FGF21減輕鐵過量引起的肝損傷和纖維化

鐵死亡在一些疾病中發(fā)揮作用，如鐵過量引起的肝臟疾病。鐵死亡已成為一種潛在的治療相關(guān)疾病的策略。許多抗氧化劑已被證實(shí)可以控制鐵死亡，但調(diào)控鐵死亡的細(xì)胞自主機(jī)制仍不清楚。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)鐵過量通過過度誘導(dǎo)HO-1表達(dá)促進(jìn)了肝細(xì)胞鐵死亡，促進(jìn)了肝損傷和纖維化的進(jìn)展，并伴有體外和體內(nèi)FGF21蛋白水平的上調(diào)。重組FGF21和FGF21過表達(dá)都能通過抑制鐵死亡顯著保護(hù)鐵過量誘導(dǎo)的肝細(xì)胞線粒體損傷、肝損傷和纖維化。相反，FGF21的缺失加重了鐵過量誘導(dǎo)的鐵死亡。值得注意的是，FGF21誘導(dǎo)的HO-1抑制和NRF2激活為這一現(xiàn)象提供了機(jī)制解釋。綜上所述，我們確定FGF21是一種新的鐵死亡抑制因子。FGF21激活可能為鐵過量誘導(dǎo)的鐵死亡相關(guān)疾病的潛在治療提供了一種有效的策略。本文于2021年9月發(fā)表在“Redox Biology”（IF: 11.799）期刊上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）鐵過量誘導(dǎo)的鐵死亡可導(dǎo)致肝損傷和纖維化

雖然鐵是幾乎所有生物必需的微量營養(yǎng)素，但其高氧化還原活性可能是活性氧的來源，使鐵具有潛在的細(xì)胞毒性。右旋糖酐鐵注射導(dǎo)致體重下降(圖1A)，鐵在肝臟(圖1B)中積累。與對照組相比，右旋糖酐鐵注射組的鐵代謝相關(guān)基因、蛋白和血液學(xué)參數(shù)明顯改變，表現(xiàn)為Hamp1、Fth、Ftl和Fpn表達(dá)上調(diào)，Tfr1表達(dá)下調(diào)(圖1C)。此外，右旋糖酐鐵注射導(dǎo)致肝損傷(圖1D和E)和纖維化(圖1F)。鐵過量可誘導(dǎo)肝臟中羥基自由基(OH.?)、MDA(脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物)和谷胱甘肽(GSH)的積累(圖1G-I)。鐵過量顯著增加了鐵死亡相關(guān)基因Ptgs2的mRNA表達(dá)(圖1J)。我們還發(fā)現(xiàn)鐵過量強(qiáng)烈地抑制了NRF2的磷酸化并降低GPX4蛋白的表達(dá)水平，可能導(dǎo)致原代肝細(xì)胞和小鼠肝臟中ROS清除能力受損(圖1K)。相比之下，鐵過量顯著上調(diào)了原代肝細(xì)胞和小鼠肝臟中的SLC7A11和HO-1蛋白水平(圖1K)。這些結(jié)果表明鐵過量導(dǎo)致鐵死亡，這可能導(dǎo)致隨后的肝損傷和纖維化。

2）鐵過量可顯著增強(qiáng)原代肝細(xì)胞和小鼠肝臟中FGF21的表達(dá)

FGF21被認(rèn)為是一種緩解氧化應(yīng)激的因子。因此，在鐵過量條件下，我們檢測了原代肝細(xì)胞和小鼠肝臟中FGF21的mRNA和蛋白水平。100 μM或1000 μM FAC處理原代肝細(xì)胞24 h后，與對照組相比，F(xiàn)GF21 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高(圖2A-C)。與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致的是，鐵過量顯著增強(qiáng)了右旋糖酐鐵注射小鼠肝臟中FGF21蛋白的表達(dá)(圖2D)。

