lncRNA ropm介導的脂質代謝控制乳腺癌干細胞的特性

乳腺癌細胞復發(fā)、遠處轉移、化學耐藥性是乳腺癌患者死亡的主要原因。腫瘤干細胞（ CSCs ）被認為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)、轉移和化療耐藥的“種子”。 lncRNAs通過調(diào)節(jié)細胞核中的核結構和轉錄，以及影響細胞質中mRNA的穩(wěn)定性、翻譯和翻譯后修飾。本文提出lncROPM及其靶點PLA2G16能調(diào)節(jié)BCSCs，促進乳腺癌發(fā)展、復發(fā)和化療耐藥。本文于2021年10月發(fā)表在《Journal of hemetology and Oncology》，IF=11.059。

技術路線

主要結果：
1. 新型代謝相關的lncROPM在BCSCs中高表達

作者首先分離了乳腺癌干細胞(CD44+CD24?/low)和非乳腺癌干細胞(CD44?/lowCD24+)，通過微陣列芯片分析LncRNA的表達譜，以Fold change > 2.0 ，p < 0.05為界限，在BCSC中篩選出349個上調(diào)及236個小下調(diào)的LncRNA（Fig. 1A），由于代謝重編程已成為腫瘤細胞的一個標志，作者從中篩選出23個代謝重編碼相關的LncRNA，發(fā)現(xiàn)其中的一個lncRNA在BCSC中高表達，并參與磷脂代謝，將其命名為lncROPM（Fig. 1B）。接下來，在7個乳腺癌細胞系中,與Non-CSCs相比，LncROPM在BCSC中表達更顯著（Fig. 1C）。通過原位雜交和亞細胞分離實驗，發(fā)現(xiàn)LncROPM主要定位在細胞質上（Fig. 1D,E）

Fig1. 新型代謝相關的lncROPM在BCSCs中高表達

2. LncROPM在乳腺癌中起致癌作用，與乳腺腫瘤的臨床特征及干性密切相關
  作者進一步研究lncROPM在乳腺癌中的臨床意義。發(fā)現(xiàn)lncROPM在死亡患者中的表達量高于存活患者（Fig. 2A），通過無病生存期和無進展生存期進行生存分析，發(fā)現(xiàn)高水平的LncRoPM往往與預后差相關（Fig. 2B,C），此外，lncROPM在乳腺癌三陰患者中的表達與無病生存率、無進展生存率也呈負相關（Fig. 2D,E）。與癌旁組織相比，乳腺癌組織中ROPM明顯上調(diào)(Fig. 2E), 而ROPM的表達水平與腫瘤大小、腫瘤分期、組織分解、淋巴轉移情況、復發(fā)情況也密切相關，病情越嚴重，ROPM表達越明顯(Fig. 2G)。接下來作者研究了ROPM的表達量與干性標記物Sox2, Oct4之間的相關性，發(fā)現(xiàn)他們是成正相關(Fig. 2H,I)。lncROPM在非BCSCs和BCSCs中的表達，結果顯示，與非BCSCs相比，lncROPM在BCSCs中的表達明顯增加，尤其是在惡化程度高的乳腺癌干細胞中表達更顯著(Fig. 2J)，此外，相比于化療敏感的腫瘤組織，化療耐藥的乳腺腫瘤組織中l(wèi)ncROPM顯著升高(Fig. 2 K)。

Fig2. LncROPM是一種與乳腺癌患者的臨床特征及干性相關的致癌基因

3．LncROPM是維護BCSC所必需的

為了探討lncROPM在BCSCs中的作用，作者在BCSCs中使用兩種慢病毒介導的短發(fā)夾RNA (shRNAs)敲除了lncROPM（Fig. 3A），并且將異位lncROPM與攜帶慢病毒的lncROPM轉染至非bcscs（Fig. 3B），在BCSC中敲除lncROPM之后，腫瘤明顯變小，乳腺球形成率降低（Fig. 3C,D）。將異位lncROPM與攜帶慢病毒的lncROPM轉染至non-BCSC之后，腫瘤明顯變大，乳腺球形成率提高（Fig. 3E,F）。接下來，通過限制性稀釋法檢測lncROPM在體內(nèi)外對腫瘤起始的影響，發(fā)現(xiàn)在乳腺癌干細胞中，lncROPM的缺失明顯損害了體外和體內(nèi)的腫瘤啟動能力（Fig. 3G,H），而在非乳腺癌干細胞中，異位lncROPM啟動腫瘤形成能力（Fig. 3I,J）。說明LncROPM是維護BCSC所必需的。

