二甲雙胍通過抑制乳腺癌中 SLC7A11 的 UFMylation 誘導(dǎo)鐵死亡

鐵死亡是一種新定義的受調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡形式。靶向鐵死亡被認(rèn)為是一種新的抗癌策略。盡管越來越多的證據(jù)表明抗糖尿病二甲雙胍作為抗癌劑的潛在功效，但尚未完全闡明這種功效背后的確切機(jī)制。我們研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍以不依賴 AMPK 的方式誘導(dǎo)鐵死亡以抑制腫瘤生長。從機(jī)制上講，我們證明二甲雙胍增加細(xì)胞內(nèi) Fe2+ 和脂質(zhì) ROS 水平。具體而言，二甲雙胍通過抑制其 UFMylation過程來降低 SLC7A11 的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。此外，二甲雙胍與柳氮磺吡啶系統(tǒng)xc-抑制劑聯(lián)合使用可以協(xié)同作用誘導(dǎo)鐵死亡并抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。該研究首次證明二甲雙胍誘導(dǎo)鐵死亡的能力可能是其抗癌作用的一種新機(jī)制。此外，我們發(fā)現(xiàn)SLC7A11是一種新的UFMylation底物，并發(fā)現(xiàn)針對UFM1/SLC7A11通路可能是一種有前景的癌癥治療策略。本文于2021年6月發(fā)表在Journal of Experimental & Clinical Cancer Research（IF=11.161）期刊上。

技術(shù)路線

結(jié)果：

1）二甲雙胍觸發(fā)鐵依賴性細(xì)胞死亡

越來越多的證據(jù)表明二甲雙胍在臨床預(yù)防和治療乳腺癌方面具有巨大的潛力。我們的研究表明二甲雙胍能有效地抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，且呈劑量和時間依賴性(圖1A)。接下來，我們探討哪些細(xì)胞死亡形式參與二甲雙胍在乳腺癌細(xì)胞的抗癌活性。我們使用了多種細(xì)胞死亡抑制劑，包括Z-VAD-FMK(一種凋亡抑制劑)、necrosulfonamide (一種壞死抑制劑)和3-Methyladenine (3-MA，一種自噬抑制劑)。由于二甲雙胍已被證明可以調(diào)節(jié)細(xì)胞中的鐵穩(wěn)態(tài)，我們還引入了一種鐵清道夫，脫鐵胺(DFO)。結(jié)果顯示DFO恢復(fù)了二甲雙胍培養(yǎng)的T47D和MCF7細(xì)胞的活力(圖1B)。Z-VAD-FMK、necrosulfonamide和3-MA也較DMSO組略微提高了細(xì)胞存活率(圖1 B)。雖然二甲雙胍可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制自噬，但DFO的作用遠(yuǎn)比凋亡和自噬抑制劑顯著(圖1B)。此外，二甲雙胍促進(jìn)了鐵離子的積累，而DFO抑制了鐵離子水平的升高(圖1C和D)。碘化丙啶染色證實(shí)，DFO抑制了二甲雙胍誘導(dǎo)的T47D細(xì)胞死亡(圖1E)。綜上所述，二甲雙胍的抗癌作用需要鐵離子，而二甲雙胍誘導(dǎo)的鐵離子增加可能是二甲雙胍發(fā)揮抗癌作用的機(jī)制之一。

2）二甲雙胍可引起鐵死亡

為了闡明二甲雙胍和鐵死亡之間的關(guān)系，我們首先研究了二甲雙胍對鐵死亡形態(tài)學(xué)特征的影響。鐵透射電鏡顯示，二甲雙胍誘導(dǎo)MCF7和T47D細(xì)胞線粒體體積減小，膜密度增加(圖2A)。接下來，我們重點(diǎn)研究了二甲雙胍對鐵死亡生化過程的影響。我們用不同濃度的二甲雙胍處理乳腺癌細(xì)胞。研究結(jié)果顯示，二甲雙胍提高了細(xì)胞內(nèi)總ROS和脂質(zhì)ROS的水平，脂質(zhì)ROS的增加被ferroptosis抑制劑(DFO, Fer-1)抑制，而DFO和Fer-1本身對其影響不大(圖2B和C)。此外，二甲雙胍還能降低細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平(圖2D)。我們還檢測了鐵死亡抑制劑(DFO, Fer-1)是否可以逆轉(zhuǎn)二甲雙胍的抗癌作用。我們的結(jié)果表明，二甲雙胍處理T47D細(xì)胞時，DFO和Fer-1都能顯著挽救細(xì)胞活力(圖2E)。此外，碘化丙啶染色證實(shí)，fer1可抑制二甲雙胍誘導(dǎo)的T47D細(xì)胞死亡(圖2f)。綜上所述，二甲雙胍可引起鐵死亡。

