TNF-α介導(dǎo)的ELMO1 m6A修飾引發(fā)強(qiáng)直性脊柱炎間充質(zhì)干細(xì)胞的定向遷移

強(qiáng)直性脊柱炎（AS）是一種常見(jiàn)的風(fēng)濕性疾病，間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells, MSC)是在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種多能成體干細(xì)胞。AS患者的間質(zhì)干細(xì)胞 (AS-MSC)導(dǎo)致了病態(tài)的成骨和韌帶聯(lián)合形成。本文中，作者闡明了TNF-α能介導(dǎo)ELMO1表達(dá)，在脊椎關(guān)節(jié)炎的治療中發(fā)揮積極作用。本文于2021年5月發(fā)表在《 Nature communications》雜志上IF=12.121。

技術(shù)路線：

1.TNF-α誘導(dǎo)AS-MSC體外定向遷移

從15名AS患者中分離出活動(dòng)期的間質(zhì)干細(xì)胞(AS-MSC)，從15名年齡和性別相匹配的健康供體中獲得HC-MSC。之前的研究表明，AS-MSC增強(qiáng)單核細(xì)胞遷移，增加促炎巨噬細(xì)胞極化。在本研究中，遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，AS-MSC的遷移數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于HC-MSC(Fig 1a)，且這種差異能被TNF-α中和抗體糾正 (Fig 1a)。說(shuō)明巨噬細(xì)胞能通過(guò)分泌TNF-α增強(qiáng)AS-MSC的遷移能力。通過(guò)100 ng/ml TNF-α處理， AS-MSC遷移數(shù)量明顯大于HC-MSC。在低濃度TNF-α刺激下，HC-MSC和AS-MSC之間沒(méi)有觀察到差異(0,10，和50 ng / ml) (Fig. 1b)。傷口愈合實(shí)驗(yàn)表明，與HC-MSC相比， 100 ng/ml TNF-α處理的AS-MSC遷移面積越大 (Fig. 1c)。通過(guò)趨化試驗(yàn)進(jìn)一步研究研究定向遷移能力。結(jié)果顯示，AS-MSC比HC-MSC更有可能向TNF-α遷移。AS-MSC的運(yùn)移指數(shù)、速度和方向性均較高于HC-MSC(Fig. 1d)。這些結(jié)果表明，相對(duì)高濃度的TNF-α可增強(qiáng)體外AS-MSC的定向遷移。

Figure 1.TNF-α誘導(dǎo)AS-MSC體外定向遷移增強(qiáng)

2.TNF-α可加速AS-MSC在體內(nèi)的定向遷移

為了進(jìn)一步研究TNF-α是否誘導(dǎo)AS-MSC在體內(nèi)遷移，作者將MSC/Fluc移植并將TNF-α注射到裸鼠中，隨后進(jìn)行生物發(fā)光實(shí)驗(yàn)和免疫組化實(shí)驗(yàn)(Fig 2a)。從第0天到第5天，MSC的遷移面積逐漸增大。在MSC注射后第3天到第5天，AS-MSC的生物發(fā)光面積大于HC-MSC(Fig 2b)。此外，免疫組化分析顯示，AS-MSC遷移數(shù)量，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于HC-MSC(Fig. 2C)。這些結(jié)果表明，高濃度TNF-α處理后，AS-MSC在體內(nèi)的遷移能力強(qiáng)于HC-MSC。

Figure 2. TNF-α可加速AS-MSC在體內(nèi)的定向遷移

3.TNF-α誘導(dǎo)AS-MSC中ELMO1表達(dá)上調(diào)

