lncRNA ropm介導(dǎo)的脂質(zhì)代謝控制乳腺癌干細(xì)胞的特性

乳腺癌細(xì)胞復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、化學(xué)耐藥性是乳腺癌患者死亡的主要原因。腫瘤干細(xì)胞（ CSCs ）被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和化療耐藥的“種子”。 lncRNAs通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞核中的核結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄，以及影響細(xì)胞質(zhì)中mRNA的穩(wěn)定性、翻譯和翻譯后修飾。本文提出lncROPM及其靶點(diǎn)PLA2G16能調(diào)節(jié)BCSCs，促進(jìn)乳腺癌發(fā)展、復(fù)發(fā)和化療耐藥。本文于2021年10月發(fā)表在《Journal of hemetology and Oncology》，IF=11.059。

技術(shù)路線

主要結(jié)果：
1. 新型代謝相關(guān)的lncROPM在BCSCs中高表達(dá)

作者首先分離了乳腺癌干細(xì)胞(CD44+CD24?/low)和非乳腺癌干細(xì)胞(CD44?/lowCD24+)，通過(guò)微陣列芯片分析LncRNA的表達(dá)譜，以Fold change > 2.0 ，p < 0.05為界限，在BCSC中篩選出349個(gè)上調(diào)及236個(gè)小下調(diào)的LncRNA（Fig. 1A），由于代謝重編程已成為腫瘤細(xì)胞的一個(gè)標(biāo)志，作者從中篩選出23個(gè)代謝重編碼相關(guān)的LncRNA，發(fā)現(xiàn)其中的一個(gè)lncRNA在BCSC中高表達(dá)，并參與磷脂代謝，將其命名為lncROPM（Fig. 1B）。接下來(lái)，在7個(gè)乳腺癌細(xì)胞系中,與Non-CSCs相比，LncROPM在BCSC中表達(dá)更顯著（Fig. 1C）。通過(guò)原位雜交和亞細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)LncROPM主要定位在細(xì)胞質(zhì)上（Fig. 1D,E）

Fig1. 新型代謝相關(guān)的lncROPM在BCSCs中高表達(dá)

2. LncROPM在乳腺癌中起致癌作用，與乳腺腫瘤的臨床特征及干性密切相關(guān)
  作者進(jìn)一步研究lncROPM在乳腺癌中的臨床意義。發(fā)現(xiàn)lncROPM在死亡患者中的表達(dá)量高于存活患者（Fig. 2A），通過(guò)無(wú)病生存期和無(wú)進(jìn)展生存期進(jìn)行生存分析，發(fā)現(xiàn)高水平的LncRoPM往往與預(yù)后差相關(guān)（Fig. 2B,C），此外，lncROPM在乳腺癌三陰患者中的表達(dá)與無(wú)病生存率、無(wú)進(jìn)展生存率也呈負(fù)相關(guān)（Fig. 2D,E）。與癌旁組織相比，乳腺癌組織中ROPM明顯上調(diào)(Fig. 2E), 而ROPM的表達(dá)水平與腫瘤大小、腫瘤分期、組織分解、淋巴轉(zhuǎn)移情況、復(fù)發(fā)情況也密切相關(guān)，病情越嚴(yán)重，ROPM表達(dá)越明顯(Fig. 2G)。接下來(lái)作者研究了ROPM的表達(dá)量與干性標(biāo)記物Sox2, Oct4之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)他們是成正相關(guān)(Fig. 2H,I)。lncROPM在非BCSCs和BCSCs中的表達(dá)，結(jié)果顯示，與非BCSCs相比，lncROPM在BCSCs中的表達(dá)明顯增加，尤其是在惡化程度高的乳腺癌干細(xì)胞中表達(dá)更顯著(Fig. 2J)，此外，相比于化療敏感的腫瘤組織，化療耐藥的乳腺腫瘤組織中l(wèi)ncROPM顯著升高(Fig. 2 K)。

