siRNA修飾的lncRNA納米藥物通過抑制心肌內(nèi)皮細(xì)胞鐵死亡治療心肌肥厚

心臟微血管功能障礙與心肌肥厚相關(guān)，最終可導(dǎo)致心力衰竭。長(zhǎng)鏈非編碼RNA (lncRNAs)的異常調(diào)節(jié)被認(rèn)為是心肌肥厚的關(guān)鍵機(jī)制之一。本文發(fā)表在《Molecular Therapy-Nucleic Acids》IF：8.886三月刊上。然而，lncRNA在心臟微血管功能障礙中的潛在作用和潛在機(jī)制尚未明確闡明。本研究結(jié)果證實(shí)心臟微血管功能障礙與心肌肥厚和心肌肥厚時(shí)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(CMECs)鐵死亡有關(guān)。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、心肌肥厚時(shí)受損的心肌微血管發(fā)生鐵死亡

不同形式的死亡，如凋亡，自噬和壞死性凋亡都已被證明和心肌肥厚相關(guān)。這些結(jié)果表明不同形式的死亡方式可以共同作用于心肌肥厚，那么一些新的細(xì)胞死亡方式可能會(huì)被忽略。鐵死亡是一種鐵依賴的，非凋亡性細(xì)胞死亡，部分是由致死性脂質(zhì)ROS積累介導(dǎo)的。此外，鐵死亡參與心肌損傷?；谝陨献髡卟孪腓F死亡可能也參與了心肌肥厚。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)鐵死亡相關(guān)蛋白ferrostatin-1 (Ferr-1)減少了心肌肥厚模型組心臟中脂質(zhì)過氧化的增加，通過檢測(cè)MDA和ptgs2水平（圖1A-B）。并且，Ferr-1處理減少了模型組心臟H2AX的表達(dá)（圖1C-D）。此外，電子顯微鏡下觀察到心肌微血管內(nèi)皮線粒體在AAC處理大鼠中顯著變形和萎縮，這是鐵死亡發(fā)生的典型標(biāo)志，而這些現(xiàn)象在Ferr-1處理后顯著減少（圖1E）。明膠-墨水染色顯示Ferr-1顯著增加了心臟微血管密度（圖1F），并可以改善心肌微血管功能，表現(xiàn)為p-eNOS蛋白，NO含量和cGMP增加（圖1G-1J）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)err-1處理減少了ROS、脂質(zhì)過氧化、ptgs2表達(dá)的增加（圖1K-1M），并增加了AngⅡ誘導(dǎo)的CMEC細(xì)胞活力（圖1N-1O），p-eNOS的表達(dá)（圖1R-1S），并增加了AngⅡ誘導(dǎo)的CMEC細(xì)胞中的NO含量。這些結(jié)果表明鐵死亡發(fā)生在心肌微血管損傷過程中，提示Ferr-1對(duì)肥厚性心臟的保護(hù)作用可能通過抑制鐵死亡來改善CMEC功能。

圖1抑制鐵死亡改善CMECs的功能

2、心肌肥厚心臟中MMP9/TIMP1比值失衡導(dǎo)致CMECs功能障礙

MMP9/TIMP1的失衡參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，作者的前期研究也發(fā)現(xiàn)心肌肥厚大鼠心臟和CMEC細(xì)胞中均存在MMP9/TIMP1失衡。在這里，作者證明TIMP1沉默導(dǎo)致MMP9表達(dá)顯著增加（圖2A-D），以及增加AngⅡ誘導(dǎo)的CMEC細(xì)胞活力（圖2E-F）。為探討MMP9/TIMP1失衡對(duì)CMECs功能的影響，采用免疫熒光和western blot檢測(cè)PECAM-1的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在AngⅡ處理的CMECs中，PECAM-1的表達(dá)明顯缺失，而TIMP1的沉默顯著提高了PECAM-1的表達(dá)（圖2G-2I）。此外，Ang II抑制細(xì)胞遷移和管形成能力，p-eNOS表達(dá)和NO含量，而TIMP1沉默顯著反轉(zhuǎn)這些作用（圖2J-N）。這些結(jié)果表明MMP9/TIMP1失衡導(dǎo)致CMECs功能障礙。

