長鏈非編碼RNA lnc-LEMGC聯(lián)合DNA-PKcs抑制胃癌轉(zhuǎn)移

   長鏈非編碼RNA （lncRNA）在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用；然而，它們?cè)谖赴┺D(zhuǎn)移中的作用仍然是未知的。目前有作者通過lncRNA芯片篩選，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的lncRNA，并通過功能驗(yàn)證和調(diào)控機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)lnc-LEMGC通過直接抑制其結(jié)合蛋白DNA-PKcs的磷酸化和使DNA-PKcs下游EGFR信號(hào)失活而抑制胃癌轉(zhuǎn)移。該研究于2021年10月發(fā)表在《Cancer Letters》，IF：8.679。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. 分析轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性胃癌組織之間的lncRNA差異表達(dá)譜

為了研究轉(zhuǎn)移性胃癌中lncRNA的整體表達(dá)譜，作者進(jìn)行了lncRNA微陣列分析，以比較5例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（LNM）的胃癌病例和5例沒有LNM的胃癌病例。分層聚類顯示樣本的非隨機(jī)分配有兩個(gè)分支，lncRNA表達(dá)的不同模式可能反映胃癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制（圖1A）。與非轉(zhuǎn)移性樣本相比，轉(zhuǎn)移性胃癌樣本中有225個(gè)lncRNAs下調(diào)，228個(gè)lncRNAs上調(diào)（fold change≥2， P< 0.05，raw data >50）。

2. Lnc-LEMGC是胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的lncRNA

與無LNM的胃癌組織相比，有LNM的胃癌組織中有五種表達(dá)顯著上調(diào)，其他五種表達(dá)顯著下調(diào)（圖1B）。為了驗(yàn)證微陣列分析結(jié)果，通過定量PCR（qPCR）證實(shí)uc001pqq.1過度表達(dá)，而在LNM胃癌組織中AK095500、AK021443和ENST0000398098的表達(dá)降低（圖1C、D）。作者選擇AK095500（lnc-LEMGC）進(jìn)行進(jìn)一步研究。在90例具有廣泛臨床病理參數(shù)的原發(fā)性胃腫瘤中測定了lnc-LEMGC的表達(dá)水平。在轉(zhuǎn)移性胃癌組織中，Lnc-LEMGC表達(dá)下調(diào)10.7倍，因此，Lnc-LEMGC表達(dá)降低與胃癌轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)（圖1E）。在胃細(xì)胞系中也檢測了lnc-LEMGC的表達(dá)水平，表明lnc-LEMGC在高轉(zhuǎn)移人胃癌細(xì)胞系SGC 7901中的表達(dá)逐步增加，然后是低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系AGS、KATOII、MKN45、MGC803、BGC823（圖1F）。低lnc-LEMGC表達(dá)與LNM陽性（P<0.0001）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移陽性（P=0.0032）和AJCC分期（P=0.0333）密切相關(guān)。此外，Kaplan-Meier分析顯示lnc-LEMGC過表達(dá)與生存期更長有關(guān)（圖1G）。單分子RNA熒光原位雜交顯示lnc-LEMGC主要分布在細(xì)胞核中，核/細(xì)胞質(zhì)分離證實(shí)了這一點(diǎn)（圖1H和圖I）。因此，低水平的lnc-LEMGC可作為胃癌患者腫瘤轉(zhuǎn)移或預(yù)后較差的預(yù)測因子。