為了確定FGF21激活在鐵過量誘導(dǎo)的鐵死亡中的作用，將FGF21重組蛋白添加到添加了1000 μM FAC的原代肝細(xì)胞培養(yǎng)基中。研究發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)的FAC處理相比，F(xiàn)GF21處理進(jìn)一步上調(diào)了Fpn、Fth和Ftl的mRNA表達(dá)。此外，F(xiàn)GF21的添加挽救了鐵過量導(dǎo)致的Nrf2和Gpx4 mRNA表達(dá)的下降(圖2E)。FGF21下調(diào)鐵過量誘導(dǎo)的鐵死亡相關(guān)基因Ptgs2的mRNA表達(dá)(圖2E)。這些結(jié)果表明FGF21可能通過改變細(xì)胞鐵代謝和氧化還原平衡來抑制鐵死亡。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)。在FGF21處理的原代肝細(xì)胞中，F(xiàn)GF21降低了細(xì)胞內(nèi)LIP、ROS、MDA和脂質(zhì)過氧化水平，但增加了GSH，這可能有助于抑制鐵過量誘導(dǎo)的鐵死亡(圖2F-J)。此外，與對照組肝細(xì)胞相比，F(xiàn)AC處理的肝細(xì)胞有更小、破裂的線粒體。通過FGF21治療，可以完全挽救FAC誘導(dǎo)的線粒體損傷和形態(tài)學(xué)改變(圖2K)。

3）FGF21基因敲低可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，加重鐵過量所致的鐵死亡

為了進(jìn)一步闡明FGF21在鐵過量誘導(dǎo)的鐵死亡中的作用，我們使用FGF21 siRNA下調(diào)了原代肝細(xì)胞中的FGF21(圖3A)。與重組FGF21蛋白處理或腺病毒介導(dǎo)的FGF21過表達(dá)相比，F(xiàn)GF21敲低顯著損害了細(xì)胞活力(圖3B)，并顯著增加了細(xì)胞內(nèi)LIP、ROS和C11-BODIPY水平(圖3C-E)。FGF21敲低也抑制NRF2的磷酸化以及NRF2和GPX4的蛋白表達(dá)。相比之下，F(xiàn)GF21的敲除顯著增加了HO-1蛋白的表達(dá)(圖3F)。隨后，將FGF21敲除的原代肝細(xì)胞用1000 μМ FAC處理24小時(shí)，發(fā)現(xiàn)與對照細(xì)胞相比，F(xiàn)GF21敲除細(xì)胞的鐵死亡增加(圖3G和H)。經(jīng)FAC處理后HO-1蛋白水平進(jìn)一步升高。然而，在FGF21敲低的原代肝細(xì)胞中，添加FAC降低了FTH/L蛋白的表達(dá)(圖3I)。綜上所述，這些結(jié)果表明FGF21是一種新的鐵死亡抑制因子。

4）重組FGF21蛋白挽救了FGF21基因敲低誘導(dǎo)的鐵死亡

我們采用外源性FGF21治療研究其是否可以減輕FGF21基因敲低引起的鐵死亡。我們將FGF21基因敲低的原代肝細(xì)胞用200 ng/ml FGF21重組蛋白處理24 h，然后通過檢測LIP、ROS和脂質(zhì)過氧化(C11-BODIPY)水平來評估肝細(xì)胞的鐵死。如預(yù)期的那樣，外源性FGF21治療完全挽救了FGF21基因敲減引起的鐵死亡，降低了細(xì)胞內(nèi)LIP、ROS、脂質(zhì)過氧化和MDA水平，但增加了GSH(圖4A-E)。與我們之前的研究結(jié)果一致，F(xiàn)GF21處理增加了正常和FGF21敲低原代肝細(xì)胞的NRF2磷酸化和總NRF2蛋白水平。有趣的是，外源性FGF21治療可以逆轉(zhuǎn)FGF21敲低的原代肝細(xì)胞HO-1蛋白水平的升高(圖4F)。