Fig2. LncROPM是一種與乳腺癌患者的臨床特征及干性相關(guān)的致癌基因

3．LncROPM是維護(hù)BCSC所必需的

為了探討lncROPM在BCSCs中的作用，作者在BCSCs中使用兩種慢病毒介導(dǎo)的短發(fā)夾RNA (shRNAs)敲除了lncROPM（Fig. 3A），并且將異位lncROPM與攜帶慢病毒的lncROPM轉(zhuǎn)染至非bcscs（Fig. 3B），在BCSC中敲除lncROPM之后，腫瘤明顯變小，乳腺球形成率降低（Fig. 3C,D）。將異位lncROPM與攜帶慢病毒的lncROPM轉(zhuǎn)染至non-BCSC之后，腫瘤明顯變大，乳腺球形成率提高（Fig. 3E,F）。接下來(lái)，通過(guò)限制性稀釋法檢測(cè)lncROPM在體內(nèi)外對(duì)腫瘤起始的影響，發(fā)現(xiàn)在乳腺癌干細(xì)胞中，lncROPM的缺失明顯損害了體外和體內(nèi)的腫瘤啟動(dòng)能力（Fig. 3G,H），而在非乳腺癌干細(xì)胞中，異位lncROPM啟動(dòng)腫瘤形成能力（Fig. 3I,J）。說(shuō)明LncROPM是維護(hù)BCSC所必需的。

Fig3 LncROPM是維持BCSCs特性所必需的

4. PLA2G16是lncROPM的靶點(diǎn)，能促進(jìn)乳腺癌的發(fā)展和化療耐藥
  為了探討lncROPM調(diào)控BCSCs特性的機(jī)制，通過(guò)生物信息學(xué)分析和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)lncROPM的潛在靶基因，我們發(fā)現(xiàn)其鄰近基因PLA2G16是lncROPM的潛在靶基因，下一步，為了進(jìn)一步檢測(cè)lncROPM是否會(huì)影響PLA2G16的表達(dá)，我們?cè)俨煌募?xì)胞系中進(jìn)行了qRT-PCR和western blotting檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在BCSC中敲除lncROPM之后明顯抑制了PLA2G16及其蛋白的表達(dá)（Fig. 4A,C），而將異位lncROPM轉(zhuǎn)染至non-BCSC之后，明顯促進(jìn)了PLA2G16及其蛋白的表達(dá)（Fig. 4B,D），通過(guò)相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)lncROPM和PLA2G16在臨床樣本中表達(dá)呈正相關(guān)（Fig. 4E）。作者通過(guò)TNM分期、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤復(fù)發(fā)情況與PLA2G16表達(dá)量，分析了PLA2G16表達(dá)水平與臨床病理嚴(yán)重程度之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PLA2G16表達(dá)水平 與臨床病理嚴(yán)重程度成正相關(guān)（Fig. 4F），此外，在耐藥乳腺腫瘤組織中也觀察到較高水平的PLA2G16（Fig. 4G）。通過(guò)對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的分析，作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，與對(duì)新輔治療具有完全病理應(yīng)答的乳腺癌組織相比，在對(duì)新輔助治療具有部分應(yīng)答的乳腺癌組織中，PLA2G16增強(qiáng)，這表明PLA2G16與乳腺癌患者預(yù)后不良和化療耐藥性密切相關(guān)（Fig. 4H）。說(shuō)明了PLA2G16是lncROPM的靶點(diǎn)，能促進(jìn)乳腺癌的發(fā)展和化療耐藥

Fig4. PLA2G16是lncROPM的靶點(diǎn)，與乳腺癌的發(fā)展和化療耐藥有關(guān)

