凋亡細(xì)胞外囊泡通過恢復(fù)Fas介導(dǎo)的凋亡改善多發(fā)性骨髓瘤

欄目:最新研究動態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2022-01-12
目前,有研究確定了apoEV在誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤(MM)凋亡中的作用,并提示了apoEV治療MM的潛力,該研究發(fā)表于......


細(xì)胞凋亡是維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的關(guān)鍵,并產(chǎn)生大量凋亡細(xì)胞外小泡(apoEV)。幾種類型的癌細(xì)胞表面由于Fas表達(dá)減少,因此能夠逃避Fas配體誘導(dǎo)的凋亡。然而,正常細(xì)胞來源的載脂蛋白EV是否能調(diào)節(jié)腫瘤生長尚不清楚。目前,有研究確定了apoEV在誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤(MM)凋亡中的作用,并提示了apoEV治療MM的潛力,該研究發(fā)表于20129月發(fā)表在《ACS NANO》,IF15.881。


技術(shù)路線:


主要研究結(jié)果:
1. ApoEVs抑制多發(fā)性骨髓瘤進(jìn)展

作者前期先分離與表征MSC衍生apoEVs。然后為了在體內(nèi)測試MSC來源的apoEVsMM的影響,作者通過尾靜脈將5TGM1骨髓瘤細(xì)胞輸注到NOD/SCID小鼠中,生成一個(gè)具有侵襲性的同基因MM小鼠模型(1A)。另外還發(fā)現(xiàn)apoEVs顯著延長MM小鼠的壽命、抑制腫瘤生長(圖1B-D)。免疫熒光染色和流式細(xì)胞分析進(jìn)一步證實(shí),與對照組相比,MM小鼠股骨骨髓中CD138+漿細(xì)胞和CD45+CD19 CD138+骨髓瘤細(xì)胞數(shù)量增加,ApoEVs顯著抑制MM小鼠病理浸潤的骨髓瘤細(xì)胞(圖1E,F)。ELISA分析顯示,apoEV治療顯著降低MM小鼠升高的IgG2b水平(圖1G)。MicroCT和組織學(xué)分析顯示,5TGM1細(xì)胞接種后25天,骨小梁骨密度(BMD)和骨小梁體積分?jǐn)?shù)下降,ApoEVs輸注顯著恢復(fù)MM小鼠的骨密度和BV/TV(圖1H,I)。此外,組織學(xué)分析顯示MM小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的急性腎損傷,而apoEV治療顯著挽救了腎損傷(圖1J)。

1間充質(zhì)干細(xì)胞來源的apoEVs抑制MM細(xì)胞生長


2.  ApoEVs利用FasL誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞凋亡

ApoEV在體外治療后6、2448 h以劑量依賴性的方式誘導(dǎo)5TGM1細(xì)胞死亡(圖2A)。此外,流式細(xì)胞儀分析顯示,apoEV處理提高了Annexin v陽性的凋亡5TGM1細(xì)胞數(shù)量,并呈劑量依賴性(圖2B)。通過TUNEL染色和Western blotting檢測,ApoEV處理顯著誘導(dǎo)5TGM1細(xì)胞凋亡,上調(diào)cleaved caspase-3cleaved caspase-8的表達(dá)(圖2CD)。ApoEV處理顯著增加了股骨中cleaved caspase-3CD138雙陽性凋亡骨髓瘤細(xì)胞的數(shù)量(圖2E)。ApoEV輕微提高了5TGM1細(xì)胞FasLFas的表達(dá),而apoEVs顯著提高了5TGM1細(xì)胞FasL相關(guān)死亡域蛋白的表達(dá),降低了抗凋亡蛋白的表達(dá)水平(2F)。與MSCs5TGM1細(xì)胞相比,MSC來源的apoEV顯示FasLFas的表達(dá)升高(2G)。FaslprMSC-衍生的 Fas-deficient apoEV能夠誘導(dǎo)5TGM1細(xì)胞凋亡(圖2H,I)。為使用Fasl小干擾RNA (siRNA)產(chǎn)生Fasl-depletion apoEVs,通過流式細(xì)胞分析評估發(fā)現(xiàn),它們未能誘導(dǎo)5TGM1細(xì)胞凋亡(圖2J)。挽救Fasl表達(dá)可恢復(fù)Faslmut - apoEV誘導(dǎo)5TGM1細(xì)胞凋亡的能力(圖2K),提示Faslapoev誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞凋亡所必需的。

2 ApoEVs通過FasL/Fas途徑誘導(dǎo)MM細(xì)胞凋亡


3.  FasLapoev介導(dǎo)的多發(fā)性骨髓瘤治療中是必需的

Fasl缺陷的Faslmut-apoEVs未能延長MM小鼠的壽命,也未能抑制腫瘤生長(圖3AB)。ELISA分析、MicroCT和組織學(xué)分析顯示,Fasl缺陷Faslmut-apoEVs未能降低MM小鼠血清IgG2b水平,以及挽救BMD、BV/TV和腎臟損傷(圖3D-F)。而挽救Fasl表達(dá)可以恢復(fù)Fasl缺陷的apoEVs受損的治療能力 (3A, B)。組織學(xué)分析顯示,Fasl過表達(dá)恢復(fù)了Fasl缺陷apoev的能力,降低血清IgG2b水平,恢復(fù)MM小鼠的BMD、BV/TV和腎臟損傷(圖3C-F)。

