長鏈非編碼RNA (lncRNA)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用;然而,它們在胃癌轉(zhuǎn)移中的作用仍然是未知的。目前有作者通過lncRNA芯片篩選,發(fā)現(xiàn)差異表達的lncRNA,并通過功能驗證和調(diào)控機制研究,發(fā)現(xiàn)lnc-LEMGC通過直接抑制其結(jié)合蛋白DNA-PKcs的磷酸化和使DNA-PKcs下游EGFR信號失活而抑制胃癌轉(zhuǎn)移。該研究于2021年10月發(fā)表在《Cancer Letters》,IF:8.679。
技術(shù)路線:
主要研究結(jié)果:
1. 分析轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性胃癌組織之間的lncRNA差異表達譜
為了研究轉(zhuǎn)移性胃癌中lncRNA的整體表達譜,作者進行了lncRNA微陣列分析,以比較5例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(LNM)的胃癌病例和5例沒有LNM的胃癌病例。分層聚類顯示樣本的非隨機分配有兩個分支,lncRNA表達的不同模式可能反映胃癌轉(zhuǎn)移的分子機制(圖1A)。與非轉(zhuǎn)移性樣本相比,轉(zhuǎn)移性胃癌樣本中有225個lncRNAs下調(diào),228個lncRNAs上調(diào)(fold change≥2, P< 0.05,raw data >50)。
2. Lnc-LEMGC是胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的lncRNA
與無LNM的胃癌組織相比,有LNM的胃癌組織中有五種表達顯著上調(diào),其他五種表達顯著下調(diào)(圖1B)。為了驗證微陣列分析結(jié)果,通過定量PCR(qPCR)證實uc001pqq.1過度表達,而在LNM胃癌組織中AK095500、AK021443和ENST0000398098的表達降低(圖1C、D)。作者選擇AK095500(lnc-LEMGC)進行進一步研究。在90例具有廣泛臨床病理參數(shù)的原發(fā)性胃腫瘤中測定了lnc-LEMGC的表達水平。在轉(zhuǎn)移性胃癌組織中,Lnc-LEMGC表達下調(diào)10.7倍,因此,Lnc-LEMGC表達降低與胃癌轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)(圖1E)。在胃細胞系中也檢測了lnc-LEMGC的表達水平,表明lnc-LEMGC在高轉(zhuǎn)移人胃癌細胞系SGC 7901中的表達逐步增加,然后是低轉(zhuǎn)移細胞系AGS、KATOII、MKN45、MGC803、BGC823(圖1F)。低lnc-LEMGC表達與LNM陽性(P<0.0001)、遠處轉(zhuǎn)移陽性(P=0.0032)和AJCC分期(P=0.0333)密切相關(guān)。此外,Kaplan-Meier分析顯示lnc-LEMGC過表達與生存期更長有關(guān)(圖1G)。單分子RNA熒光原位雜交顯示lnc-LEMGC主要分布在細胞核中,核/細胞質(zhì)分離證實了這一點(圖1H和圖I)。因此,低水平的lnc-LEMGC可作為胃癌患者腫瘤轉(zhuǎn)移或預(yù)后較差的預(yù)測因子。
圖1 鑒定與驗證lnc-LEMGC作為抗胃癌轉(zhuǎn)移的lncRNA
3. Lnc-LEMGC在體內(nèi)外均抑制胃癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力
Lnc-LEMGC過表達明顯抑制了癌細胞的遷移和侵襲活性(圖2A)。在皮下移植模型中,腫瘤侵入高轉(zhuǎn)移性SGC 7901異種移植物的肌肉組織,而lnc-LEMGC過表達組顯示局部侵襲活性降低,并表現(xiàn)出良好的包封性。相反,腫瘤在低轉(zhuǎn)移BGC 823異種移植物中包裹良好,而lnc-LEMGC抑制BGC 823組中的腫瘤細胞顯示出多部位局部浸潤(圖2C,頂部)。在同質(zhì)轉(zhuǎn)移模型中,結(jié)果顯示lnc-LEMGC的上調(diào)顯著降低了肺轉(zhuǎn)移定植的發(fā)生率。反過來,lnc-LEMGC的缺失顯著增加了轉(zhuǎn)移定植(圖2C,中間)。在蘇木精和伊紅(H&E)染色切片中進一步評估肺轉(zhuǎn)移(圖2C,底部)。結(jié)果表明,lnc-LEMGC抑制胃癌細胞的局部侵襲和遠處轉(zhuǎn)移。
圖2. Lnc-LEMGC在體內(nèi)外均抑制胃癌細胞的遷移和侵襲能力
4. Lnc-LEMGC結(jié)合DNA依賴的蛋白激酶,催化亞基在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用