3）二甲雙胍抑制SLC7A11的表達(dá)

為了明確二甲雙胍調(diào)控鐵死亡的具體分子機(jī)制，我們檢測了不同二甲雙胍濃度和處理時間對SLC7A11和GPX4表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，二甲雙胍能有效抑制T47D和MCF7細(xì)胞中SLC7A11的表達(dá)，且呈劑量和時間依賴性，而轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(圖3A和B)。但二甲雙胍對GPX4的表達(dá)無顯著影響(圖3A)。為了進(jìn)一步闡明SLC7A11在二甲雙胍抗癌作用中的作用，我們在T47D細(xì)胞中敲除或過表達(dá)SLC7A11。結(jié)果表明，SLC7A11過表達(dá)顯著逆轉(zhuǎn)二甲雙胍的抗癌作用和GSH的上調(diào)(圖3C和D)。這些結(jié)果提示二甲雙胍可以通過下調(diào)SLC7A11蛋白水平而誘導(dǎo)鐵死亡抑制癌癥。

4）二甲雙胍可調(diào)節(jié)UFM1的表達(dá)

UFMylation是一種泛素樣修飾，在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。通過對DRUGSURV數(shù)據(jù)庫的分析，我們發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以間接靶向UFM1(圖4A)。我們推測UFM1可能在二甲雙胍的抗癌作用中發(fā)揮一定的作用。結(jié)果顯示，二甲雙胍在一定程度上抑制了UFM1蛋白水平和UFMylation修飾水平(圖4B)，但不影響UFM1轉(zhuǎn)錄水平(圖4C)。為進(jìn)一步闡明UFM1對二甲雙胍抑瘤活性的影響，在T47D細(xì)胞中過表達(dá)UFM1。結(jié)果表明，過表達(dá)UFM1可有效阻斷二甲雙胍的抗癌作用，恢復(fù)二甲雙胍介導(dǎo)的GSH抑制水平(圖4 D和E)。綜上所述，二甲雙胍可能通過UFM1發(fā)揮抗癌作用。

5）二甲雙胍通過抑制SLC7A11的UFMylation而下調(diào)SLC7A11的表達(dá)

鐵死亡受到SLC7A11的密切調(diào)控，因此，探索其調(diào)控機(jī)制有助于進(jìn)一步找到誘導(dǎo)鐵死亡在癌癥治療中的新的治療靶點(diǎn)。我們首先檢測了SLC7A11和UFM1在不同乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)。結(jié)果顯示，SLC7A11與UFM1蛋白水平之間存在明顯的正相關(guān)(圖5A)。其次，生物信息學(xué)分析表明SLC7A11的表達(dá)與乳腺癌患者的預(yù)后存在顯著的負(fù)相關(guān)，而UFM1的表達(dá)與乳腺癌患者的預(yù)后沒有顯著的負(fù)相關(guān)(圖5 B)。為了確定SLC7A11和UFM1是否具有調(diào)控作用，我們在敲低UFM1后檢測SLC7A11表達(dá)的影響。結(jié)果表明，抑制UFM1可下調(diào)SLC7A11的表達(dá)，但不影響其轉(zhuǎn)錄水平(圖5C)。此外，抑制UFM1抑制了SLC7A11的蛋白穩(wěn)定性(圖5D)。為了確定SLC7A11是否可以被UFM1修飾，我們檢測了在UFM1敲低或不敲低情況下SLC7A11的UFMylation。我們發(fā)現(xiàn)SLC7A11是UFMylation的底物，其修飾的特異性通過敲除UFM1來確定(圖5E)。進(jìn)一步的UFMylation修飾試驗表明，SLC7A11 UFMylation可以被UfSP2抑制(圖5F)。這些發(fā)現(xiàn)將SLC7A11定義為UFM1的一種新的修飾底物。此外，二甲雙胍能有效抑制SLC7A11 UFMylation水平(圖5G)。綜上所述，二甲雙胍通過抑制SLC7A11的UFMylation來下調(diào)SLC7A11的蛋白穩(wěn)定性，從而誘導(dǎo)鐵死亡。

