CircMEMO1通過調節(jié)啟動子甲基化和TCF21的表達，進而控制肝癌進展和索拉非尼治療敏感性

肝細胞癌(HCC)作為一種常見的惡性腫瘤，腫瘤轉移給HCC患者預后帶來極大挑戰(zhàn)。本研究中，作者篩選出一個CircRNA，即CircMEMO1，闡明了CircMEMO1在HCC轉移中的抑制作用以及在索拉非尼治療敏感性的調節(jié)機制。本文于2021年5月發(fā)表在《 Molecular Cancer》雜志上，IF=15.302。

結果如下：

1．CircMEMO1 在HCC組織中表達顯著下調，與患者預后有關

作者首先將癌旁組織和肝細胞癌患者組織中的差異CircRNA進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)其中28個CircRNA顯著上調，18個顯著下調，其中CircMEMO1顯現(xiàn)出顯著差異（Fig. 1a）。為進一步對CircMEMO1進行研究，首先對CircMEMO1進行了擴增（Fig. 1b ），產物通過Sanger測序檢測CircMEMO1存在頭尾剪接區(qū)，RNAse R耐受性檢測進一步驗證預測的CircMEMO1為 CircRNA。

為確定CircMEMO1是否與肝細胞癌相關，作者研究了CircMEMO1在不同的HCC細胞系中的表達量，發(fā)現(xiàn)CircMEMO1在轉移細胞系中(MHCC97H，和HCCLM3)的水平低于非轉移系(Hep3B， PLC/PRF/5，和Huh7)。進一步研究CircMEMO1在HCC組織中的變化的關系，發(fā)現(xiàn)與癌旁樣本相比，CircMEMO1在HCC組織樣本中明顯下調（Fig. 1c），進一步分析CircMEMO1水平與HCC患者預后的關系，發(fā)現(xiàn)CircMEMO1在HCC樣本中的水平血管侵入有關（Fig. 1d）。生存分析顯示，CircMEMO1高水平的HCC患者的總生存（OS）和無病生存期（DFS）明顯優(yōu)于CircMEMO1表達水平低的HCC患者（Fig. 1e，f）。多變量Cox分析顯示，HCC組織中的CircMEMO1水平是HCC患者的獨立預后因素(Fig.1g)。這些數(shù)據(jù)表明CircMEMO1水平下調在HCC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

Figure 1 CircMEMO1在HCC組織中表達顯著下調，且與患者預后相關

2． CircMEMO1在體外和體內均能抑制肝癌細胞株的增殖、遷移和侵襲

為研究CircMEMO1在HCC進展中的生物學功能，CircMEMO1分別通過慢病毒在HCCLM3細胞系中過表達，在Huh-7細胞系中進行敲低處理（Fig. 2a）。細胞增殖、克隆形成和Transwell實驗表明，CircMEMO1被敲除后，Huh-7細胞的增殖、克隆生成和遷移能力顯著增強；在體外改變CircMEMO1水平， HCCLM3細胞系的增殖、克隆形成、侵襲和遷移能力削弱(Fig. 2b-g)。

為了進一步確定CircMEMO1是否作為腫瘤抑制因子，我們將對照HCCLM3或過表達的CircMEMO1細胞注射到裸鼠中，結果顯示，在移植6周后，過表達CircMEMO1的   HCCLM3細胞形成的異種移植瘤明顯小于由對照組細胞(Fig. 2h-j)。6只裸鼠中，過表達CircMEMO1的 HCCLM3細胞中只有1個 異種移植小鼠(16.7%)肺中有轉移性結節(jié)，而對照組6只異種移植小鼠中有5只(83.3%)有肺轉移跡象(Fig.2k，l)。因此，推測CircMEMO1在體內和體外均具有抑制腫瘤增殖、侵襲和轉移的作用。

Figure 2 CircMEMO1在體外和體內抑制肝癌細胞增殖和侵襲

3． CircMEMO1通過吞噬HCC細胞中的miR-106b-5p來調節(jié)TET/5hmC軸水平

已有研究報道，CircRNA可以作為miRNA海綿。靶基因預測顯示miR-106b-5p可能與CircMEMO1存在互作。為了研究CircMEMO1和miR-106b-5p之間的互作，作者設計了一個生物素化的線性CircMEMO1探針。qRT-PCR結果顯示，在Huh-7 和HCCLM3 細胞系中，miR-106b-5p均能被CircMEMO1探針吸附。此外，通過 miR-106b-5p來下拉Huh-7 和HCCLM3 細胞系中CircMEMO1，qRT-PCR結果也顯示miR-106b-5p能捕獲CircMEMO1 (Fig. 3a，b)。

為了進一步闡明CircMEMO1抑制HCC進展的分子機制，作者接下來開始鑒定miR-106b-5p的靶基因。以往的研究表明，TET基因中編碼將5位胞嘧啶(5-mC)氧化為5-羥甲基胞嘧啶的關鍵雙加氧酶，TET1和TET2在HCC組織中經常表現(xiàn)出下調表達。通過在線靶基因預測算法，作者發(fā)現(xiàn)TET1和TET2是miR-106b-5p的潛在候選靶基因。

