M6A RNA甲基化介導(dǎo)的RMRP穩(wěn)定性導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌的增殖和進(jìn)展

在全球所有惡性腫瘤中，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的死亡率最高。 lncRNA在腫瘤進(jìn)展中的作用是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)?；?/span>TCGA數(shù)據(jù)庫的綜合分析，我們發(fā)現(xiàn)RMRP是與NSCLC低生存率相關(guān)的最高上調(diào)的lncRNA之一。此外，m6A在RMRP內(nèi)高度富集，增強(qiáng)了其RNA穩(wěn)定性。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，RMRP可促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。在機(jī)制上，RMRP將YBX1招募到TGFBR1啟動(dòng)子區(qū)域，導(dǎo)致TGFBR1的轉(zhuǎn)錄上調(diào)。TGFBR1/SMAD2/SMAD3通路也受RMRP調(diào)控。此外，RMRP促進(jìn)了腫瘤干細(xì)胞特性和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)了對(duì)放療和順鉑的耐藥。臨床資料進(jìn)一步證實(shí)RMRP與TGFBR1呈正相關(guān)。我們的工作揭示了m6A RNA甲基化介導(dǎo)的RMRP穩(wěn)定性通過調(diào)控TGFBR1/SMAD2/SMAD3通路而導(dǎo)致NSCLC的增殖和進(jìn)展。本文于2021年10月發(fā)表在“Cell Death & Differentiation”（ IF:15.828）期刊上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）NSCLC的綜合分析顯示RMRP可能是一種生物標(biāo)志物

我們對(duì)TCGA肺腺癌(LUAD)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了綜合分析。與正常組織相比，RMRP在非小細(xì)胞肺癌組織中上調(diào)(圖1A)。高RMRP表達(dá)與晚期T期和較差的生存率相關(guān)(圖1B和C)。此外，在GSE43458中，與正常肺組織相比，非小細(xì)胞肺癌組織中RMRP表達(dá)上調(diào)，如圖GEO數(shù)據(jù)庫(圖1D)所示。GO結(jié)果顯示，RMRP在蛋白質(zhì)異二聚活性、染色質(zhì)DNA結(jié)合、苦味受體活性等方面發(fā)揮作用(圖1E)。KEGG結(jié)果顯示RMRP在酒精中毒、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、病毒癌變、轉(zhuǎn)錄異常等途徑富集(圖1F)。然后進(jìn)行KEGG研究的基因集富集分析(GSEA)。RMRP在細(xì)胞周期、結(jié)直腸癌、蛋白質(zhì)輸出、TGFB途徑和泛素介導(dǎo)的蛋白水解途徑中富集(圖1G)。這些通路與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示RMRP可能在NSCLC中發(fā)揮重要作用。我們還對(duì)RMRP的蛋白編碼潛能進(jìn)行了探究，發(fā)現(xiàn)RMRP不具有蛋白編碼潛能(圖1H和I)。

2）m6A修飾在RMRP中富集，提高了RMRP的轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性

最近的初步研究報(bào)道，m6A修飾廣泛存在，通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄組影響RNA的剪接、翻譯、輸出、定位和穩(wěn)定性。為了探究m6A對(duì)RMRP的修飾，我們首先使用在線生物信息學(xué)工具m6Avar預(yù)測(cè)位于RMRP中的m6A位點(diǎn)，并鑒定出兩個(gè)RMRP m6A序列基元。然后，在人肺上皮細(xì)胞(HBE)和兩株NSCLC細(xì)胞株(A549和H1299)中進(jìn)行甲基化RNA免疫沉淀(Me-RIP)檢測(cè)。MeRIP-qPCR檢測(cè)顯示，HBE細(xì)胞中RMRP的m6A甲基化水平低于NSCLC細(xì)胞(A549和H1299)(圖2A)。然后我們用小干擾RNA靶向m6A甲基化酶復(fù)合物的核心成分METTTL3，發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞中總RNA和RMRP RNA中的m6A水平都降低了(圖2B, C, D)。放線菌素D 阻斷A549細(xì)胞新RNA合成后，檢測(cè)RMRP RNA的丟失情況。結(jié)果顯示，METTL3下調(diào)后，RMRP表現(xiàn)出較低的RNA穩(wěn)定性(圖2E)。

