。circPLCE1過表達(dá)的細(xì)胞中RPS3泛素化水平升高。相反，circPLCE1敲低后，RPS3的泛素化水平降低(圖5E)。接下來，我們用相同濃度的HA-HSP90α、HisRPS3和Myc-HSP70質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，但增加Flag-circPLCE1質(zhì)粒的濃度用于后續(xù)的免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，隨著circPLCE1-411表達(dá)量的增加，RPS3與HSP90α的互作性降低，而與HSP70的互作性增加(圖5F)。為了鑒定HSP90α與RPS3和circPLCE1-411相互作用的結(jié)構(gòu)域，我們生成了HSP90α截?cái)嗤蛔凅w，發(fā)現(xiàn)RPS3和circPLCE1-411的相互作用依賴于HSP90α的N端(圖5G)。

由于RPS3是NF-κB的重要調(diào)控因子，我們進(jìn)一步分析了circPLCE1對NF-κB信號(hào)通路的影響。Western blot結(jié)果顯示，過表達(dá)circPLCE1-411導(dǎo)致全細(xì)胞提取物中p-P65表達(dá)降低，細(xì)胞核中P65表達(dá)下調(diào)。正如預(yù)期的那樣，核P65的DNA結(jié)合活性也減弱了。相反，circPLCE1-411敲低則上調(diào)了全細(xì)胞提取物中p-P65的蛋白水平，增加了細(xì)胞核中P65的積累，增強(qiáng)了細(xì)胞核中P65的DNA結(jié)合活性(圖5H-I)。綜上所述，circPLCE1-411結(jié)合HSP90α的N端，促進(jìn)RPS3與HSP90α/RPS3復(fù)合物的解離，導(dǎo)致RPS3的泛素依賴性降解，抑制NF-κB信號(hào)。

6）circPLCE1-411在體內(nèi)抑制CRC生長和轉(zhuǎn)移

為了證實(shí)circPLCE1-411在體內(nèi)的功能，我們建立了原位異種移植瘤模型，觀察腫瘤生長和肝轉(zhuǎn)移情況。我們的結(jié)果顯示，載體組和circPLCE-ATGmut組均出現(xiàn)80%(4/5)的結(jié)直腸腫瘤形成，60%(3/5)和40%(2/5)的肝轉(zhuǎn)移。在circPLCE1和circPLCE1-411組中，5只小鼠中有2只(40%)形成了腫瘤較小的原位腫瘤，未發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移(圖6A-C)。此外，我們分析了人HPRT mRNA在肝臟中的表達(dá)，證實(shí)circPLCE1-411誘導(dǎo)肝轉(zhuǎn)移瘤負(fù)荷顯著增加(圖6D)。為了進(jìn)一步探索這些作用，我們應(yīng)用了PDX模型來評(píng)估circPLCE1-411通過腫瘤內(nèi)慢病毒注射的潛在療效。結(jié)果顯示，與載體和circPLCE-ATGmut慢病毒處理的腫瘤相比，circPLCE1或circPLCE1-411慢病毒處理的腫瘤導(dǎo)致腫瘤生長明顯放緩(圖6E和F)。此外，我們分離了PDX腫瘤，并通過H&E、ISH和IHC染色評(píng)估它們。并發(fā)現(xiàn)circPLCE1和circPLCE-ATGmut組的circPLCE1表達(dá)上調(diào)。circPLCE1或circPLCE1-411組中RPS3和p-P65的表達(dá)降低(圖6G和H)。綜合這些結(jié)果，我們確定了circPLCE1-411在體內(nèi)CRC腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用。

   結(jié)論：circPLCE1編碼的circPLCE1-411可與HSP90α/RPS3復(fù)合物結(jié)合，促進(jìn)關(guān)鍵的NF-κB調(diào)控因子RPS3從復(fù)合物中解離，從而促進(jìn)其泛素依賴性降解，最終導(dǎo)致NF-κB核易位減少。此外，circPLCE1表現(xiàn)出一種破壞NF-κB核易位的表觀遺傳機(jī)制，可作為一種新的、有前景的治療靶點(diǎn)和預(yù)后標(biāo)志物。