將未經(jīng)100 ng/ml TNF-Α處理和經(jīng)過(guò)100 ng/ml TNF-α處理的HC-MSC和AS-MSC進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。聚類分析顯示，是否采用 TNF-α和TNF-α處理的在AS-MSC和HC-MSC之間都觀察到顯著差異(Fig.3a)。 PCA顯示用100ng/ml TNF-α處理的AS-MSC表達(dá)譜也與HC-MSC存在顯著差異(Fig.3b)。通過(guò)維恩圖分析，鑒定出489個(gè)關(guān)鍵的差異表達(dá)mRNA(Fig. 3c)。通過(guò)GO分析，發(fā)現(xiàn)這489個(gè)mRNA在炎癥反應(yīng)、趨化性和生物過(guò)程類的趨化因子介導(dǎo)的信號(hào)通路中富集，KEGG分析顯示，前3位富集途徑為“細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用”、“趨化因子信號(hào)通路”和“細(xì)胞粘附分子(Fig. 3d)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，AS-MSC中ELMO1顯著上調(diào)，它是趨化因子信號(hào)通路的中心交點(diǎn)(Fig. 3e)。PCR結(jié)果也與測(cè)序數(shù)據(jù)一致，在TNF-α處理后，MSC中ELMO1的表達(dá)增加，TNF-α處理的AS-MSC中ELMO1的表達(dá)遠(yuǎn)高于TNF-α處理的HC-MSC(Fig.3F)。通過(guò)western blotting發(fā)現(xiàn)蛋白水平上也明顯提高 (Fig. 3g)。細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)結(jié)果表明，TNF-α刺激后AS-MSC的ELMO1熒光強(qiáng)度高于HC-MSC (Fig. 3h)。已有研究發(fā)現(xiàn)，ELMO1通過(guò)與其他細(xì)胞的DOCK蛋白結(jié)合，激活Rac1并促進(jìn)趨化作用。 MSC中活性Rac1水平也隨著TNF-α濃度的增加而增強(qiáng)。而AS-MSC中的活性Rac1水平顯著高于100 ng/ml TNF-α處理的HC-MSC(Fig.3i)。

此外，通過(guò)Co-IP和LC-MS/MS分析鑒定的蛋白-蛋白相互作用，結(jié)果表明MSC中的ELMO1主要結(jié)合DOCK1、DOCK4、DOCK5、ELMO2和NCKAP1， HC-MSC和AS-MSC中的相互作用也是相同。此外，抑制DOCK1可以抵消因ELMO1過(guò)表達(dá)而上調(diào)的活性Rac1水平，這表明在TNF-α處理的MSC中，ELMO1結(jié)合DOCK1促進(jìn)Rac1活性。

Figure 3. TNF-α導(dǎo)致AS-MSC中ELMO1表達(dá)升高

4.TNF-α介導(dǎo)的ELMO1表達(dá)促進(jìn)MSC遷移

在用100 ng/ml TNF-處理的AS-MSC中抑制ELMO1， Transwell實(shí)驗(yàn)中遷移細(xì)胞數(shù)量和創(chuàng)面愈合實(shí)驗(yàn)中的遷移面積的結(jié)果與HC-MSC相同(Fig. 4a， b)。此外，lv - ELMO1轉(zhuǎn)染的AS-MSC在裸鼠體內(nèi)的生物發(fā)光面積也較lv - NC轉(zhuǎn)染的AS-MSC少，與HC-MSC無(wú)差異(Fig.4c)。在經(jīng)過(guò)TNF-α處理的lv - elmo1轉(zhuǎn)染的AS-MSC中，下游活性Rac1水平也明顯減弱，達(dá)到與TNF-α處理的HC-MSC相同的水平。

作者構(gòu)建了OE-ELMO1載體，并在基因和蛋白水平上證實(shí)了過(guò)表達(dá)效率，NC組與OE-ELMO1組增殖能力相當(dāng)。Transwell和傷口愈合實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)ELMO1在HC-MSC中表達(dá)增加時(shí)，它們的遷移能力在100 ng/ml TNF-α刺激下顯著提高，幾乎達(dá)到AS-MSC的能力。通過(guò)對(duì)生物發(fā)光遷移區(qū)域的評(píng)價(jià)進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果。與AS-MSC相似，OE-ELMO1轉(zhuǎn)染的HC-MSC活性Rac1水平高于對(duì)照組HC-MSC(Fig.4 h)。這些結(jié)果表明TNF-α能刺激介導(dǎo)的ELMO1異常上調(diào)導(dǎo)致AS-MSC遷移增強(qiáng)。

