脂肪干細胞生態(tài)位重組結(jié)直腸癌干細胞轉(zhuǎn)移機制
肥胖是癌癥惡化的一個重要風險因素，與肥胖相關(guān)的癌癥是導致死亡的主要原因之一。然而，在受肥胖影響的患者中，賦予癌細胞轉(zhuǎn)移特性的分子機制仍未被探索。在此，有作者通過重編程結(jié)腸癌(CRC)的4個共識分子亞型(CMS)，研究了內(nèi)臟脂肪組織(VAT)在CRC細胞間質(zhì)表型調(diào)控中的旁分泌效應，證明了微環(huán)境細胞因子是預測肥胖相關(guān)癌癥患者腫瘤行為的重要預后分子。該研究于2021年8月發(fā)表在《NATURE COMMUNICATIONS》，IF:12.121。
技術(shù)路線：
主要研究結(jié)果：
1. 內(nèi)臟脂肪基質(zhì)細胞促進CR-CSphCs的致瘤性和轉(zhuǎn)移活性
為了證實肥胖對癌細胞生物學行為的臨床影響，作者首先評估了脂肪組織在CRC進展中的潛在作用，以及健康體重(18.50 < BMI < 25)或受肥胖影響(BMI > 30)。對大腸癌患者隊列的薈萃分析顯示，肥胖與生存概率呈負相關(guān)（圖1a）。這種相關(guān)性也被一項大型隊列CRC患者的無進展生存(PFS)分析所證實，該分析認為BMI是獨立于分期和治療的陰性預后因素(圖1b)。對患有肥胖癥的大腸癌患者腫瘤切片的免疫組化分析強調(diào)，脂聯(lián)素高表達的脂肪細胞位于腫瘤浸潤前沿，分布在表達CDX2的腫瘤細胞之間，覆蓋了整個腫瘤腫塊的28% (圖1 c)。同樣，肥胖患者的大腸癌肝轉(zhuǎn)移在轉(zhuǎn)移灶邊緣，瘤周出芽附近顯示出明顯的脂肪細胞。在瘦肉型患者的原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌組織中未觀察到這種現(xiàn)象(圖1 c)。瘦CRC患者的腫瘤標本顯示有表達內(nèi)皮表型CD34 + / CD31 + /CD45的細胞(圖1d)。體外限制稀釋試驗表明，用V-ASC釋放因子處理可提高大量和富集的Wntlow-CRCSPCs的球形起始細胞頻率，重現(xiàn)Wnthigh細胞的克隆形成潛能（圖1e-g）。這一現(xiàn)象與Wntinactive (GFP-)細胞向Wntactive (GFP +)細胞的轉(zhuǎn)化相平行，證實了Wnt信號通路在CRC干細胞相關(guān)重編程中的關(guān)鍵作用(圖1h)。V-ASCs與CR-CSphCs共注入小鼠腎包膜下后，致癌細胞的頻率增加了 (圖1 i)。與更明顯的侵襲潛能相一致，在V-ASCs存在的體內(nèi)限制稀釋試驗顯示，即使在少量細胞被移植時，CMS2 CR-CSphCs也能產(chǎn)生轉(zhuǎn)移到肝臟和肺部的病變(圖1j)。這些數(shù)據(jù)表明ASCs和CRC細胞之間存在支持癌癥進展的串擾。
圖1浸潤腫瘤的VAT提高了CSphCs的轉(zhuǎn)移潛能
2. IL-6和HGF增加了CD44v6 + CR-CSCs的數(shù)量，產(chǎn)生NGF，有利于內(nèi)臟ASCs的遷移能力和內(nèi)皮轉(zhuǎn)分化
為了確定VAT促進轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子，接下來研究V-ASCs釋放的細胞因子是否會影響CR-CSphCs的轉(zhuǎn)移特性。與SASCs、CR-CSphCs和原代脂肪組織細胞(AT)相比，從肥胖CRC患者中分離出來的V-ASCs產(chǎn)生的IL-6和HGF更豐富 (圖2a)。IL-6和/或HGF的存在增強了CR-CSphCs的增殖能力和集落形成潛能(圖2b, c)，同時獲得侵襲表型以及干細胞和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達，如WNT5A、WNT5B、WNT7A、MMP2、MMP9、TWIST、NODAL、SDF1和ZEB2 (圖2d、e)。IL-6和HGF增加了ZEB2蛋白的表達，與其mRNA水平的上調(diào)一致(圖2f)。此外，阻斷IL-6和/或HGF可消除VASCS釋放蛋白誘導的CR-CSphCs的細胞增殖和遷移活性(圖2g, h)。