圖1 鑒定與驗(yàn)證lnc-LEMGC作為抗胃癌轉(zhuǎn)移的lncRNA

3. Lnc-LEMGC在體內(nèi)外均抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力

Lnc-LEMGC過表達(dá)明顯抑制了癌細(xì)胞的遷移和侵襲活性（圖2A）。在皮下移植模型中，腫瘤侵入高轉(zhuǎn)移性SGC 7901異種移植物的肌肉組織，而lnc-LEMGC過表達(dá)組顯示局部侵襲活性降低，并表現(xiàn)出良好的包封性。相反，腫瘤在低轉(zhuǎn)移BGC 823異種移植物中包裹良好，而lnc-LEMGC抑制BGC 823組中的腫瘤細(xì)胞顯示出多部位局部浸潤（圖2C，頂部）。在同質(zhì)轉(zhuǎn)移模型中，結(jié)果顯示lnc-LEMGC的上調(diào)顯著降低了肺轉(zhuǎn)移定植的發(fā)生率。反過來，lnc-LEMGC的缺失顯著增加了轉(zhuǎn)移定植（圖2C，中間）。在蘇木精和伊紅（H&E）染色切片中進(jìn)一步評(píng)估肺轉(zhuǎn)移（圖2C，底部）。結(jié)果表明，lnc-LEMGC抑制胃癌細(xì)胞的局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

圖2. Lnc-LEMGC在體內(nèi)外均抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力

4. Lnc-LEMGC結(jié)合DNA依賴的蛋白激酶，催化亞基在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用

據(jù)報(bào)道，lncRNA與蛋白質(zhì)相互作用，調(diào)節(jié)分子信號(hào)通路。因此，假設(shè)lnc-LEMGC可能以類似的方式運(yùn)行。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，合成了生物素化的lnc-LEMGC正義和反義鏈（圖3A），并使用RNA-pull down鑒定了lnc-LEMGC結(jié)合蛋白。質(zhì)譜分析顯示，lnc-LEMGC-protein 復(fù)合物中含有6種蛋白，包括DNA依賴蛋白激酶、催化亞基（DNA-PKcs）、plectin、epiplakin、氨甲酰磷酸合成酶1 （CPS1）、vimentin和ATP5A（圖3B）。根據(jù)以往的研究，DNA-PKcs和vimentin參與了腫瘤的進(jìn)展，因此選擇它們作為推測的lnc-LEMGC結(jié)合蛋白。將被RNA拉下的蛋白進(jìn)行Western blot分析，檢測lnc-LEMGC與DNA-PKcs蛋白的結(jié)合。但未觀察到lnc-LEMGC和波形蛋白的聯(lián)合作用（圖3C）。 RIP試驗(yàn)表明，與對(duì)照IgG相比，抗DNA-PKcs的抗體可以富集lnc-LEMGC（圖3D）。因此，lnc-LEMGC與DNA-PKcs直接結(jié)合。如上所述，過表達(dá)lnc-LEMGC的侵襲率降低，而siRNA介導(dǎo)的DNA-PKcs沉默阻斷了這一作用（圖3E-H）。這些結(jié)果表明lnc-LEMGC與DNA-PKcs聯(lián)合調(diào)控細(xì)胞侵襲。其次，采用免疫組化方法分析83例石蠟包埋的原發(fā)性胃癌的DNA-PKcs表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（圖3I）。DNA-PKcs蛋白主要在胃癌細(xì)胞核中表達(dá)。DNA-PKcs陽性表達(dá)為lnc-LEMGC抑制胃癌遷移和侵襲。