Figure 4. TNF-α介導(dǎo)的ELMO1表達(dá)促進(jìn)MSC遷移

5.ELMO1作為AS的治療靶點(diǎn)

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，AS小鼠中，CD105+間充質(zhì)干細(xì)胞的ELMO1表達(dá)量高于健康對(duì)照組(Fig. 5a)。然后對(duì)SKG小鼠通過(guò)腹腔注射3mg凝膠多糖進(jìn)行處理，誘導(dǎo)小鼠AS特征，并進(jìn)行Av-ELMO1治療。經(jīng)過(guò)Av-ELMO1注射治療后，與對(duì)照組相比，注射組關(guān)節(jié)炎評(píng)分明顯降低，發(fā)病時(shí)間延遲(Fig. 5b,c)。此外，通過(guò)監(jiān)測(cè)臨床表現(xiàn)、H&E染色和micro-CT觀察發(fā)現(xiàn)Av-ELMO1組局部炎癥和異位骨化異位骨化。觀察踝關(guān)節(jié)局部組織時(shí)，觀察到Av-ELMO1組CD105+間充質(zhì)干細(xì)胞遷移的數(shù)量顯著降低。此外，Av-ELMO1組中的SKG小鼠CD68+巨噬細(xì)胞的數(shù)量和TNF-α表達(dá)量降低(Fig. 5g)。

Figure 5. ELMO1作為AS的治療靶點(diǎn)

6. TNF-α處理AS-MSC樣品后， METTL14表達(dá)下降進(jìn)而導(dǎo)致m⁶A水平降低，ELMO1 RNA降解

已有研究發(fā)現(xiàn)m⁶A修飾可降低mRNA的穩(wěn)定性及表達(dá)。作者發(fā)現(xiàn)ELMO1的m⁶A修飾水平隨著TNF-α濃度而改變，經(jīng)過(guò)100 ng/ml TNF-α處理后，AS-MSC中ELMO1 m⁶A修飾水平遠(yuǎn)低于HC-MSC(Fig. 6a)。此外，在100 ng/ml TNF-α刺激下，AS-MSC的ELMO1 mRNA半衰期比HC-MSC更長(zhǎng)，說(shuō)明AS-MSC的mRNA穩(wěn)定性更好(Fig. 6b, c)。

然后檢測(cè)m⁶A相關(guān)甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶的表達(dá)水平。結(jié)果表明，TNF-α處理后，METTL 3，ALKBH5和FTO表達(dá)增加，METTL14和TNF-α表達(dá)降低。當(dāng)用100 ng/ml TNF-α處理AS-MSC時(shí)，METTL14表達(dá)低于HC-MSC。而其他與m6a相關(guān)的甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶無(wú)顯著差異(Fig. 6d, e)。與此同時(shí)，AS樣品中CD105+ MSC中的METTL14表達(dá)明顯低于健康對(duì)照組(Fig. 6f)。這些結(jié)果表明，TNF-α會(huì)導(dǎo)致AS-MSC中METTL14表達(dá)降低，m6A水平下降，ELMO1 RNA降解。

Figure 6在TNF-α處理的AS-MSC中，降低METTL14表達(dá)導(dǎo)致ELMO1的m6A修飾和RNA降解降低

7.抑制METTL14表達(dá)可增加ELMO1表達(dá)，促進(jìn)MSC定向遷移

作者接下來(lái)構(gòu)建了LV-METTL14載體（LV- M14），進(jìn)一步在蛋白水平上證實(shí)了Lv-M14對(duì)MSC中METTL14的抑制作用，并且增強(qiáng)了ELMO1的表達(dá)，但未影響MSC增殖(Fig. 7a)。m⁶A RIP PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染lv - m14的MSC中ELMO1的m6A修飾水平明顯低于轉(zhuǎn)染lv - nc的MSC(Fig. 7B)。與對(duì)照組相比，MSC中抑制METTL14的表達(dá)延長(zhǎng)了ELMO1 mRNA的半衰期(Fig. 7c,d)。轉(zhuǎn)染Lv-M14后MSC中Rac1水平上調(diào)(Fig. 7e)。接下來(lái)，作者研究抑制METTL14是否會(huì)影響MSC的遷移能力，在傷口愈合試驗(yàn)中，Lv-M14組染色的遷移MSC數(shù)量和遷移面積遠(yuǎn)高于對(duì)照組Lv-NC對(duì)照組(Fig. 7f, g)。此外，轉(zhuǎn)染lv - m14的MSC裸鼠中生物發(fā)光區(qū)域也增加了(Fig. 7h)。