因此，釋放到V-ASC CM中的V-ASC衍生的IL-6和HGF顯著促進CD44v6的表達(圖2i)，CD44v6是一種識別具有強大轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)直腸癌細胞的標記物，甚至誘導CD44v6球形細胞獲得CD44v6表達(圖2j)。由于ASCs以CD271的表達為特征，作者評估了其配體(由CSCs產(chǎn)生)在ASCs募集中的作用。與其他CD271配體家族成員BDNF和NTF4(圖2k)相比，CD44v6+細胞表達高水平的神經(jīng)生長因子(NGF)和NTF3 mRNA，并分泌NGF和NT-3，而這些神經(jīng)營養(yǎng)素很少被CD44v6-細胞釋放，除非暴露于V-ASC的CM(圖2l)。CD44v6+細胞釋放的NGF和NT-3促進ASCs募集，與NGF中和抗體的較弱作用相比，CD271中和抗體可完全阻止ASCs募集(圖2m)。此外，暴露于V-ASC CM的CR-CSPCs也能夠吸引ASC(圖2m，n)。因此，這些數(shù)據(jù)表明，ASC衍生的IL-6和HGF可以將CD44v6-初始細胞重新編程為CD44v6+細胞，從而通過分泌NGF和在腫瘤腫塊內(nèi)招募ASC來增加其轉(zhuǎn)移潛能。
圖2脂肪源性因子擴大了分泌NGF的CD44v6 +細胞片段，增強了ASCs的遷移能力
CD44v6 +細胞表達并產(chǎn)生高水平的VEGF，增加了ASCs的增殖率(圖3a, b)。另外，大多數(shù)CD271 + ASCs表達VEGFR(圖3c)，提示CD44v6 +細胞來源的VEGF可能觸發(fā)ASCs的血管生成信號。CD44v6+細胞的旁分泌活性誘導富集的CD34+/CD31 ASC向表達CD31的內(nèi)皮樣細胞轉(zhuǎn)分化(圖3d)。此外，暴露于CD44v6+細胞釋放的CM導致HUVEC內(nèi)皮細胞形成血管小管，類似于VEGF治療后形成的血管小管（圖3e和補充圖3d）。在共注射CR-CSphCs和V-ASCs生成的結(jié)CRC異種移植物中，與更明顯的血管密度相關(guān)的CD44v6 +細胞優(yōu)先定位在血管前部(圖3f)，這些發(fā)現(xiàn)表明CSC腔室參與了新血管生成和已有毛細血管的新生萌芽。
3. 內(nèi)臟釋放蛋白誘導CR-CSphCs的EMT
CR-CSphCs暴露于V-ASC CM中，證實了釋放蛋白在觸發(fā)轉(zhuǎn)移途徑中的重要作用，將轉(zhuǎn)錄組結(jié)構(gòu)從上皮/CMS2模式轉(zhuǎn)變?yōu)轭愃朴陂g質(zhì)CMS4的表型(圖3g)。同樣，對單獨使用V-ASC CM或培養(yǎng)基處理的CR-CSphCs進行的RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組分析顯示，有10個DEGs與CMS4特征相關(guān)(圖3h)。IL-6和HGF靶向消除VAT誘導的轉(zhuǎn)移活性，恢復CMS2 CR-CSphCs的非轉(zhuǎn)移表型(圖3i)。這些結(jié)果表明V-ASCs旁分泌活性驅(qū)動CRC球細胞向間充質(zhì)樣表型轉(zhuǎn)變，賦予它們轉(zhuǎn)移潛能。
圖3 VEGF誘導ASCs內(nèi)皮分化，激活CRC球細胞EMT程序
4. VAT通過調(diào)控ZEB2表達來管理EMT
利用分子特征數(shù)據(jù)庫(MSigDB)進行的基因集富集分析(GSEA)顯示，與代謝途徑相關(guān)的基因呈負富集，與EMT程序相關(guān)的基因呈正富集(圖4a)。上調(diào)E-box結(jié)合同源盒(ZEB)轉(zhuǎn)錄因子ZEB1和ZEB2，與釋放的蛋白重編程CMS2 CR-CSphCs向轉(zhuǎn)移前表型的能力一致(圖4b)。在V-ASC CM處理的CMS4和CMS2 CR-CSphCs中，有15個基因表達上調(diào)，6個基因表達下調(diào)(圖4c)。在V-ASCs細胞因子的誘導下，ZEB1和ZEB2的mRNA和蛋白水平均上調(diào)(圖4d, e)，有報道稱ZEB1和ZEB2可調(diào)節(jié)miR-200家族成員的表達并調(diào)節(jié)CRC中的EMT。