5）FGF21過表達(dá)通過抑制鐵死亡保護(hù)小鼠免受鐵過量誘導(dǎo)的肝損傷和纖維化

為了進(jìn)一步闡明FGF21在鐵過量誘導(dǎo)的鐵死亡中的作用，我們利用重組腺病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建了肝臟中過表達(dá)FGF21的小鼠模型。與對照組相比，F(xiàn)GF21過表達(dá)小鼠的肝臟中FGF21 mRNA水平大約增加了80倍(圖5A)。FGF21過表達(dá)減弱鐵過量誘導(dǎo)的體重減輕(圖5B)。出乎意料的是，與給予PBS的EGFP對照組小鼠相比，肝臟FGF21過表達(dá)小鼠的血清和肝臟鐵含量降低(圖5C)。對TFR1蛋白水平(圖5I)的評估也顯示，F(xiàn)GF21過表達(dá)改善了WT小鼠的鐵代謝。然而，在給予右旋糖酐鐵后，WT和過表達(dá)FGF21小鼠之間的鐵代謝差異消失了(圖5C)。隨后，研究發(fā)現(xiàn)FGF21過表達(dá)可降低鐵過量小鼠的血清ALT和AST水平(圖5D和E)，并減輕肝損傷和纖維化(圖5F)。此外，F(xiàn)GF21過表達(dá)也降低了肝臟中的OH-和MDA水平(圖5G和H)。肝臟中FGF21過表達(dá)降低了PBS給藥小鼠HO-1的表達(dá)，增加了FTH/L的表達(dá)(圖5 I)。這些結(jié)果表明FGF21過表達(dá)可以通過抑制WT小鼠的鐵死亡來保護(hù)小鼠免于鐵過量誘導(dǎo)的肝損傷和纖維化。

6）FGF21通過促進(jìn)HO-1泛素化和降解來減輕鐵死亡

為了闡明FGF21介導(dǎo)的HO-1抑制在肝細(xì)胞保護(hù)鐵死亡的作用，我們將表達(dá)HO-1的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原代肝細(xì)胞(圖6A)。HO-1過表達(dá)可增加細(xì)胞死亡和細(xì)胞內(nèi)LIP、ROS和脂質(zhì)過氧化水平(圖6B-E)。與此觀察相一致的是，即使在鐵過量的情況下，HO-1敲低也能降低原代肝細(xì)胞鐵死亡和細(xì)胞內(nèi)LIP、ROS和脂質(zhì)過氧化水平(圖6F-J)。這些結(jié)果表明HO-1是肝細(xì)胞內(nèi)鐵死亡的激活因子。

為了揭示FGF21調(diào)控HO-1蛋白水平的潛在機(jī)制，我們分析了FGF21過表達(dá)小鼠的肝臟(圖7A)和FGF21處理的原代肝細(xì)胞(圖7B)中HO-1 mRNA的表達(dá)水平。FGF21沒有改變HO-1 mRNA的表達(dá)水平，表明FGF21以轉(zhuǎn)錄獨(dú)立的方式抑制HO-1的表達(dá)。接下來，我們使用氯己亞胺(CHX，一種化學(xué)蛋白合成抑制劑)來評估FGF21介導(dǎo)的HO- 1蛋白表達(dá)下調(diào)的轉(zhuǎn)錄獨(dú)立機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)FGF21影響HO-1蛋白的穩(wěn)定性，F(xiàn)GF21的處理縮短了HO-1的半衰期，從而加速了其降解(圖7C)。隨后，F(xiàn)GF21也被發(fā)現(xiàn)促進(jìn)HO-1泛素化。與載體對照相比，F(xiàn)GF21過表達(dá)增加了HEK293T細(xì)胞中HA標(biāo)記的HO-1蛋白的泛素化(圖7D)。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明FGF21通過促進(jìn)HO-1的泛素化和降解來減弱鐵過量誘導(dǎo)的鐵死亡。

結(jié)論：構(gòu)成性HO-1活化是鐵過量誘導(dǎo)肝細(xì)胞鐵死亡的一種新介質(zhì)，F(xiàn)GF21可以通過刺激HO-1泛素化和隨后的降解來保護(hù)肝細(xì)胞免受鐵過量誘導(dǎo)的鐵死亡。FGF21-HO-1途徑可用于治療鐵過量誘導(dǎo)的鐵死亡相關(guān)疾病。

參考文獻(xiàn)：

Wu A, Feng B, Yu J, Yan L, Che L, Zhuo Y, Luo Y, Yu B, Wu D, Chen D. Fibroblast growth factor 21 attenuates iron overload-induced liver injury and fibrosis by inhibiting ferroptosis. Redox Biol. 2021 Oct;46:102131. doi: 10.1016/j.redox.2021.102131. Epub 2021 Sep 11. PMID: 34530349; PMCID: PMC8445902.