3）RMRP促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖

為了進(jìn)一步探討RMRP的作用，我們采用定量RT-PCR方法檢測(cè)RMRP在NSCLC細(xì)胞中的表達(dá)。RMRP在A549細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于H1299細(xì)胞(圖3A)。因此，我們?cè)贏549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了兩種不同的抗RMRP shRNA (shRMRP-1和shRMRP-2)或?qū)φ战M的shRNA (rash)，并在H1299細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了RMRP過表達(dá)質(zhì)粒(RMRP)或?qū)φ盏馁|(zhì)粒。通過定量RT-PCR分析證實(shí)了轉(zhuǎn)染效率(圖3B和C)。CCK-8和菌落形成實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)染了shRMRP的NSCLC細(xì)胞的生長和增殖受到了顯著的抑制。而轉(zhuǎn)染過表達(dá)RMRP的質(zhì)粒后效果相反(圖3D-G)。

4）TGFBR1是RMRP促進(jìn)增殖、侵襲和遷移的關(guān)鍵靶點(diǎn)

在我們之前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)TGFBR1與NSCLC的增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)，GSEA結(jié)果顯示RMRP可能參與了TGFB通路。TCGA數(shù)據(jù)庫顯示TGFBR1與RMRP表達(dá)呈正相關(guān)(圖4A)。因此，我們假設(shè)RMRP可能以TGFBR1為靶點(diǎn)。此外，在A549或H1299細(xì)胞中，RMRP敲低或過表達(dá)后，TGFBR1的表達(dá)發(fā)生改變(圖4B、C、D)。在A549細(xì)胞中，下調(diào)RMRP后，TGFBR1的表達(dá)降低，BAX/ Bcl-2升高，而TGFBR1過表達(dá)后，效果相反。在H1299細(xì)胞中，過表達(dá)RMRP后，TGFBR1的表達(dá)增加，BAX/Bcl-2的表達(dá)減少，而TGFBR1敲低后則相反(圖4D)。此外，我們還探索了TGFBR1參與RMRP促進(jìn)NSCLC生長和增殖的機(jī)制。結(jié)果顯示，TGFBR1過表達(dá)后，shRMRP對(duì)NSCLC細(xì)胞生長和增殖的抑制作用得到恢復(fù)，而TGFBR1敲低后則相反(圖4E, F, H, J)。

TGFBR1促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的侵襲、遷移和G1細(xì)胞周期進(jìn)展。因此，我們探討了RMRP對(duì)侵襲、遷移和G1細(xì)胞周期進(jìn)程的影響。與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染shRMRP的NSCLC細(xì)胞顯著抑制了侵襲、遷移和G1細(xì)胞周期進(jìn)展，而在RMRP過表達(dá)的細(xì)胞中觀察到相反的效果。在TGFBR1過表達(dá)后，，shRMRP對(duì)NSCLC細(xì)胞的侵襲、遷移和G1細(xì)胞周期進(jìn)展的抑制作用被挽救，而在TGFBR1敲低后，觀察到相反的效果(圖4G, I, K, L, M，和N)。以上結(jié)果表明TGFBR1可能是RMRP促進(jìn)增殖、侵襲和遷移的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

5）RMRP與轉(zhuǎn)錄因子YBX1相關(guān)

為了進(jìn)一步闡明RMRP的機(jī)制，我們?cè)贜SCLC細(xì)胞中進(jìn)行了核和細(xì)胞質(zhì)RNA的分離和熒光原位雜交(FISH)檢測(cè)。結(jié)果顯示，RMRP主要位于胞質(zhì)(圖5A和B)。最近的一些報(bào)道發(fā)現(xiàn)，許多l(xiāng)ncRNA通過與DNA或蛋白質(zhì)相互作用發(fā)揮作用。為了探討RMRP的調(diào)控作用，我們使用catRAPID。結(jié)果顯示，在NSCLC中發(fā)揮重要作用的YBX1是RMRP的潛在結(jié)合蛋白(圖5C)。RIP實(shí)驗(yàn)顯示，抗YBX1抗體顯著富集了RMRP(圖5D和E)。RNA下拉實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了RMRP和YBX1之間的相互作用(圖5F)。以上結(jié)果表明YBX1與RMRP之間存在密切的相互作用。

