FBW7-NRA41-SCD1軸同步調(diào)控胰腺癌細(xì)胞凋亡和鐵死亡

   胰腺癌在美國(guó)癌癥死亡原因中排第四名。手術(shù)切除是胰腺癌治愈的唯一機(jī)會(huì)，但由于診斷較晚，大多數(shù)患者失去了手術(shù)切除的機(jī)會(huì)，并且，胰腺癌對(duì)大多數(shù)化療藥物的反應(yīng)很差。FBW7 (F-box and WD repeat domain-containing 7)是Skp1-Cul1-F-box (SCF)泛素連接酶復(fù)合物的底物識(shí)別成分，以多種癌蛋白為降解目標(biāo)，也是人類癌癥中最常見的突變基因之一，參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)過氧化。鐵死亡是一種依賴鐵的非凋亡細(xì)胞死亡形式，其特征是脂質(zhì)過氧化，在癌癥治療方面表現(xiàn)出巨大的潛力。目前有作者研究了FBW7對(duì)胰腺癌患者鐵死亡的影響，該研究發(fā)表在《Redox Biology》，IF：9.986。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. FBW7促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞脂質(zhì)過氧化

作者以分析在SW1990轉(zhuǎn)染pCMV-FBW7或空載體(GEO: accession numbers GSE76443)的高通量基因表達(dá)譜陣列研究FBW7在胰腺癌中的作用。以谷胱甘肽代謝和脂肪酸代謝相關(guān)的氨基酸為重點(diǎn)，結(jié)果顯示，FBW7WT和FBW7T205A下調(diào)絲氨酸、蛋氨酸、甘氨酸和胱氨酸，而FBW7R465H對(duì)絲氨酸、蛋氨酸、甘氨酸和胱氨酸無影響(圖1A)。這些氨基酸可被催化生成谷胱甘肽(圖1B)。作者檢測(cè)了PANC-1和SW1990穩(wěn)定細(xì)胞系異位表達(dá)空載體FBW7WT或FBW7T205A的GSH/GSSG比值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FBW7WT和FBW7T205A導(dǎo)致GSH/GSSG比值增加(圖1C)。接著采用BODIPY 581/591C11探針檢測(cè)氧化性脂質(zhì)，并通過流式細(xì)胞術(shù)和共聚焦顯微鏡進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)當(dāng)脂質(zhì)過氧化發(fā)生時(shí)，熒光由紅色變?yōu)榫G色，顯示FBW7WT和FBW7T205A導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化水平升高(圖1D和E)。這些結(jié)果表明FBW7WT和FBW7T205A促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的ROS和脂質(zhì)過氧化。

圖1 FBW7促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞脂質(zhì)過氧化

2. FBW7可增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞的鐵死亡

作者檢測(cè)了鐵死亡誘導(dǎo)物(RSL3、FIN56、erastin)對(duì)pan -1和SW1990穩(wěn)定細(xì)胞系異位表達(dá)FBW7WT、FBW7T205A或空載體的殺傷作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)FBW7WT和FBW7T205A均增強(qiáng)了鐵死亡誘導(dǎo)物對(duì)pan -1和SW1990細(xì)胞的殺傷作用，尤其是RSL3細(xì)胞(圖2A和2B)。此外，鐵死亡抑制劑ferrostatin-1(fer)可以逆轉(zhuǎn)FBW7過表達(dá)引起的脂質(zhì)過氧化(圖2C和D)，也部分挽救了被FBW7抑制的細(xì)胞活力(圖2E)。這表明FBW7增強(qiáng)了胰腺癌細(xì)胞的鐵死亡。 