Figure 7抑制METTL14表達(dá)可增加ELMO1表達(dá)，促進(jìn)MSC定向遷移

8. METTL14過(guò)表達(dá)能抑制ELMO1水平，抑制MSC定向遷移

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)METTL14可明顯抑制MSC中ELMO1的表達(dá)(Fig. 8a)。過(guò)表達(dá)METTL14 會(huì)引起ELMO1的提高m⁶A修飾水平(Fig. 8b)。此外，轉(zhuǎn)染OE-M14后，MSC中ELMO1 mRNA半衰期縮短(Fig. 8c, d)，且 MSC中Rac1活性水平降低(Fig. 8e)。體外Transwell遷移，傷口愈合試驗(yàn)以及體內(nèi)生物發(fā)光面積測(cè)量顯示當(dāng)METTL14過(guò)表達(dá)時(shí)，MSC遷移能力受到抑制(Fig. 8F–H)。結(jié)果表明，METTL14能增強(qiáng)ELMO1的m⁶A修飾，加速ELMO1 mRNA的變性，進(jìn)而降低了ELMO1的表達(dá)，抑制MSC遷移。

Figure 8. METTL14過(guò)表達(dá)下調(diào)ELMO1水平，抑制MSC定向遷移

9. METTL14作用于ELMO1 3 'utr區(qū)特定的m6A修飾位點(diǎn)

作者進(jìn)一步研究了METTL14如何加快ELMO1 mRNA的看降解。CLIP-PCR結(jié)果顯示，ELMO1在METTL14組比IgG組更富集，提示METTL14能特異性結(jié)合MSC中ELMO1 mRNA轉(zhuǎn)錄本(Fig. 9a)。先前的一項(xiàng)研究表明METTL14主要與mRNA的3'UTR結(jié)合，促進(jìn)mRNA變性。在雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)中，與對(duì)照組相比，野生型中帶有ELMO1 3’utr的報(bào)告基因質(zhì)粒的熒光素酶活性明顯降低，而突變型METTL14則沒(méi)有(Fig. 9b)。接下來(lái)，作者構(gòu)建了帶有突變ELMO1 3'UTR的報(bào)告質(zhì)粒用來(lái)驗(yàn)證ELMO1的m6A修飾位點(diǎn)(Fig. 9c)。

發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，只有突變的1型ELMO1 3’UTR的報(bào)告質(zhì)粒的熒光素酶活性恢復(fù)到正常水平。進(jìn)行2，3型ELMO1 3’ UTR突變的報(bào)告質(zhì)粒的熒光素酶活性與野生型ELMO1 3’ UTR報(bào)告質(zhì)粒的熒光素酶活性相當(dāng)(Fig. 9d)。通過(guò)CLIP檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ELMO1 mRNA結(jié)合得失YTHDF2和YTHDF3，而不是YTHDF1、YTHDC1和YTHDC2。

Figure 9.作用于ELMO1 3'UTR的特異性m⁶A修飾位點(diǎn)

本文中，作者發(fā)現(xiàn)TNF-α通過(guò)METTL14依賴的ELMO1 m⁶A修飾加速AS-MSC的定向遷移。

參考文獻(xiàn)：
1. Xie Z, Yu W, Zheng G, Li J, Cen S, Ye G, et al. TNF-alpha-mediated m(6)A modification of ELMO1 triggers directional migration of mesenchymal stem cell in ankylosing spondylitis. Nat Commun. 2021;12(1): 5373. doi: 10.1038/s41467-021-25710-4.