6）二甲雙胍可誘導(dǎo)不依賴于AMPK途徑的鐵死亡

目前，許多研究表明二甲雙胍可以直接作用于腫瘤細(xì)胞，通過AMPK依賴或AMPK不依賴的信號通路發(fā)揮其抗腫瘤生物學(xué)作用。我們的結(jié)果也表明二甲雙胍可以激活AMPK磷酸化(圖6A)。因此，為了確定AMPK通路是否參與二甲雙胍對鐵死亡的調(diào)控，我們首先明確AMPK的激活是否能誘導(dǎo)鐵死亡。結(jié)果顯示，AICAR，一種AMPK活化劑，增加脂質(zhì)ROS生產(chǎn)和抑制SLC7A11表達(dá)，表明AMPK活化可以誘導(dǎo)鐵死亡(圖6 E和F)。此外，二甲雙胍與化合物C聯(lián)合作用可協(xié)同提高脂質(zhì)ROS水平，抑制GSH水平和SLC7A11的表達(dá)(圖6 A, B, C)?；衔?/span>C本身可以增加脂質(zhì)ROS和Fe2+的產(chǎn)生(圖6 C和D)。總之，這些發(fā)現(xiàn)表明二甲雙胍或AMPK失衡均可誘導(dǎo)鐵死亡，而二甲雙胍可誘導(dǎo)鐵死亡而不涉及AMPK。

7）SAS與二甲雙胍的協(xié)同作用能有效抑制乳腺癌細(xì)胞

我們用二甲雙胍聯(lián)合SLC7A11抑制劑磺胺吡啶處理細(xì)胞。隨后，我們采用CCK8法檢測細(xì)胞活力，以確定二甲雙胍與磺胺吡啶聯(lián)合使用的協(xié)同效應(yīng)。結(jié)果表明，磺胺吡啶和二甲雙胍聯(lián)合作用可以協(xié)同抑制乳腺癌的增殖，特別是MDAMB231細(xì)胞(圖7A)。此外，磺胺吡啶與二甲雙胍聯(lián)合使用誘導(dǎo)線粒體體積減小，膜密度增加(圖7B)。脂質(zhì)過氧化檢測和谷胱甘肽檢測顯示，二甲雙胍和磺胺吡啶聯(lián)合使用顯著提高脂質(zhì)ROS水平，抑制谷胱甘肽的生成(圖7C, D)。DFO和Fer-1有效地減弱了二甲雙胍和磺胺吡啶聯(lián)合用藥的殺傷效果(圖7E)。我們的數(shù)據(jù)表明，磺胺吡啶和二甲雙胍聯(lián)合使用可協(xié)同誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化和鐵死亡，從而抑制乳腺癌的增殖。

8）磺胺吡啶可協(xié)同增強(qiáng)二甲雙胍的體內(nèi)抗癌活性

我們研究了磺胺吡啶是否能增強(qiáng)二甲雙胍的體內(nèi)抗癌活性。與DMSO組相比，二甲雙胍和磺胺吡啶明顯抑制腫瘤生長(圖8A和B)。在四組中，二甲雙胍和磺胺吡啶聯(lián)合抑制腫瘤生長的效果最高。此外，二甲雙胍和磺胺吡啶處理的小鼠表現(xiàn)出較低的UFM1和SLC7A11表達(dá)和較高的4-HNE表達(dá)(圖8C)。這些數(shù)據(jù)表明，磺胺吡啶可使癌細(xì)胞對二甲雙胍誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化和鐵死亡敏感，從而在體內(nèi)抑制腫瘤。

結(jié)論：這項研究是第一次建立二甲雙胍和鐵死亡之間的聯(lián)系。我們的數(shù)據(jù)提示了二甲雙胍的一種新的抗癌機(jī)制，即二甲雙胍通過抑制SLC7A11的UFMylation而誘導(dǎo)鐵死亡。