圖2沉默TIMP1改善AngⅡ誘導(dǎo)的CMECs功能異常

3、MMP9/TIMP1比值失衡誘導(dǎo)CMECs鐵死亡通過激活TFR-1

隨后探究TIMP1沉默保護(hù)CMEC功能的機(jī)制。作者檢測(cè)了鐵死亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，包括SLC7A11，GPx4，TFR-1，Fpn1，結(jié)果表明沉默TIMP1顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的TFR-1表達(dá)的增加，但對(duì)SLC7A11，GPx4，Fpn1蛋白表達(dá)沒有影響 (圖3A-B)。進(jìn)一步研究表明，沉默TIMP1顯著降低了鐵離子水平，ROS和MDA的含量，以及ptgs2 mRNA的表達(dá)（圖3C-3F）。圖3G表明沉默TIMP1可以抑制CMECs細(xì)胞的死亡。提示MMP9/TIMP1比值的降低通過激活TFR-1導(dǎo)致CMEC鐵死亡。

圖3沉默TIMP1抑制CMEC鐵死亡通過下調(diào)TFR-1

4、miR-30b-5p抑制AngⅡ誘導(dǎo)的CMECs的鐵死亡

通過在線軟件發(fā)現(xiàn)miR-30b-5p與TIMP1的3’UTR區(qū)域有互補(bǔ)配對(duì)序列（圖4A）。熒光素酶實(shí)驗(yàn)揭示miR-30b-5p能夠抑制野生型(WT) TIMP1的熒光素酶活性，而TIMP1 3’UTR的突變形式對(duì)miR-30b-5p的反應(yīng)較弱（圖4B）。心肌肥厚大鼠心肌組織和Ang II誘導(dǎo)的CMECs中miR-30b-5p降低（圖4C-4D）。下一步將miR-30b-5p mimic和AMO-miR-30b-5p轉(zhuǎn)染至CMECs，檢測(cè)miR-30b-5p對(duì)CMECs鐵死亡反應(yīng)的影響（圖4E）。在Ang II-induced CMECs，過表達(dá)miR-30b-5p導(dǎo)致TIMP1和TFR-1蛋白表達(dá)，ROS和MDA含量，鐵離子濃度，ptgs2的mRNA水平顯著降低，并顯著提高細(xì)胞生存能力和MMP9的蛋白表達(dá)，而這些效果能被AMO-miR-30b-5p逆轉(zhuǎn)（圖4F-M）。表明過表達(dá)miR-30b-5p可顯著抑制暴露于Ang II的CMECs的鐵死亡。然而，AMO-miR-30b-5p抑制了miR-30b-5p對(duì)CMECs的保護(hù)作用（圖4N）。

隨后，lncRNA的ceRNA機(jī)制調(diào)控引miR-30b-5p起了作者的興趣。作者發(fā)現(xiàn)有11個(gè)lncRNA與miR-30b-5p共享一個(gè)高度保守的結(jié)合位點(diǎn)。檢測(cè)了這11個(gè)lncRNA在心肌肥厚大鼠心肌組織中的表達(dá)變化，結(jié)果顯示lncRNA AC115159.2、lncRNA AABR07017145.1 (lncRNA AAB)和lncRNA AABR07030334.1的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（圖4O）。qRT-PCR檢測(cè)這三種lncRNA在CMECs中對(duì)Ang II處理的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)在這些lncRNA中，只有l(wèi)ncRNA AAB顯著升高（圖4P）。圖4Q展示了lncRNA AAB和miR-30b-5p之間的結(jié)合位點(diǎn)。熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示，miR-30b-5p可抑制TIMP1的熒光素酶活性，但該抑制可被lncRNA AAB逆轉(zhuǎn)，AAB-mut突變形式對(duì)TIMP1的熒光素酶活性影響較?。▓D4R）。這些結(jié)果表明lncRNA AAB通過與miR-30b-5p相互作用，進(jìn)而調(diào)控CMECs的鐵死亡。

