凋亡細(xì)胞外囊泡通過恢復(fù)Fas介導(dǎo)的凋亡改善多發(fā)性骨髓瘤
細(xì)胞凋亡是維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的關(guān)鍵，并產(chǎn)生大量凋亡細(xì)胞外小泡（apoEV）。幾種類型的癌細(xì)胞表面由于Fas表達(dá)減少，因此能夠逃避Fas配體誘導(dǎo)的凋亡。然而，正常細(xì)胞來源的載脂蛋白EV是否能調(diào)節(jié)腫瘤生長尚不清楚。目前，有研究確定了apoEV在誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤（MM）凋亡中的作用，并提示了apoEV治療MM的潛力，該研究發(fā)表于2012年9月發(fā)表在《ACS NANO》，IF：15.881。
技術(shù)路線：
主要研究結(jié)果：
1. ApoEVs抑制多發(fā)性骨髓瘤進(jìn)展
作者前期先分離與表征MSC衍生apoEVs。然后為了在體內(nèi)測(cè)試MSC來源的apoEVs對(duì)MM的影響，作者通過尾靜脈將5TGM1骨髓瘤細(xì)胞輸注到NOD/SCID小鼠中，生成一個(gè)具有侵襲性的同基因MM小鼠模型（圖1A）。另外還發(fā)現(xiàn)apoEVs顯著延長MM小鼠的壽命、抑制腫瘤生長（圖1B-D）。免疫熒光染色和流式細(xì)胞分析進(jìn)一步證實(shí)，與對(duì)照組相比，MM小鼠股骨骨髓中CD138+漿細(xì)胞和CD45+CD19 CD138+骨髓瘤細(xì)胞數(shù)量增加，ApoEVs顯著抑制MM小鼠病理浸潤的骨髓瘤細(xì)胞（圖1E，F）。ELISA分析顯示，apoEV治療顯著降低MM小鼠升高的IgG2b水平（圖1G）。MicroCT和組織學(xué)分析顯示，5TGM1細(xì)胞接種后25天，骨小梁骨密度(BMD)和骨小梁體積分?jǐn)?shù)下降，ApoEVs輸注顯著恢復(fù)MM小鼠的骨密度和BV/TV（圖1H，I）。此外，組織學(xué)分析顯示MM小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的急性腎損傷，而apoEV治療顯著挽救了腎損傷（圖1J）。
圖1間充質(zhì)干細(xì)胞來源的apoEVs抑制MM細(xì)胞生長
2. ApoEVs利用FasL誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞凋亡
ApoEV在體外治療后6、24和48 h以劑量依賴性的方式誘導(dǎo)5TGM1細(xì)胞死亡（圖2A）。此外，流式細(xì)胞儀分析顯示，apoEV處理提高了Annexin v陽性的凋亡5TGM1細(xì)胞數(shù)量，并呈劑量依賴性（圖2B）。通過TUNEL染色和Western blotting檢測(cè)，ApoEV處理顯著誘導(dǎo)5TGM1細(xì)胞凋亡，上調(diào)cleaved caspase-3和cleaved caspase-8的表達(dá)（圖2C，D）。ApoEV處理顯著增加了股骨中cleaved caspase-3和CD138雙陽性凋亡骨髓瘤細(xì)胞的數(shù)量（圖2E）。ApoEV輕微提高了5TGM1細(xì)胞FasL和Fas的表達(dá)，而apoEVs顯著提高了5TGM1細(xì)胞FasL相關(guān)死亡域蛋白的表達(dá)，降低了抗凋亡蛋白的表達(dá)水平(圖2F)。與MSCs和5TGM1細(xì)胞相比，MSC來源的apoEV顯示FasL和Fas的表達(dá)升高(圖2G)。FaslprMSC-衍生的 Fas-deficient apoEV能夠誘導(dǎo)5TGM1細(xì)胞凋亡（圖2H，I）。為使用Fasl小干擾RNA (siRNA)產(chǎn)生Fasl-depletion apoEVs，通過流式細(xì)胞分析評(píng)估發(fā)現(xiàn)，它們未能誘導(dǎo)5TGM1細(xì)胞凋亡（圖2J）。挽救Fasl表達(dá)可恢復(fù)Faslmut - apoEV誘導(dǎo)5TGM1細(xì)胞凋亡的能力（圖2K），提示Fasl是apoev誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞凋亡所必需的。
圖2 ApoEVs通過FasL/Fas途徑誘導(dǎo)MM細(xì)胞凋亡
3. FasL在apoev介導(dǎo)的多發(fā)性骨髓瘤治療中是必需的
Fasl缺陷的Faslmut-apoEVs未能延長MM小鼠的壽命，也未能抑制腫瘤生長（圖3A，B）。ELISA分析、MicroCT和組織學(xué)分析顯示，Fasl缺陷Faslmut-apoEVs未能降低MM小鼠血清IgG2b水平，以及挽救BMD、BV/TV和腎臟損傷（圖3D-F）。而挽救Fasl表達(dá)可以恢復(fù)Fasl缺陷的apoEVs受損的治療能力 (圖3A, B)。組織學(xué)分析顯示，Fasl過表達(dá)恢復(fù)了Fasl缺陷apoev的能力，降低血清IgG2b水平，恢復(fù)MM小鼠的BMD、BV/TV和腎臟損傷（圖3C-F）。
圖3 ApoEVs在小鼠體內(nèi)通過FasL誘導(dǎo)MM細(xì)胞凋亡