5. LncROPM通過(guò)增強(qiáng)PLA2G16 mRNA的穩(wěn)定性來(lái)調(diào)控其表達(dá)
   之前發(fā)現(xiàn)LncROPM 是定位在染色質(zhì)上的，作者推測(cè)lncROPM可能在轉(zhuǎn)錄后水平影響PLA2G16的表達(dá)。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，首先通過(guò)qRT-PCR分析檢測(cè)了LncROPM缺失的BCSCs中PLA2G16 pre-mRNA和成熟mRNA的水平。結(jié)果表明，lncROPM的缺失使PLA2G16的CDS區(qū)，5‘-UTR，3‘-UTR水平明顯降低，但3個(gè)內(nèi)含子水平?jīng)]有明顯變化。說(shuō)明 LncROPM參與PLA2G16轉(zhuǎn)錄后調(diào)控（Fig. 5A，B）。根據(jù)pull down實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)lncROPM與PLA2G16 3‘-UTR結(jié)合（Fig. 5C）。接下來(lái)，作者將3‘-UTR分為兩部分，即3‘-UTR-1和3‘-UTR-2，熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示，lncROPM的下調(diào)或過(guò)表達(dá)顯著降低或增強(qiáng)了3‘-UTR-1的活性，而不是3‘-UTR-2的活性，說(shuō)明LncROPM是與3‘-UTR-1區(qū)域結(jié)合（Fig. 5E，F），構(gòu)建了一套lncROPM片段質(zhì)粒，分別與3 ‘-UTR-1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染,確定了與3 ‘-UTR-1結(jié)合的主要是lncROPM 1-100nt（Fig. 5G）。接下來(lái)，利用轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素d檢測(cè)了lncROPM對(duì)PLA2G16 mRNA穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)lncROPM耗盡后PLA2G16 mRNA半衰期迅速降低(Fig. 5H, I)。說(shuō)明LncROPM通過(guò)增強(qiáng)PLA2G16 mRNA的穩(wěn)定性來(lái)調(diào)控其表達(dá)。

Fig5. LncROPM結(jié)合PLA2G16 mRNA的3'UTR，增強(qiáng)PLA2G16 mRNA的穩(wěn)定性

6. PLA2G16對(duì)于lncROPM驅(qū)動(dòng)的BCSCs特性至關(guān)重要
  為了了解PLA2G16是否調(diào)控BCSC特性，首先通過(guò)qRT-PCR和western blotting檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)臨床樣品和不同的細(xì)胞系中，相較于Non-CSCs，PLA2G16及其蛋白的表達(dá)在BCSC中更顯著（Fig. 6 ABC）。接下來(lái)，通過(guò)慢病毒構(gòu)建2個(gè)穩(wěn)定干擾的PLA2G16 乳腺癌細(xì)胞系,以及穩(wěn)定的PLA2G16過(guò)表達(dá)的非乳腺癌細(xì)胞系。Giripladib是一種細(xì)胞質(zhì)磷脂酶A2抑制劑，能抑制PLA2G16酶的活性，發(fā)現(xiàn)在BCSC中敲除PLA2G16或者使用Giripladib能顯著降低連續(xù)傳代過(guò)程中乳腺球形成效率（Fig 6D,F）, 在non-BCSC中過(guò)表達(dá)PLA2G16能加速連續(xù)傳代過(guò)程中乳腺球的形成效率（Fig 6E,G）。挽救實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，因ROPM缺失而造成的干細(xì)胞自我更新能力降低，乳腺球形成率降低 ，能通過(guò)異位的PLA2G16可以部分挽救（Fig 6H），在ROPM過(guò)表達(dá)的non-BCSC中干擾PLA2G16也能明顯逆轉(zhuǎn)（Fig 6 I）。說(shuō)明PLA2G16對(duì)于lncROPM驅(qū)動(dòng)的BCSCs特性至關(guān)重要。