對miRNA表達譜分析顯示，V-ASC CM處理后，CMS2 CR-CSphCs中miRNA-200家族成員，特別是miR-200a的表達下調(diào)，顯示出與CMS4 CR-CSphCs相似的miRNA水平(圖4f)。在使用V-ASCs CM處理的CR-CSphCs中，對大多數(shù)差異表達mirna網(wǎng)絡及其靶標的分析表明，ASC釋放的蛋白調(diào)控了大量聚集在miR-200a/ZEB成員軸上參與EMT過程的基因(圖4g)。在V-ASC CM作用下，CMS2細胞中ZEB2蛋白的表達水平與CMS4細胞中相似(圖4h)。此外，外源表達ZEB2可促進vimentin和CD44v6的表達，并增強腫瘤向遠處器官的擴散(圖4i、j)，表明ZEB2可能作為具有轉(zhuǎn)移特性的CRC細胞的功能標記物?？傊?，這些結(jié)果表明ZEB2是具有轉(zhuǎn)移潛能的CRC的功能性生物標志物。
圖4 V-ASCs增強ZEB2的表達，維持CR-CSPCs的轉(zhuǎn)移活性
5. IL-6/HGF阻斷降低VAT誘導的轉(zhuǎn)移形成
GSEA顯示，V-ASC釋放因子促進了CR-CSPCs中STAT3激活途徑相關(guān)基因的富集(圖5a)。免疫印跡分析顯示，V-ASC CM和IL-6/ HGF均通過增強酪氨酸和絲氨酸殘基中STAT3的磷酸化來激活CMS2細胞中的STAT3通路(圖5b)。根據(jù)結(jié)腸腫瘤切片免疫組化分析，STAT3的激活主要位于肥胖CRC患者的脂肪組織附近，細胞核染色突出。而在瘦骨嶙峋的患者中，與腫瘤間質(zhì)接觸的癌細胞表現(xiàn)出核p-STAT3的微弱存在(圖5c)。STAT3磷酸化抑制劑C188-9降低了由IL-6和HGF共同維持的STAT3的激活(圖5d)。此外，在IL-6和HGF的存在下，C188-9顯著降低了細胞增殖率和克隆活性，并恢復了CR-CSphCs中miR-200a和ZEB2的表達水平(圖5e h)。同樣，暴露于IL-6和HGF的CMS2 CR-CSphCs，其細胞形態(tài)發(fā)生了變化，獲得了與拉長形狀相關(guān)的獨特極化，而暴露于C188-9則減弱了這種極化(圖5i)。這些結(jié)果表明，脂肪微環(huán)境細胞因子通過STAT3/miR-200a/ZEB1/2軸驅(qū)動上皮相關(guān)CMS2 CR-CSphCs獲得間充質(zhì)表型。
圖5 IL-6和HGF通過激活STAT3誘導間質(zhì)表型
托西珠單抗和克唑替尼的聯(lián)合治療能夠恢復V-ASC CM對CR-CSphCs增殖和集落形成能力的影響(圖6a, b)。此外，這種雙靶點治療阻礙了v - asc誘導的miR- 200a下調(diào)，從而降低了ZEB1和ZEB2的表達，并降低了CMS2 CR-CSphCs的獲得性侵襲行為(圖6c-e)。為了確定托西珠單抗聯(lián)合克唑替尼是否可以用于輔助治療，防止內(nèi)臟肥胖誘導的轉(zhuǎn)移形成，將CMS2 crcsphc和V-ASCs共注射到小鼠脾臟中產(chǎn)生轉(zhuǎn)移性小鼠替身。脾切除術(shù)后5天，小鼠每周治療3次，持續(xù)3周(圖6f)。，這種治療方案顯著降低了V-ASC刺激的CMS2細胞的轉(zhuǎn)移性植入頻率，即使是在治療暫停8周后(圖6g)。此外，對112例CMS2 CRC患者的隊列分析顯示，ZEB2表達與RFS概率顯著負相關(guān)(圖6h, i)，提示ZEB2可能是一個推測的預后因素，可能與肥胖影響的癌癥患者相關(guān)。
圖6 IL-6和HGF靶向抑制CR-CSphCs VAT誘導的轉(zhuǎn)移能力
主要結(jié)論：
作者發(fā)現(xiàn)通過抑制STAT3 (C188-9)、IL-6R(托西利珠單抗)或c-MET(克唑替尼)靶向JAK/STAT通路的激活，會損害CMS2 CR-CSphCs的VAT驅(qū)動轉(zhuǎn)移促進活性(圖6i)。因此，由于脂肪釋放因子通過確定慢性炎癥狀態(tài)和增加遠處轉(zhuǎn)移形成的風險來促進CRC微環(huán)境的形成，這些藥物的臨床可用性可以被考慮作為肥胖相關(guān)癌癥患者的輔助治療策略。