為了探討HCC細胞系中不同miR-106b-5p表達水平對TET1和TET2表達的影響，作者分別在Huh-7細胞系中過表達miR-106b-5p，在HCCLM3 細胞系中對miR-106b-5p進行敲低處理，結果顯示，miR-106b-5p在Huh-7細胞系中上調顯著抑制TET1和TET2 mRNA和蛋白水平 (Fig. 3d)。熒光素酶報告試驗顯示野生型熒光活性顯著低于對照組(Fig. 3e)。接下來，作者檢測了5hmC和5-mC水平的變化來評估m(xù)iR-106b-5p是否可以通過靶向TET基因和調節(jié)5hmC水平來重塑表觀遺傳。正如所料，Huh-7 / miR -106b-5p-OE細胞的5hmC水平低于hu -7/Control細胞，在HCCLM3細胞系中抑制miR-106b-5p 明顯提高了5hmC的水平，但5-mC的水平沒有改變(Fig 3f，g)。

CircMEMO1充當miR-106b-5p海綿在HCC細胞中發(fā)揮生物學功能，作者進一步檢測了不同CircMEMO1水平的HCC細胞中TET1、TET2蛋白表達和gDNA 5hmC水平的變化。結果顯示，下調CircMEMO1降低了Huh-7細胞系中TET1和TET2蛋白的表達和gDNA 5hmC的水平，而過表達CircMEMO1則增加了HCCLM3細胞系中TET1和TET2的表達和gDNA 5hmC的水平(Fig 3h，i)。這些數(shù)據(jù)表明CircMEMO1可以充當miR-106b-5p海綿，調節(jié)肝癌細胞的TET/5hmc軸。

Figure 3 CircMEMO1通過海綿MiR-106b-5p調控HCC細胞中TET1/5hmC軸的水平

4． CircMEMO1水平與miR-106b- 5p/TET1/5hmC軸相關，高水平miR-106b- 5p會促進肝細胞癌進展

通過qRT-PCR分析了CircMEMO1和TET1/2 mRNA水平的相關性，作者觀察到CircMEMO1在HCC樣本中的表達水平與TET1的mRNA水平直接正相關，而與TET2的mRNA水平無關(Fig 4a， b)。這表明TET1可能在CircMEMO1引起的抑制肝癌的進展。

為了確定TET1蛋白在HCC進展和預測HCC患者預后中的作用，我們進一步通過免疫組化和TMA檢測TET1蛋白的表達。結果發(fā)現(xiàn)， TET1蛋白水平高的的HCC患者預后比TET1蛋白水平低的HCC患者總生存期更長，復發(fā)率更低(Fig 4c，d)。

miR-106b-5p和5hmC作為CircMEMO1調控HCC進展生物學功能的重要中間體，采用原位雜交和免疫組化染色的方法分別檢測HCC患者miR-106b-5p和5hmC水平之間的關系。結果顯示，HCC細胞系中，miR-106b-5p高表達的在人體內的5hmC水平較低，反之亦然(Fig 4e)。此外，HCC患者中表現(xiàn)出高水平miR-106b-5p和低水平5hmC往往預后較差，且復發(fā)率高。這些數(shù)據(jù)表明CircMEMO1可能通過調節(jié)miR-106b-5p/TET1/5hmC軸來影響肝癌中惡性細胞的特性，并促進肝癌的進展。

Figure 4 CircMEMO1水平與miR-106b-5p/TET1/5hmC軸相關

5． CircMEMO1通過MiR-106b-5p/TET1/調控EMT過程來抑制HCC轉移和干細胞特性

上皮-間質轉化(EMT)是癌細胞侵襲和轉移的關鍵過程。在HCC中，miR-106b-5p已被證實通過激活EMT過程促進HCC的遷移和轉移。研究發(fā)現(xiàn)CircMEMO1可以充當miR-106b-5p海綿，抑制HCC浸潤和進展。這些結果提示CircMEMO1可能通過miR-106 b-5p / TET1/5hmC軸調控EMT過程來抑制HCC轉移。為了證實該假設，作者研究了HCC細胞中EMT相關分子標記的表達。與相應細胞相比，sh-CircMEMO1 的HCC細胞上皮標記物E-cadherin表達較弱，間質標記物Fibronectin、Vimentin和Snail表達較強。此外，western blotting結果證實，在HCCLM3細胞中上調CircMEMO1的表達降低了間充質標記的表達纖維連接蛋白，波形蛋白和轉錄因子，但增加了上皮標記Ecadherin (Fig. 5a，b)。EMT過程已知與正常和惡性乳腺干細胞功能相關。我們進一步推測CircMEMO1可能也有抑制肝癌細胞的干性。值得注意的是，下調CircMEMO1的表達可以增加Huh-7細胞形成腫瘤球結構的能力，而過表達CircMEMO1則降低HCCLM3細胞形成腫瘤球結構的能力(Fig. 5c)。由于CircMEMO1在人類HCC樣本中與TET1 mRNA水平直接正相關，我們進一步試圖驗證TET1/ 5hmc軸是否在CircMEMO1或miR-106b-5p的功能中發(fā)揮直接作用。首先，TET1異位表達hu -7/sh-CircMEMO1或hu -7 miR-106b-5p-OE細胞，然后分析這些細胞的侵襲能力。我們發(fā)現(xiàn)，外源性表達TET1蛋白顯著降低了sh-CircMEMO1或miR-106b-5p過表達介導的增強的癌細胞侵襲(Fig.5d)。