圖2  FBW7可增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞的鐵死亡

3. FBW7通過下調(diào)SCD1促進(jìn)鐵死亡和細(xì)胞凋亡

結(jié)合高通量基因表達(dá)譜陣列與SCD1有抑制鐵死亡和凋亡的報(bào)道，作者推測(cè)FBW7可能通過抑制SCD1的表達(dá)來促進(jìn)鐵死亡。通過qRT-PCR和western blot驗(yàn)證了FBW7降低SCD1的mRNA和蛋白水平(圖3A)。接著作者構(gòu)建了pCMV-SCD1質(zhì)粒，在PANC-1和SW1990穩(wěn)定細(xì)胞系異位表達(dá)T205A突變體FBW7中過表達(dá)SCD1(圖3B)。然后發(fā)現(xiàn)SCD1過表達(dá)主要可以逆轉(zhuǎn)FBW7T205A引起的脂質(zhì)過氧化(圖3C和D)。此外， FBW7沉默能導(dǎo)致SCD1蛋白水平升高(圖3E)，也可以部分逆轉(zhuǎn)RSL3或SCD1抑制劑降低的細(xì)胞活力(CAY 10566)(圖3F)。SCD1過表達(dá)主要能減少FBW7T205A過表達(dá)引起的細(xì)胞凋亡(圖3G)。電鏡觀察中發(fā)現(xiàn)FBW7T205A過表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞萎縮、線粒體萎縮、脂滴形成，其結(jié)構(gòu)與RSL3與CAY 10566結(jié)合引起的結(jié)構(gòu)相似(圖3H)。這表明FBW7通過下調(diào)SCD1促進(jìn)鐵死亡和細(xì)胞凋亡。

圖3 FBW7通過下調(diào)SCD1促進(jìn)鐵死亡和細(xì)胞凋亡。

4. FBW7通過NR4A1抑制SCD1的轉(zhuǎn)錄

作者在基因表達(dá)譜中發(fā)現(xiàn)了NR4A家族的核受體(NR4A1, NR4A2)是FBW7下調(diào)的基因。作者因此采用qRT-PCR和western blot檢測(cè)了FBW7T205A過表達(dá)的PANC-1和SW1990細(xì)胞中NR4A1和NR4A2的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)FBW7T205A降低了NR4A1和NR4A2的mRNA和蛋白水平。此外，與FBW7T205A相比，FBW7R465H（顯性陰性FBW7突變體）僅略微降低了NR4A1、NR4A2和SCD1的表達(dá)(圖4A和B)。同時(shí)NR4A1沉默降低了SCD1的表達(dá)(圖4C和D) ，并且啟動(dòng)子實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NR4A1與SCD1啟動(dòng)子結(jié)合，促進(jìn)了SCD1的轉(zhuǎn)錄(圖4E和4F)。CHIP檢測(cè)顯示FBW7T205A過表達(dá)減少了NR4A1與SCD1啟動(dòng)子的結(jié)合，但過表達(dá)FBW7R465H無顯著差異(圖4G)。在熒光素酶檢測(cè)中也有相同的趨勢(shì)，MUT pGL3-SCD1啟動(dòng)子組沒有顯著差異(圖4H)。此外， NR4A1過表達(dá)可抵消FBW7 T205A對(duì)SCD1的影響(圖4I)。綜上所述，FBW7通過降低NR4A1與SCD1啟動(dòng)子的結(jié)合來抑制SCD1的轉(zhuǎn)錄。

