單細(xì)胞測(cè)序揭示了乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的細(xì)胞異質(zhì)性和轉(zhuǎn)錄組譜

乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚不清楚。通過單細(xì)胞測(cè)序，我們研究了來自15對(duì)原發(fā)腫瘤和腋窩淋巴結(jié)樣本的96796個(gè)單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組譜。我們鑒定了9個(gè)癌細(xì)胞亞群，包括CD44+ / ALDH2 +/ALDH6A1+乳腺癌干細(xì)胞(BCSCs)。重要的是，BCSCs只存在于原發(fā)腫瘤中，并演化為浸潤到淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移瘤。此外，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)提示，NECTIN2-TIGIT介導(dǎo)了轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境(TME)細(xì)胞之間的相互作用，促進(jìn)了免疫逃逸和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。這項(xiàng)研究是第一次使用單細(xì)胞RNA測(cè)序描述乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)錄組譜。我們的發(fā)現(xiàn)為乳腺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制提供了新的見解，并對(duì)開發(fā)新的療法來抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的起始有意義。本文于2021年10月發(fā)表于“Oncogenesis”（IF=7.485）。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）原發(fā)性乳腺癌和淋巴結(jié)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析

我們從南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院的5例患者中，在治療性手術(shù)和腋窩淋巴結(jié)清除后立即獲得組織。這些組織樣本代表來自患者同側(cè)腋窩的成對(duì)原發(fā)腫瘤和淋巴結(jié)(圖1A)。為了獲得乳腺癌的全面轉(zhuǎn)錄組情況，我們對(duì)15個(gè)樣本進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)。我們共獲得來自原發(fā)癌組織的27,028個(gè)單細(xì)胞和來自腋窩淋巴結(jié)的69,768個(gè)單細(xì)胞(圖1B)。我們將所有合格的細(xì)胞分為18種細(xì)胞類型(圖1B, C)。CD44 + / ALDH2 + /ALDH6A1 +組被定義為乳腺癌干細(xì)胞(BCSCs)。接著，我們分析樣品內(nèi)部組成(圖1D)。我們還采用反褶積分析對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫中樣本的細(xì)胞組成進(jìn)行分析，結(jié)果顯示樣本中TNBC和非TNBC細(xì)胞的比例(圖1E)。該scRNA-seq數(shù)據(jù)具有TNBC細(xì)胞的特征，這些特征后來被用于定義TCGA樣本的分子亞型。

2）乳腺癌細(xì)胞的克隆分析

為了探索乳腺癌的基因組譜，我們應(yīng)用inferCNV算法分析單個(gè)細(xì)胞的拷貝數(shù)變異(CNVs)。我們發(fā)現(xiàn)，與其他癌細(xì)胞亞群相比，BCSCs突變較少(圖2A, B)。根據(jù)BCSCs的細(xì)胞計(jì)數(shù)，選擇患者2進(jìn)行進(jìn)一步研究。5個(gè)CNV_cluster被分類，CNV_cluster 5與BCSC一致(圖2C)，隨后通過UMAP可視化證實(shí)了BCSC獨(dú)特的CNV特征，并將BCSC與其他惡性細(xì)胞分離(圖2D)。根據(jù)inferCNV分析，Heatmap顯示了5個(gè)CNV_簇的突變概況(圖2E)。基于CNV突變圖譜進(jìn)行進(jìn)化研究和軌跡分析，推斷乳腺癌的發(fā)展過程(圖2F, G)。BCSCs在軌跡過程的早期就被識(shí)別出來，并演化為兩個(gè)癌細(xì)胞分支(圖2F)。我們的CNV圖譜在轉(zhuǎn)錄組水平上進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)論，CNV_cluster1和CNV_cluster4與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的突變最多。內(nèi)部組成揭示了腫瘤部位與進(jìn)化狀態(tài)的關(guān)系，轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞處于晚期，而原發(fā)病變細(xì)胞較多，處于早期(圖2H, I)。RNA-velocity證實(shí)BCSC具有干性，并根據(jù)mRNA成熟度沿其演化軌跡進(jìn)行演化(圖2J)。

3）轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組特征

通過放大癌細(xì)胞，我們解剖了DEGs，分別鑒定了原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞富集的功能和途徑。對(duì)于轉(zhuǎn)移性TNBC細(xì)胞，B2M、CD52、PTMA和GZMK是最顯著的DEGs，功能富集顯示了免疫治療的潛在敏感性，在轉(zhuǎn)移性TNBC細(xì)胞中免疫相關(guān)項(xiàng)目高度富集(圖3A)。對(duì)于轉(zhuǎn)移性非TNBC細(xì)胞，CXCL14、STC2、CST3和RAMP3過表達(dá)(圖3B)。我們的轉(zhuǎn)錄組圖譜顯示了腫瘤位點(diǎn)和分子亞型之間的異質(zhì)性，Venn圖顯示了腫瘤間的相似性，在兩個(gè)TNBC和三個(gè)非TNBC樣本的轉(zhuǎn)移中發(fā)現(xiàn)了30個(gè)基因上調(diào)，而在兩個(gè)分子亞型中發(fā)現(xiàn)了103個(gè)基因下調(diào)(圖3C，D)。免疫熒光染色檢測(cè)淋巴結(jié)非TNBC細(xì)胞過表達(dá)基因(圖3F)。不同腫瘤位點(diǎn)和分子亞型的轉(zhuǎn)錄組差異揭示了乳腺癌腫瘤間和腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性，而一些發(fā)現(xiàn)與其他實(shí)體腫瘤的研究結(jié)果相呼應(yīng)，表明乳腺癌細(xì)胞的侵襲行為來源于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