據(jù)報道,lncRNA與蛋白質(zhì)相互作用,調(diào)節(jié)分子信號通路。因此,假設(shè)lnc-LEMGC可能以類似的方式運行。為了驗證這一假設(shè),合成了生物素化的lnc-LEMGC正義和反義鏈(圖3A),并使用RNA-pull down鑒定了lnc-LEMGC結(jié)合蛋白。質(zhì)譜分析顯示,lnc-LEMGC-protein 復(fù)合物中含有6種蛋白,包括DNA依賴蛋白激酶、催化亞基(DNA-PKcs)、plectin、epiplakin、氨甲酰磷酸合成酶1 (CPS1)、vimentin和ATP5A(圖3B)。根據(jù)以往的研究,DNA-PKcs和vimentin參與了腫瘤的進展,因此選擇它們作為推測的lnc-LEMGC結(jié)合蛋白。將被RNA拉下的蛋白進行Western blot分析,檢測lnc-LEMGC與DNA-PKcs蛋白的結(jié)合。但未觀察到lnc-LEMGC和波形蛋白的聯(lián)合作用(圖3C)。 RIP試驗表明,與對照IgG相比,抗DNA-PKcs的抗體可以富集lnc-LEMGC(圖3D)。因此,lnc-LEMGC與DNA-PKcs直接結(jié)合。如上所述,過表達lnc-LEMGC的侵襲率降低,而siRNA介導(dǎo)的DNA-PKcs沉默阻斷了這一作用(圖3E-H)。這些結(jié)果表明lnc-LEMGC與DNA-PKcs聯(lián)合調(diào)控細胞侵襲。其次,采用免疫組化方法分析83例石蠟包埋的原發(fā)性胃癌的DNA-PKcs表達與臨床病理特征的關(guān)系(圖3I)。DNA-PKcs蛋白主要在胃癌細胞核中表達。DNA-PKcs陽性表達為lnc-LEMGC抑制胃癌遷移和侵襲。
圖3 Lnc-LEMGC與DNA-PKcs聯(lián)合發(fā)揮抑制轉(zhuǎn)移的作用
5. Lnc-LEMGC/DNA-PKcs復(fù)合物調(diào)控表皮生長因子受體信號
為了確定lnc-LEMGC/DNA-PKcs復(fù)合物在抑制腫瘤進展中的作用機制,作者在lnc-LEMGC表達的SGC7901細胞和陰性對照細胞之間進行轉(zhuǎn)錄組分析。與陰性對照組相比,lnc-LEMGC過表達的細胞中有1462個基因表達上調(diào),1929個基因表達下調(diào)(圖4A)。Lnc-LEMGC過表達顯著抑制了轉(zhuǎn)化生長因子α生長因子受體(EGFR, ErbB1)通路的mRNA表達(圖4B)。在胃癌細胞中,qPCR進一步證實了基因芯片的結(jié)果。Lnc-LEMGC過表達組中TGFα、ErbB1、SRC和蛋白酪氨酸激酶2 (FAK)的mRNA表達被抑制(圖4C)。此外,lnc-LEMGC的上調(diào)抑制了ErbB1、SRC、FAK和磷酸化FAK (p-FAK;圖4 d)。此外,Lnc-LEMGC沉默后蛋白表達增加(圖4E)。此外,當(dāng)DNA-PKcs表達被沉默時,可以觀察到下游基因ErbB1、SRC、FAK和p-FAK的蛋白表達降低(圖4F和G)。這些數(shù)據(jù)提示lnc-LEMGC/DNA-PKcs復(fù)合物通過下調(diào)ErbB1、SRC、FAK和pFAK參與的EGFR通路抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。
圖4 Lnc-LEMGC/DNA-PKcs復(fù)合物調(diào)控ErbB信號通路。
6. lnc-LEMGC與DNA-PKcs結(jié)合抑制后者的磷酸化
為了探討lnc-LEMGC對DNA-PKcs活性的影響,檢測lnc-LEMGC對DNA-PKcs磷酸化的影響。異位lnc-LEMGC表達抑制了2056絲氨酸(S2056)上的DNA-PKcs磷酸化水平,但沉默lnc-LEMGC則增強了其磷酸化水平(圖5A和B)。這些結(jié)果表明lnc-LEMGC表達與DNA-PKcs磷酸化呈負相關(guān)。利用lnc-LEMGC的3’端一系列缺失片段,確定lnc-LEMGC與DNA-PKcs相互作用的區(qū)域(圖5C)。在RNA-pull down中,Lnc-LEMGC從其3’端缺失至1800 nt與DNA PKcs結(jié)合,并抑制DNA PKcs S2056磷酸化。然而,1300-1800 nt中lnc-LEMGC缺失則消除了這些效應(yīng)(圖5D),表明這些nt對于lnc-LEMGC與DNA-PKcs的相互作用至關(guān)重要,后者抑制DNA-PKcs磷酸化。通過ATM激酶抑制劑可以抑制DNA-PKcs激酶活性,減少DNA-PKcs S2056的磷酸化(圖5E)。此外,當(dāng)DNA-PKcs磷酸化被抑制時,ErbB1、SRC、FAK和p-FAK的表達水平降低(圖5F)。ErbB1、SRC、FAK和p-FAK蛋白表達水平在全長組以及1300-1800 nt片段組均受到抑制(圖5G和H)。這些結(jié)果表明,lnc-LEMGC 的1300-1800 nt通過抑制S2056磷酸化和滅活EGFR信號來抑制DNA-PKcs的激活。
圖5 lnc-LEMGC與DNA-PKcs結(jié)合抑制后者的磷酸化
主要結(jié)論:
在這項研究中,在有或沒有LNM的胃癌組織中lncRNA表達存在顯著差異。轉(zhuǎn)移性胃癌組織中Lnc LEMGC顯著降低,與胃癌患者的腫瘤轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)。Lnc-LEMGC的1300-1800 nt片段與DNA-PKcs協(xié)同抑制DNA-PKcs S2056磷酸化,并通過下調(diào)ErbB1-SRC-FAK信號通路抑制腫瘤轉(zhuǎn)移(圖5I)。因此,lnc-LEMGC是胃癌進展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。
參考文獻:
Zhang H, Ma RR, Zhang G, et al. Long noncoding RNA lnc-LEMGC combines with DNA-PKcs to suppress gastric cancer metastasis. Cancer Lett. 2021; 524:82-90. doi: 10.1016/j.canlet.2021.09.042