Fig 6. PLA2G16是lncropm驅(qū)動(dòng)BCSCs形成的關(guān)鍵

 7.LncROPM通過(guò)PLA2G16 介導(dǎo)磷脂代謝調(diào)控促進(jìn)BCSCs的干性

   已有文獻(xiàn)報(bào)道PLA2G16參與磷脂代謝過(guò)程，為了了解LncROPM是否通過(guò)誘導(dǎo)的磷脂代謝的改變而影響B(tài)CSC的特性,以及哪些代謝物起了關(guān)鍵作用，于是進(jìn)行了脂質(zhì)組學(xué)研究。發(fā)現(xiàn)在BCSC中 敲除LncROPM后，PLA2G16的兩種代謝底物PC(磷脂酰膽堿)和PG(甘油磷酸甘油)顯著增加，PLA2G16的兩種代表性代謝物Cer(神經(jīng)酰胺)和FFA(自由脂肪酸)顯著降低。而在lncROPM沉默的BCSCs中，PC和PG顯著降低，Cer(神經(jīng)酰胺)和FFA(自由脂肪酸)顯著升高（Fig. 7 A,B）。FFA因?yàn)樽兓畲笞鳛檠芯繉?duì)象， FFA前五個(gè)變化顯著的代謝物中，花生四烯酸(AA)變化最顯著（Fig. 7 C,D）。為了證實(shí)AA與PLA2G16密切相關(guān)，在PLA2G16敲除或giripladib處理的BCSCs以及PLA2G16過(guò)表達(dá)的非BCSCs中檢測(cè)AA含量，發(fā)現(xiàn)AA受PLA2G16調(diào)控(Fig. 7E, F)。與此同時(shí),與non-BCSCs相比，AA在BCSCs中顯著富集(Fig. 7G)。

Fig 7. PLA2G16介導(dǎo)的磷脂代謝和代謝產(chǎn)物花生四烯酸(AA)參與了lncropm驅(qū)動(dòng)的BCSCs維持

8. Giripladib聯(lián)合化療藥物可有效清除BCSCs

為了進(jìn)一步驗(yàn)證lncROPM和PLA2G16在乳腺癌耐藥中的作用，我們研究了lncROPM和PLA2G16在化療藥物反應(yīng)中對(duì)BCSCs生存的影響。我們的數(shù)據(jù)顯示lncROPM或PLA2G16的敲低增加BCSCs對(duì)化療藥物的敏感性(Fig. 8A, B)。此外，lncROPM或PLA2G16在non-BCSC中的過(guò)表達(dá)降低了其對(duì)化療藥物的敏感性(Fig. 8C, D)。接下來(lái)發(fā)現(xiàn)與親本相比，耐藥的BCSCs中檢測(cè)到和PLA2G16表達(dá)更明顯，這些BCSCs具有較強(qiáng)的干性(Fig. 8E)。Giripladib聯(lián)合藥物一起使用，與單一用藥物相比，能更有效地減少BCSCs數(shù)量，抑制乳腺球生成(Fig. 8F,G)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用能顯著降低BCSC的致瘤性，抑制腫瘤生長(zhǎng)(Fig. 8H,I)。此外，通過(guò)免疫組織化學(xué) (IHC)染色，發(fā)現(xiàn)接受聯(lián)合治療的腫瘤中代表性BCSC蛋白之一的干細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子KLF4顯著降低 (圖8J)。

Fig 8. Giripladib聯(lián)合臨床治療藥物有效消除BCSCs

   本文發(fā)現(xiàn)lncROPM, PLA2G16和花生四烯酸（ AA ）與BCSCs耐藥有關(guān)，細(xì)胞質(zhì)磷脂酶A2抑制劑Giripladib與化療藥物協(xié)同可通過(guò)抑制PLA2G16活性有效消除BCSCs。

參考文獻(xiàn)：
      1.    Liu S, Sun Y, Hou Y, Yang L, Wan X, Qin Y, Liu Y, Wang R, Zhu P, Teng Y, Liu M. A novel lncRNA ROPM-mediated lipid metabolism governs breast cancer stem cell properties. J Hematol Oncol 2021; 14(1): 178.