6）RMRP通過招募YBX1來促進(jìn)TGFBR1的轉(zhuǎn)錄

我們探索TCGA-LUAD的ATAC-seq數(shù)據(jù)，以確定TGFBR1可能的轉(zhuǎn)錄因子。該分析揭示了TGFBR1基因啟動(dòng)子區(qū)可能存在的YBX1結(jié)合序列。在GEPIA的TCGA-LUAD數(shù)據(jù)庫中，YBX1的表達(dá)與TGFBR1呈正相關(guān)，而與RMRP無相關(guān)性(圖6A-C)。因此，我們推測(cè)YBX1是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，可能被RMRP招募到TGFBR1啟動(dòng)子中。為了進(jìn)一步研究其機(jī)制，我們分別轉(zhuǎn)染siRNA (SiYBX1)、pcDNAYBX1 (YBX1)和它們匹配的對(duì)照(SiNC或Ctrl)。YBX1敲低抑制了TGFBR1的表達(dá)，而YBX1過表達(dá)則增加了TGFBR1的表達(dá)(圖6D)。YBX1結(jié)合復(fù)合物顯示TGFBR1啟動(dòng)子顯著富集。YBX1過表達(dá)增加了TGFBR1-WT細(xì)胞中的熒光素酶活性 (圖6G和H)。RMRP敲低降低了YBX1在TGFBR1啟動(dòng)子上的富集。共轉(zhuǎn)染YBX1可逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)(圖6I)。此外，RMRP增加了結(jié)合(圖6J)。熒光素酶檢測(cè)進(jìn)一步顯示，熒光素酶活性的變化是由于RMRP的敲減或過表達(dá)(圖6K和L)。

7）RMRP調(diào)控NSCLC中TGFBR1/SMAD2/ SMAD3通路

TGFBR1/SMAD2/SMAD3通路在NSCLC中發(fā)揮重要作用。Western blot和免疫熒光檢測(cè)顯示，RMRP敲低顯著抑制了NSCLC細(xì)胞中的核易位和p-SMAD2/ 3的表達(dá)(圖7A和B)。RMRP的改變對(duì)siTGFBR1組中p-SMAD2和p-SMAD3的表達(dá)水平?jīng)]有影響，這表明TGFBR1是RMRP激活SMAD2/SMAD3信號(hào)通路所必需的(圖7C)。

TGFB通路常與CSC性質(zhì)和EMT有關(guān)。因此，我們探討了RMRP是否促進(jìn)NSCLC中的CSC特性。我們通過qRT-PCR檢測(cè)了CSC相關(guān)基因KLF4、SOX2、NANOG、CD133和ALDH的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在A549細(xì)胞中，RMRP敲低后這些基因的表達(dá)降低。在H1299細(xì)胞中，過表達(dá)RMRP后，這些基因表達(dá)上調(diào)(圖7D)。此外，我們還進(jìn)一步探索了這些細(xì)胞中EMT相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，RMRP敲低增加了E-Cadherin的表達(dá)，降低了N-Cadherin和Vimentin的表達(dá)(圖7A)。我們還探索了這些細(xì)胞的成球能力。實(shí)驗(yàn)表明，RMRP敲低降低了成球能力，而過表達(dá)RMRP則增加了成球能力(圖7E)。RMRP抑制增加了A549細(xì)胞對(duì)順鉑和放療的敏感性(圖7F和G)。這些數(shù)據(jù)表明，RMRP通過增強(qiáng)CSC自我更新和EMT促進(jìn)NSCLC進(jìn)展。

8）在體內(nèi)抑制RMRP抑制腫瘤生長

為了進(jìn)一步證實(shí)RMRP在體內(nèi)促進(jìn)腫瘤生長，將A549-shRMRP細(xì)胞和A549- scramble細(xì)胞注射到裸鼠體內(nèi)。30天后，shRMRP組腫瘤明顯變小(圖8A和B)。shRMRP組腫瘤體積和重量顯著降低（圖8C，D）。此外，在A549-scramble中，Ki-67、MMP9和TGFBR1的表達(dá)更高（圖8E）。

結(jié)論：m6A修飾促進(jìn)了lncRNA-RMRP/TGFBR1/SMAD2/SMAD3通路。其潛在的機(jī)制是通過RMRP將轉(zhuǎn)錄因子YBX1招募到TGFBR1啟動(dòng)子，從而對(duì)TGFBR1進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控。此外，RMRP增加了球形成能力和EMT，這與放療和化療的耐藥有關(guān)。RMRP是一種生物標(biāo)志物，在NSCLC中具有潛在的預(yù)后和治療相關(guān)性。

參考文獻(xiàn)：Yin H, Chen L, Piao S, Wang Y, Li Z, Lin Y, Tang X, Zhang H, Zhang H, Wang X. M6A RNA methylation-mediated RMRP stability renders proliferation and progression of non-small cell lung cancer through regulating TGFBR1/SMAD2/SMAD3 pathway. Cell Death Differ. 2021 Oct 9. doi: 10.1038/s41418-021-00888-8. Epub ahead of print. PMID: 34628486.