4. ApoEVs促進(jìn)Fas從細(xì)胞質(zhì)到多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞表面的運(yùn)輸
Fas激活抗體和重組FasL均未能誘導(dǎo)5TGM1細(xì)胞凋亡，提示MM細(xì)胞中Fas激活通路被破壞（圖4A）。Fas分布在5TGM1細(xì)胞的整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中，并且pkh26標(biāo)記的apoEVs聚集在骨髓瘤細(xì)胞表面，并誘導(dǎo)細(xì)胞表面Fas明顯聚集（圖4B）。Western blotting結(jié)果顯示，apoEV處理提高了MM細(xì)胞細(xì)胞膜上Fas的表達(dá)，但降低了細(xì)胞質(zhì)中Fas的水平（圖4C）。流式細(xì)胞分析進(jìn)一步證實(shí)apoEVs增加了5TGM1細(xì)胞表面的Fas表達(dá)（圖4D）。ApoEVs在MM小鼠股骨骨髓中誘導(dǎo)Fas膜移位（圖4E，F）。ApoEVs輸注后，Fas明顯轉(zhuǎn)移到CD138陽性的骨髓漿細(xì)胞表面（圖4E）。流式細(xì)胞分析也證明apoEVs顯著增加了MM小鼠CD138+骨髓漿細(xì)胞表面Fas的比例（圖4F）。
圖4 ApoEVs誘導(dǎo)Fas進(jìn)入細(xì)胞膜。
5. ApoEVs直接接觸MM細(xì)胞，通過引起Ca2+內(nèi)流和胞漿Ca2+升高誘導(dǎo)Fas膜運(yùn)輸
在apoEV處理后的6小時(shí)內(nèi)，大多數(shù)apoEVs直接與5TGM1細(xì)胞表面區(qū)域接觸，而在這段處理后的時(shí)間內(nèi)，只有少數(shù)apoEVs可以在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)(圖5A)。Z-stack two-dimensional SIM顯微鏡圖像和定量分析證實(shí)，許多apoEVs與細(xì)胞表面重疊，但不在細(xì)胞表面內(nèi)部(圖5B,C)。ApoEV處理顯著增加了5TGM1細(xì)胞內(nèi)的鈣離子 (圖5D)。ApoEV處理增強(qiáng)了5TGM1細(xì)胞中Cav1.2和Cav1.3的膜表達(dá)，但降低了它們的細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，而Cav1.1的表達(dá)沒有改變（圖5E）。ApoEV介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣內(nèi)流被L型Ca2+通道抑制劑阻斷，并被L型鈣通道激活劑激活（圖5 F，G），表明apoEV誘導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流依賴于L型鈣通道。最重要的是，通過流式細(xì)胞術(shù)分析、免疫熒光染色和Western blotting（圖5F-I）評(píng)估，L型Ca2+通道抑制劑處理5TGM1細(xì)胞可阻斷apoEV治療后Fas的細(xì)胞表面易位，降低了apoEV治療后5TGM1細(xì)胞凋亡，而BayK處理增強(qiáng)了凋亡（圖5J）。
圖5 apoEV誘導(dǎo)的Fas運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜依賴于Ca2+的流入
6. 骨髓瘤細(xì)胞來源的apoEVs未能改善多發(fā)性骨髓瘤
5TGM1MM細(xì)胞來源的apoEVs未能延長MM小鼠的壽命(圖6A)。MicroCT分析顯示，與MSC來源的apoEVs相比，5TGM1細(xì)胞來源的apoEVs未能挽救BMD和BV/TV的下降(圖6B,C)。5TGM1細(xì)胞源apoEVs在體外不能增加MM細(xì)胞膜中Fas的表達(dá)，也不能誘導(dǎo)MM細(xì)胞凋亡(圖6D,E)。此外，5TGM1細(xì)胞來源的apoEVs表達(dá)的FasL水平明顯低于MSC來源的apoEVs(圖6F)。來自MSCs的apoEVs，而不是來自MM腫瘤細(xì)胞的apoEVs，可以誘導(dǎo)MM細(xì)胞凋亡和改善MM表型。因此，MSCs是臨床前和臨床研究中產(chǎn)生apoEVs的合適細(xì)胞來源。
圖6 5TGM1細(xì)胞源apoEVs對(duì)MM細(xì)胞的影響
主要研究結(jié)論：
MSC來源的外源性apoEVs可以通過激活FasL/ Fas信號(hào)通路抑制MM細(xì)胞生長，減輕骨髓瘤骨病。此外，apoEVs通過提高MM細(xì)胞的胞質(zhì)Ca2+，促進(jìn)Fas蛋白從細(xì)胞質(zhì)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜。apoEV誘導(dǎo)Fas轉(zhuǎn)位至MM細(xì)胞膜，apoEV表面FasL直接誘導(dǎo)MM細(xì)胞凋亡。這種一箭雙雕的效應(yīng)可能為MM的治療策略提供了一種很有前途的方法。這一發(fā)現(xiàn)為目前對(duì)EVs和腫瘤相互作用的理解提供了見解，并為MSC來源的apoEV具有作為無細(xì)胞治療腫瘤的潛力提供了證據(jù)。