Fig3 LncROPM是維持BCSCs特性所必需的

4. PLA2G16是lncROPM的靶點，能促進乳腺癌的發(fā)展和化療耐藥
  為了探討lncROPM調(diào)控BCSCs特性的機制，通過生物信息學分析和qRT-PCR實驗預測lncROPM的潛在靶基因，我們發(fā)現(xiàn)其鄰近基因PLA2G16是lncROPM的潛在靶基因，下一步，為了進一步檢測lncROPM是否會影響PLA2G16的表達，我們再不同的細胞系中進行了qRT-PCR和western blotting檢測，發(fā)現(xiàn)在BCSC中敲除lncROPM之后明顯抑制了PLA2G16及其蛋白的表達（Fig. 4A,C），而將異位lncROPM轉染至non-BCSC之后，明顯促進了PLA2G16及其蛋白的表達（Fig. 4B,D），通過相關性分析，發(fā)現(xiàn)lncROPM和PLA2G16在臨床樣本中表達呈正相關（Fig. 4E）。作者通過TNM分期、組織學分級、淋巴結轉移、腫瘤復發(fā)情況與PLA2G16表達量，分析了PLA2G16表達水平與臨床病理嚴重程度之間的關系，發(fā)現(xiàn)PLA2G16表達水平 與臨床病理嚴重程度成正相關（Fig. 4F），此外，在耐藥乳腺腫瘤組織中也觀察到較高水平的PLA2G16（Fig. 4G）。通過對GEO數(shù)據(jù)庫的分析，作者進一步發(fā)現(xiàn)，與對新輔治療具有完全病理應答的乳腺癌組織相比，在對新輔助治療具有部分應答的乳腺癌組織中，PLA2G16增強，這表明PLA2G16與乳腺癌患者預后不良和化療耐藥性密切相關（Fig. 4H）。說明了PLA2G16是lncROPM的靶點，能促進乳腺癌的發(fā)展和化療耐藥

Fig4. PLA2G16是lncROPM的靶點，與乳腺癌的發(fā)展和化療耐藥有關

5. LncROPM通過增強PLA2G16 mRNA的穩(wěn)定性來調(diào)控其表達
   之前發(fā)現(xiàn)LncROPM 是定位在染色質上的，作者推測lncROPM可能在轉錄后水平影響PLA2G16的表達。為了驗證這一假設，首先通過qRT-PCR分析檢測了LncROPM缺失的BCSCs中PLA2G16 pre-mRNA和成熟mRNA的水平。結果表明，lncROPM的缺失使PLA2G16的CDS區(qū)，5‘-UTR，3‘-UTR水平明顯降低，但3個內(nèi)含子水平?jīng)]有明顯變化。說明 LncROPM參與PLA2G16轉錄后調(diào)控（Fig. 5A，B）。根據(jù)pull down實驗發(fā)現(xiàn)lncROPM與PLA2G16 3‘-UTR結合（Fig. 5C）。接下來，作者將3‘-UTR分為兩部分，即3‘-UTR-1和3‘-UTR-2，熒光素酶報告基因檢測顯示，lncROPM的下調(diào)或過表達顯著降低或增強了3‘-UTR-1的活性，而不是3‘-UTR-2的活性，說明LncROPM是與3‘-UTR-1區(qū)域結合（Fig. 5E，F），構建了一套lncROPM片段質粒，分別與3 ‘-UTR-1質粒共轉染,確定了與3 ‘-UTR-1結合的主要是lncROPM 1-100nt（Fig. 5G）。接下來，利用轉錄抑制劑放線菌素d檢測了lncROPM對PLA2G16 mRNA穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)lncROPM耗盡后PLA2G16 mRNA半衰期迅速降低(Fig. 5H, I)。說明LncROPM通過增強PLA2G16 mRNA的穩(wěn)定性來調(diào)控其表達。