UMAP根據(jù)乳腺癌亞型、患者、樣本來源和細(xì)胞簇對(duì)所有合格的癌細(xì)胞進(jìn)行可視化(圖3E)。所有15個(gè)樣本的癌細(xì)胞被過濾后分為9個(gè)簇，其中C6具有BCSC生物標(biāo)志物，包括CD44和ALDH(圖3G)。我們發(fā)現(xiàn)，在TNBC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中，C7細(xì)胞最多，而在非TNBC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中，C3細(xì)胞占多數(shù)(圖3H)。參照C7的轉(zhuǎn)錄組圖譜，CCL5、PTPRC、CD2、CXCR4和SRGN的表達(dá)靠前。富集分析旨在更好地了解腫瘤細(xì)胞簇的生物學(xué)功能，展示其在合成、代謝、細(xì)胞周期、免疫應(yīng)答、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面的生物活性(圖3I)。據(jù)我們所知，這是第一個(gè)基于整合單細(xì)胞RNA測(cè)序從轉(zhuǎn)錄組角度揭示轉(zhuǎn)移性乳腺癌差異的研究。

4）鑒別乳腺癌的惡性程序

我們應(yīng)用cNMF將腫瘤異質(zhì)性的完整轉(zhuǎn)錄組譜劃分為9個(gè)元程序，并根據(jù)這些元程序的特征基因?qū)γ總€(gè)腫瘤細(xì)胞簇進(jìn)行評(píng)分(圖4A-C)。每個(gè)元程序?qū)?yīng)一個(gè)具有內(nèi)在相似性或相關(guān)性的基因集，包括能量代謝(元程序1;CST3, CXCL14, COX6C)，癌癥相關(guān)信號(hào)通路(元程序3;GSTP1, EMP1, TIMP-1)，免疫激活和應(yīng)答(元程序5;LGALS3, PERP和EMP1)，淋巴細(xì)胞活化(元程序7; CXCR4、CD3D SRGN)，t細(xì)胞活化和DNA修復(fù)(元程序9;RICTOR、GZMK IFI16)。元程序可以更好地理解乳腺癌分子亞型和腫瘤部位的異質(zhì)性和相似性。C3在元程序 1中得分較高。根據(jù)功能富集(圖4D, E)，該元程序富集了物質(zhì)代謝和ERBB2信號(hào)通路。與轉(zhuǎn)移性非TNBC細(xì)胞不同，該元程序分析表明，轉(zhuǎn)移性TNBC細(xì)胞在激活淋巴結(jié)的免疫識(shí)別中具有活性(圖4B、D和E)。元程序 7中富集的最重要功能包括淋巴細(xì)胞分化和激活，以及淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。元程序9富集的主要功能包括t細(xì)胞受體信號(hào)通路、腫瘤中PD-L1表達(dá)和PD-1 checkpoint通路、PI3K-Akt信號(hào)通路。

5）分析癌癥干細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的細(xì)胞間通訊

為了證明TME中免疫細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組特征，我們使用UMAP可視化來自5個(gè)原發(fā)病灶和10對(duì)腋窩淋巴結(jié)的所有免疫細(xì)胞(圖5A，B)。TME在腫瘤部位的細(xì)胞組成和基因表達(dá)上都存在差異(圖5C，D)。與淋巴結(jié)內(nèi)的免疫細(xì)胞相比，免疫細(xì)胞浸潤到原發(fā)腫瘤細(xì)胞時(shí)的生物活性更強(qiáng)烈，并且在不同分子亞型的轉(zhuǎn)移中免疫反應(yīng)的功能差異顯著(圖5D，E)。基于多細(xì)胞相互作用網(wǎng)絡(luò)分析工具包(NATMI)分析，我們識(shí)別了不同樣品來源的細(xì)胞類型之間的細(xì)胞間通信(圖6A-F)。轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的配體-受體對(duì)是淋巴結(jié)TME的重要組成部分。CD52-SIGLEC10和PTPRC-CD22參與了TNBC和非TNBC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(圖6G, H)?；诹馨徒Y(jié)內(nèi)癌細(xì)胞與免疫細(xì)胞間的DEGs和通信，我們的研究結(jié)果不僅解釋了乳腺癌細(xì)胞在不同部位的免疫逃逸機(jī)制，也為未來針對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移惡性過程的治療提供了靶點(diǎn)(圖6I)。通過與TIGIT相互作用，我們發(fā)現(xiàn)NECTIN2在轉(zhuǎn)移性非TNBC細(xì)胞中高表達(dá)，通過與TIGIT相互作用，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞抑制T細(xì)胞激活，抑制免疫應(yīng)答。我們進(jìn)一步進(jìn)行免疫熒光染色，證實(shí)了癌細(xì)胞與CD8+效應(yīng)T細(xì)胞之間的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用(圖6J)。

結(jié)論：我們描述了乳腺癌干細(xì)胞的特征，描述了腫瘤發(fā)生的進(jìn)化過程，確定了乳腺癌轉(zhuǎn)移特異性亞簇的轉(zhuǎn)錄組譜，并詳細(xì)地證明了腫瘤內(nèi)部和腫瘤間的異質(zhì)性。本研究為乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的進(jìn)一步研究提供了新的思路，為乳腺癌患者的個(gè)體化治療奠定了基礎(chǔ)。

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