3 ApoEVs在小鼠體內(nèi)通過FasL誘導(dǎo)MM細(xì)胞凋亡


4.  ApoEVs
促進(jìn)Fas從細(xì)胞質(zhì)到多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞表面的運(yùn)輸

Fas激活抗體和重組FasL均未能誘導(dǎo)5TGM1細(xì)胞凋亡,提示MM細(xì)胞中Fas激活通路被破壞(圖4A)。Fas分布在5TGM1細(xì)胞的整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中,并且pkh26標(biāo)記的apoEVs聚集在骨髓瘤細(xì)胞表面,并誘導(dǎo)細(xì)胞表面Fas明顯聚集(圖4B)。Western blotting結(jié)果顯示,apoEV處理提高了MM細(xì)胞細(xì)胞膜上Fas的表達(dá),但降低了細(xì)胞質(zhì)中Fas的水平(圖4C)。流式細(xì)胞分析進(jìn)一步證實(shí)apoEVs增加了5TGM1細(xì)胞表面的Fas表達(dá)(圖4D)。ApoEVsMM小鼠股骨骨髓中誘導(dǎo)Fas膜移位(圖4E,F)。ApoEVs輸注后,Fas明顯轉(zhuǎn)移到CD138陽性的骨髓漿細(xì)胞表面(圖4E)。流式細(xì)胞分析也證明apoEVs顯著增加了MM小鼠CD138+骨髓漿細(xì)胞表面Fas的比例(圖4F)。

4 ApoEVs誘導(dǎo)Fas進(jìn)入細(xì)胞膜。


5.  ApoEVs
直接接觸MM細(xì)胞,通過引起Ca2+內(nèi)流和胞漿Ca2+升高誘導(dǎo)Fas膜運(yùn)輸

apoEV處理后的6小時(shí)內(nèi),大多數(shù)apoEVs直接與5TGM1細(xì)胞表面區(qū)域接觸,而在這段處理后的時(shí)間內(nèi),只有少數(shù)apoEVs可以在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)(5A)。Z-stack two-dimensional SIM顯微鏡圖像和定量分析證實(shí),許多apoEVs與細(xì)胞表面重疊,但不在細(xì)胞表面內(nèi)部(5B,C)。ApoEV處理顯著增加了5TGM1細(xì)胞內(nèi)的鈣離子 (5D)。ApoEV處理增強(qiáng)了5TGM1細(xì)胞中Cav1.2Cav1.3的膜表達(dá),但降低了它們的細(xì)胞質(zhì)表達(dá),而Cav1.1的表達(dá)沒有改變(圖5E)。ApoEV介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣內(nèi)流被LCa2+通道抑制劑阻斷,并被L型鈣通道激活劑激活(圖5 F,G),表明apoEV誘導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流依賴于L型鈣通道。最重要的是,通過流式細(xì)胞術(shù)分析、免疫熒光染色和Western blotting(圖5F-I)評估,LCa2+通道抑制劑處理5TGM1細(xì)胞可阻斷apoEV治療后Fas的細(xì)胞表面易位,降低了apoEV治療后5TGM1細(xì)胞凋亡,而BayK處理增強(qiáng)了凋亡(圖5J)。

5 apoEV誘導(dǎo)的Fas運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜依賴于Ca2+的流入


6.  
骨髓瘤細(xì)胞來源的apoEVs未能改善多發(fā)性骨髓瘤

5TGM1MM細(xì)胞來源的apoEVs未能延長MM小鼠的壽命(6A)。MicroCT分析顯示,與MSC來源的apoEVs相比,5TGM1細(xì)胞來源的apoEVs未能挽救BMDBV/TV的下降(6B,C)。5TGM1細(xì)胞源apoEVs在體外不能增加MM細(xì)胞膜中Fas的表達(dá),也不能誘導(dǎo)MM細(xì)胞凋亡(6D,E)。此外,5TGM1細(xì)胞來源的apoEVs表達(dá)的FasL水平明顯低于MSC來源的apoEVs(6F)。來自MSCsapoEVs,而不是來自MM腫瘤細(xì)胞的apoEVs,可以誘導(dǎo)MM細(xì)胞凋亡和改善MM表型。因此,MSCs是臨床前和臨床研究中產(chǎn)生apoEVs的合適細(xì)胞來源。

6 5TGM1細(xì)胞源apoEVsMM細(xì)胞的影響


主要研究結(jié)論:

MSC來源的外源性apoEVs可以通過激活FasL/ Fas信號通路抑制MM細(xì)胞生長,減輕骨髓瘤骨病。此外,apoEVs通過提高MM細(xì)胞的胞質(zhì)Ca2+,促進(jìn)Fas蛋白從細(xì)胞質(zhì)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜。apoEV誘導(dǎo)Fas轉(zhuǎn)位至MM細(xì)胞膜,apoEV表面FasL直接誘導(dǎo)MM細(xì)胞凋亡。這種一箭雙雕的效應(yīng)可能為MM的治療策略提供了一種很有前途的方法。這一發(fā)現(xiàn)為目前對EVs和腫瘤相互作用的理解提供了見解,并為MSC來源的apoEV具有作為無細(xì)胞治療腫瘤的潛力提供了證據(jù)。