Fig5. LncROPM結合PLA2G16 mRNA的3'UTR，增強PLA2G16 mRNA的穩(wěn)定性

6. PLA2G16對于lncROPM驅動的BCSCs特性至關重要
  為了了解PLA2G16是否調(diào)控BCSC特性，首先通過qRT-PCR和western blotting檢測，發(fā)現(xiàn)臨床樣品和不同的細胞系中，相較于Non-CSCs，PLA2G16及其蛋白的表達在BCSC中更顯著（Fig. 6 ABC）。接下來，通過慢病毒構建2個穩(wěn)定干擾的PLA2G16 乳腺癌細胞系,以及穩(wěn)定的PLA2G16過表達的非乳腺癌細胞系。Giripladib是一種細胞質磷脂酶A2抑制劑，能抑制PLA2G16酶的活性，發(fā)現(xiàn)在BCSC中敲除PLA2G16或者使用Giripladib能顯著降低連續(xù)傳代過程中乳腺球形成效率（Fig 6D,F）, 在non-BCSC中過表達PLA2G16能加速連續(xù)傳代過程中乳腺球的形成效率（Fig 6E,G）。挽救實驗發(fā)現(xiàn)，因ROPM缺失而造成的干細胞自我更新能力降低，乳腺球形成率降低 ，能通過異位的PLA2G16可以部分挽救（Fig 6H），在ROPM過表達的non-BCSC中干擾PLA2G16也能明顯逆轉（Fig 6 I）。說明PLA2G16對于lncROPM驅動的BCSCs特性至關重要。

Fig 6. PLA2G16是lncropm驅動BCSCs形成的關鍵

 7.LncROPM通過PLA2G16 介導磷脂代謝調(diào)控促進BCSCs的干性

   已有文獻報道PLA2G16參與磷脂代謝過程，為了了解LncROPM是否通過誘導的磷脂代謝的改變而影響B(tài)CSC的特性,以及哪些代謝物起了關鍵作用，于是進行了脂質組學研究。發(fā)現(xiàn)在BCSC中 敲除LncROPM后，PLA2G16的兩種代謝底物PC(磷脂酰膽堿)和PG(甘油磷酸甘油)顯著增加，PLA2G16的兩種代表性代謝物Cer(神經(jīng)酰胺)和FFA(自由脂肪酸)顯著降低。而在lncROPM沉默的BCSCs中，PC和PG顯著降低，Cer(神經(jīng)酰胺)和FFA(自由脂肪酸)顯著升高（Fig. 7 A,B）。FFA因為變化最大作為研究對象， FFA前五個變化顯著的代謝物中，花生四烯酸(AA)變化最顯著（Fig. 7 C,D）。為了證實AA與PLA2G16密切相關，在PLA2G16敲除或giripladib處理的BCSCs以及PLA2G16過表達的非BCSCs中檢測AA含量，發(fā)現(xiàn)AA受PLA2G16調(diào)控(Fig. 7E, F)。與此同時,與non-BCSCs相比，AA在BCSCs中顯著富集(Fig. 7G)。

Fig 7. PLA2G16介導的磷脂代謝和代謝產(chǎn)物花生四烯酸(AA)參與了lncropm驅動的BCSCs維持

8. Giripladib聯(lián)合化療藥物可有效清除BCSCs

為了進一步驗證lncROPM和PLA2G16在乳腺癌耐藥中的作用，我們研究了lncROPM和PLA2G16在化療藥物反應中對BCSCs生存的影響。我們的數(shù)據(jù)顯示lncROPM或PLA2G16的敲低增加BCSCs對化療藥物的敏感性(Fig. 8A, B)。此外，lncROPM或PLA2G16在non-BCSC中的過表達降低了其對化療藥物的敏感性(Fig. 8C, D)。接下來發(fā)現(xiàn)與親本相比，耐藥的BCSCs中檢測到和PLA2G16表達更明顯，這些BCSCs具有較強的干性(Fig. 8E)。Giripladib聯(lián)合藥物一起使用，與單一用藥物相比，能更有效地減少BCSCs數(shù)量，抑制乳腺球生成(Fig. 8F,G)。體內(nèi)實驗也發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用能顯著降低BCSC的致瘤性，抑制腫瘤生長(Fig. 8H,I)。此外，通過免疫組織化學 (IHC)染色，發(fā)現(xiàn)接受聯(lián)合治療的腫瘤中代表性BCSC蛋白之一的干細胞相關轉錄因子KLF4顯著降低 (圖8J)。

Fig 8. Giripladib聯(lián)合臨床治療藥物有效消除BCSCs

   本文發(fā)現(xiàn)lncROPM, PLA2G16和花生四烯酸（ AA ）與BCSCs耐藥有關，細胞質磷脂酶A2抑制劑Giripladib與化療藥物協(xié)同可通過抑制PLA2G16活性有效消除BCSCs。

參考文獻：
      1.    Liu S, Sun Y, Hou Y, Yang L, Wan X, Qin Y, Liu Y, Wang R, Zhu P, Teng Y, Liu M. A novel lncRNA ROPM-mediated lipid metabolism governs breast cancer stem cell properties. J Hematol Oncol 2021; 14(1): 178.