圖3 Lnc-LEMGC與DNA-PKcs聯(lián)合發(fā)揮抑制轉(zhuǎn)移的作用

5. Lnc-LEMGC/DNA-PKcs復(fù)合物調(diào)控表皮生長因子受體信號(hào)

為了確定lnc-LEMGC/DNA-PKcs復(fù)合物在抑制腫瘤進(jìn)展中的作用機(jī)制，作者在lnc-LEMGC表達(dá)的SGC7901細(xì)胞和陰性對(duì)照細(xì)胞之間進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。與陰性對(duì)照組相比，lnc-LEMGC過表達(dá)的細(xì)胞中有1462個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，1929個(gè)基因表達(dá)下調(diào)（圖4A）。Lnc-LEMGC過表達(dá)顯著抑制了轉(zhuǎn)化生長因子α生長因子受體（EGFR, ErbB1）通路的mRNA表達(dá)（圖4B）。在胃癌細(xì)胞中，qPCR進(jìn)一步證實(shí)了基因芯片的結(jié)果。Lnc-LEMGC過表達(dá)組中TGFα、ErbB1、SRC和蛋白酪氨酸激酶2 （FAK）的mRNA表達(dá)被抑制（圖4C）。此外，lnc-LEMGC的上調(diào)抑制了ErbB1、SRC、FAK和磷酸化FAK （p-FAK；圖4 d）。此外，Lnc-LEMGC沉默后蛋白表達(dá)增加（圖4E）。此外，當(dāng)DNA-PKcs表達(dá)被沉默時(shí)，可以觀察到下游基因ErbB1、SRC、FAK和p-FAK的蛋白表達(dá)降低（圖4F和G）。這些數(shù)據(jù)提示lnc-LEMGC/DNA-PKcs復(fù)合物通過下調(diào)ErbB1、SRC、FAK和pFAK參與的EGFR通路抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。

圖4 Lnc-LEMGC/DNA-PKcs復(fù)合物調(diào)控ErbB信號(hào)通路。

6. lnc-LEMGC與DNA-PKcs結(jié)合抑制后者的磷酸化

為了探討lnc-LEMGC對(duì)DNA-PKcs活性的影響，檢測lnc-LEMGC對(duì)DNA-PKcs磷酸化的影響。異位lnc-LEMGC表達(dá)抑制了2056絲氨酸（S2056）上的DNA-PKcs磷酸化水平，但沉默lnc-LEMGC則增強(qiáng)了其磷酸化水平（圖5A和B）。這些結(jié)果表明lnc-LEMGC表達(dá)與DNA-PKcs磷酸化呈負(fù)相關(guān)。利用lnc-LEMGC的3’端一系列缺失片段，確定lnc-LEMGC與DNA-PKcs相互作用的區(qū)域（圖5C）。在RNA-pull down中，Lnc-LEMGC從其3’端缺失至1800 nt與DNA PKcs結(jié)合，并抑制DNA PKcs S2056磷酸化。然而，1300-1800 nt中lnc-LEMGC缺失則消除了這些效應(yīng)（圖5D），表明這些nt對(duì)于lnc-LEMGC與DNA-PKcs的相互作用至關(guān)重要，后者抑制DNA-PKcs磷酸化。通過ATM激酶抑制劑可以抑制DNA-PKcs激酶活性，減少DNA-PKcs S2056的磷酸化（圖5E）。此外，當(dāng)DNA-PKcs磷酸化被抑制時(shí)，ErbB1、SRC、FAK和p-FAK的表達(dá)水平降低（圖5F）。ErbB1、SRC、FAK和p-FAK蛋白表達(dá)水平在全長組以及1300-1800 nt片段組均受到抑制（圖5G和H）。這些結(jié)果表明，lnc-LEMGC 的1300-1800 nt通過抑制S2056磷酸化和滅活EGFR信號(hào)來抑制DNA-PKcs的激活。

圖5 lnc-LEMGC與DNA-PKcs結(jié)合抑制后者的磷酸化

主要結(jié)論：

在這項(xiàng)研究中，在有或沒有LNM的胃癌組織中lncRNA表達(dá)存在顯著差異。轉(zhuǎn)移性胃癌組織中Lnc LEMGC顯著降低，與胃癌患者的腫瘤轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。Lnc-LEMGC的1300-1800 nt片段與DNA-PKcs協(xié)同抑制DNA-PKcs S2056磷酸化，并通過下調(diào)ErbB1-SRC-FAK信號(hào)通路抑制腫瘤轉(zhuǎn)移（圖5I）。因此，lnc-LEMGC是胃癌進(jìn)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。

參考文獻(xiàn)：

Zhang H, Ma RR, Zhang G, et al. Long noncoding RNA lnc-LEMGC combines with DNA-PKcs to suppress gastric cancer metastasis. Cancer Lett. 2021; 524:82-90. doi: 10.1016/j.canlet.2021.09.042