Figure 5 CircMEMO1通過miR-106b-5p/TET1/5hmC軸調控EMT過程抑制HCC進展

6．CircMEMO1通過調節(jié)DNA去甲基化與TCF21的表達

作者假設CircMEMO1和miR-106b-5p可能調節(jié)TCF21基因啟動子的去甲基化并調節(jié)其表達，導致其同源靶點的變化。為了探索這種可能性，首先分析了TCGA數(shù)據(jù)庫HCC樣本中TCF21和miR-106b-5p/CDH1水平的關系。我們的結果顯示，TCF21 mRNA水平與miR-106b-5p水平呈負相關，而與CDH1水平呈正相關(Fig. 6a，b)。此外，與正常組織相比，在包括HCC在內的一系列癌癥中，TCF21 mRNA水平下調(Fig. 6c)，HCC患者樣品中TCF21基因啟動子甲基化水平明顯高于對照組(Fig. 6d，e)。因此，TCF21可能是一種重要的腫瘤抑制因子，在HCC樣本中由于基因啟動子甲基化異常而下調。我們進一步檢測了不同CircMEMO1或miR-106b-5p水平的HCC細胞中TCF21的表達，發(fā)現(xiàn)CircMEMO1可以促進肝癌細胞中TCF21的mRNA和蛋白表達，而miR-106b-5p可以抑制TCF21的表達(Fig. 6f, g)。hMeDIP-qPCR檢測結果顯示，在不同CircMEMO1水平下，TCF21表現(xiàn)出不同的5hmC水平(Fig.6h)。更重要的是，TCF21過表達通過抑制CircMEMO1或激活miR-106b-5p降低了轉移和EMT過程(Fig.6i, j)。這些結果表明CircMEMO1通過調控DNA啟動子去甲基化和TCF21的表達進而抑制肝癌進展作用。

Figure 6 CircMEMO1通過調節(jié)DNA去甲基化和TCF21表達抑制肝癌進展

7． 在HCC細胞中，CircMEMO1的水平調節(jié)抗腫瘤活性

索拉非尼作為晚期HCC患者標準治療方法，但耐藥性使其臨床療效有限。研究報道HCC進展中的EMT特性可能導致索拉非尼耐藥，因此作者推測，肝癌細胞中的CircMEMO1可能影響索拉非尼治療的敏感性。為了驗證這種假設，作者首先評估了索拉非尼治療后肝癌患者TCF21水平及與預后的關系。TGCA分析顯示，TCF21水平與索拉非尼治療后的HCC患者的總生存期相關 (Fig.7a)。然后，分析了40例接受索拉非尼和進行了肝切除術的晚期肝癌復發(fā)患者的回顧性數(shù)據(jù)，結果也表明TCF21水平與患者預后相關(Fig. 7b)。

隨后，作者檢測了CircMEMO1水平對的腫瘤生長和遷移能力變化的影響。索拉非尼在體外治療HCC細胞。MTT結果顯示，下調CircMEMO1表達可減弱10 mmol/L索拉非尼在HCC細胞中誘導的生長抑制作用，而過表達CircMEMO1可增強索拉非尼誘導的生長抑制作用(Fig.7c)。Matrigel分析表明，與對照Huh-7細胞相比，低CircMEMO1水平的Huh-7細胞具有更強的遷移能力，而CircMEMO1在HCCLM3細胞中過表達的結果則相反(Fig. 7d)。為了進一步確定CircMEMO1在調節(jié)索拉非尼治療敏感性中的作用，我們在上述40例晚期復發(fā)性肝細胞癌患者中的組織樣本中檢測了CircMEMO1和miR-106b-5p的水平，Kaplan-Meier生存分析顯示，低水平CircMEMO1組的總生存期遠低于高水平CircMEMO1組，而低水平的miR-106b-5p組的總生存期遠高于高水平miR-106b-5p組。因此，推斷CircMEMO1及其下游靶點miR-106b-5p可調節(jié)索拉非尼治療過程中的敏感性。

Figure 7 CircMEMO1調控索拉非尼治療肝癌細胞的抗腫瘤活性

circMEMO1是HCC轉移和細胞干性中是一個關鍵的腫瘤抑制因子，它通過miR-106b-5p/TET1/5hmC/TCF21軸和EMT過程發(fā)揮作用。circMEMO1作為一種關鍵的表觀遺傳修飾物，也可以調節(jié)肝癌對索拉非尼治療的敏感性。

參考文獻：

Dong, Z.R., et al., CircMEMO1 modulates the promoter methylation and expression of TCF21 to regulate hepatocellular carcinoma progression and sorafenib treatment sensitivity. Mol Cancer, 2021. 20(1): p. 75.