圖4 FBW7通過NR4A1抑制SCD1的轉(zhuǎn)錄

5. 藥物抑制NR4A1可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的鐵死亡

此前文獻(xiàn)報(bào)道NR4A1拮抗劑DIM-C-pPhOH通過抑制NR4A1的反式激活活性而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在本實(shí)驗(yàn)中，熒光報(bào)告基因檢測(cè)顯示，DIM-C-pPhOH降低了熒光素酶活性，但在NR4A1結(jié)合位點(diǎn)(MUT)突變組，熒光素酶活性無明顯差異(圖5A)，這表明DIM-C-pPhOH通過NR4A1抑制SCD1的轉(zhuǎn)錄。此外，DIM-C-pPhOH還能降低pan -1和SW1990細(xì)胞中的SCD1蛋白(圖5B)。同時(shí)DIM-C-pPhOH顯著降低了RSL3在PANC-1和SW1990細(xì)胞中的IC50(半最大抑制濃度)(圖5C)。DIM-C-pPhOH也可增加脂質(zhì)過氧化水平，而鐵死亡抑制劑Fer-1可在很大程度上逆轉(zhuǎn)DIM-C-pPhOH引起的脂質(zhì)過氧化(圖5D和E)。此外， Fer-1、凋亡抑制劑 (zVAD)或SCD1活性的終產(chǎn)物(POA, OA)可以部分挽救DIM-C-pPhOH引起的細(xì)胞毒性效應(yīng)(圖5F)。同時(shí)在NR4A1沉默細(xì)胞中也得到了同樣的趨勢(shì)(圖5G)。

圖5藥物抑制NR4A1可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的鐵死亡

6. FBW7通過鐵死亡和細(xì)胞凋亡增強(qiáng)吉西他濱的細(xì)胞毒性作用

鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL3也可以增加吉西他濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞的致死率，而鐵死亡抑制劑Fer-1則具有相反的作用(圖6A和B)。這表明激活鐵死亡可以減輕胰腺癌患者對(duì)吉西他濱的耐藥性。然后測(cè)試了FBW7對(duì)吉西他濱敏感性的影響。過表達(dá)FBW7T205A可明顯增強(qiáng)吉西他濱的細(xì)胞毒作用，而過表達(dá)FBW7R465H則無明顯變化(圖6C和D)。用Fer-1或zVAD或兩者同時(shí)預(yù)處理FBW7T205A過表達(dá)細(xì)胞。結(jié)果顯示，Fer-1和zVAD均能部分挽救過表達(dá)FBW7T205A引起的細(xì)胞活力，而與Fer-1和zVAD聯(lián)合使用則能完全回避FBW7T205A引起的細(xì)胞活力(圖6E和F)。這些表明了FBW7通過鐵死亡和凋亡增強(qiáng)吉西他濱的細(xì)胞毒性作用。

圖6 FBW7通過鐵死亡和細(xì)胞凋亡增強(qiáng)吉西他濱的細(xì)胞毒性作用

7. 胰腺癌組織中FBW7與NR4A1、SCD1相關(guān)

作者檢測(cè)了在PADC患者組織中FBW7、NR4A1和SCD1表達(dá)之間的關(guān)系。對(duì)FBW7、NR4A1、SCD1進(jìn)行組織免疫熒光檢測(cè)，分別標(biāo)記不同的熒光信號(hào)。結(jié)果顯示，FBW7低表達(dá)時(shí)，NR4A1和SCD1高表達(dá)。FBW7高表達(dá)時(shí)則發(fā)現(xiàn)了相反的現(xiàn)象(圖7A)。免疫組化染色進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)果(圖7B)，表明了FBW7與NR4A1、SCD1呈負(fù)相關(guān)(圖7C)。IHC評(píng)分顯示胰腺癌組織中NR4A1與SCD1呈正相關(guān)(圖7D)。相應(yīng)的TCGA和GTEx數(shù)據(jù)也顯示相同結(jié)果(圖7E和F)。Kaplan-Meier生存曲線和log rank檢驗(yàn)顯示，PDAC中NR4A1高表達(dá)與較差的總生存(OS)顯著相關(guān)(圖7G)。而在PDAC中，高水平的SCD1也與更大的腫瘤大小、較差的腫瘤分化和較差的總生存率相關(guān)(圖7H)。

圖7胰腺癌組織中FBW7與NR4A1、SCD1相關(guān)

主要結(jié)論：

作者證實(shí)FBW7-NR4A1-SCD1顯著增強(qiáng)吉西他濱的細(xì)胞毒作用，為化療干預(yù)提供了新的靶點(diǎn)。此外，還證明激活鐵死亡和細(xì)胞凋亡極大地提高了吉西他濱的敏感性，這可能為胰腺癌的聯(lián)合治療提供策略。