圖4 miR-30b-5p抑制AngⅡ誘導(dǎo)的CMECs的鐵死亡

5、納米復(fù)合物的制備、表征和細(xì)胞攝取

因此，如果能夠通過納米復(fù)合物有效地傳遞lncRNA AAB的小干擾RNA (siRNA)，就有可能抑制CMECs的鐵死亡。接下來，作者展示了納米復(fù)合物的制備和表征。如圖5A所示，中性粒細(xì)胞膜(NM) + si-AAB +單聚二氧化硅納米復(fù)合物（MSN）清楚地表現(xiàn)出真核細(xì)胞樣結(jié)構(gòu)，最外層為淺灰色的軟層，厚度為10 nm，與活細(xì)胞膜的厚度一致。所得到的MSNs為均勻的納米球，平均粒徑約為100 nm，如掃描電鏡圖像所示（圖5B-5C）。將孔徑調(diào)整到適合siRNA負(fù)載的大小，表面積保證了siRNA的高負(fù)載能力。此外，MSNs可進(jìn)行生物降解當(dāng)在胎牛血清中孵育24 h，這對(duì)體內(nèi)藥物有效的釋放和減少機(jī)體免疫副作用和積累具有重要意義。通過zeta電位的測(cè)定來研究MSN的表面修飾和電荷變化。當(dāng)MSN上載siRNA時(shí)，zeta電位下降到-14.6±1.06 mV，這與siRNA的負(fù)電荷有關(guān)（圖5D）。為了進(jìn)一步證實(shí)MSNs的介孔結(jié)構(gòu)，檢測(cè)了MSNs納米粒子的比表面積和孔徑。值分別為519 m2 g?1和2.4 nm左右排列良好的介孔（圖5E插圖），可以滿足后續(xù)siRNA的加載。x射線衍射(XRD)圖顯示，由于MSNs是無定型的，所以MSNs沒有明顯的峰值，但在2θ(22°)處有一個(gè)寬衍射峰（圖5F）。通過SDS-PAGE凝膠電泳，觀察到細(xì)胞膜和NM + si-AAB + MSN樣品中LFA-1和β2整合素的條帶（圖5G）。LFA-1和β2整合素的存在，保證了NM + si-AAB +MSN對(duì)損傷CMECs的有效靶向作用。

為了證明Ang II可以誘導(dǎo)CMECs損傷和炎癥，通過western blot檢測(cè)了ICAM-1的水平（圖5H-5I）。為了證明NM + si-AAB + MSN對(duì)CMECs的特異性識(shí)別和靶向傳遞，使用Ang II誘導(dǎo)CMs和CMECs損傷，然后和NM + si-AAB + MSN共孵育，并進(jìn)行染色。在CM中觀察到的FITC信號(hào)較弱，表明對(duì)NM + si-AAB + MSN的攝取較少，而在CMEM中，F(xiàn)ITC信號(hào)增強(qiáng)了3.8倍（圖5J-5K）。此外，細(xì)胞攝取si-AAB + MSN和NM + si-AAB + MSN的結(jié)果經(jīng)過流式分析，發(fā)現(xiàn)NM + si-AAB + MSN組的攝取信號(hào)顯著增加（圖5L-5M）。以上表明NM + si-AAB + MSN可以被CMEM特異性獲取。

圖5納米復(fù)合物的準(zhǔn)備和鑒定

6、NM + si-AAB + MSN抑制CMEM鐵死亡通過上調(diào)miR-20b-5p

圖6A展示了細(xì)胞內(nèi)化和納米復(fù)合物細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)解構(gòu)，包括靶向識(shí)別、細(xì)胞內(nèi)化、胞內(nèi)細(xì)胞膜分離，和NM + si-AAB + MSN的降解以及siRNA釋放。在這種良好的減少反應(yīng)下，NM + si-AAB + MSN可以有效地沉默CMECs中l(wèi)ncRNA AAB的表達(dá)，當(dāng)siRNA劑量為30 nM時(shí)可以抑制超過70%的lncRNA AAB的表達(dá)（圖6B）。圖6C和圖6D顯示，和AngⅡ組相比，si-AAB + MSN和NM + si-AAB + MSN組的CMEM細(xì)胞活力顯著增加。圖6E表明AngⅡ誘導(dǎo)導(dǎo)致CMEM細(xì)胞的PECAM-1不完全染色，而si-AAB + MSN和NM + si-AAB + MSN組的外周染色均勻。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)si-AAB + MSN和NM + si-AAB + MSN顯著上調(diào)miR-30b-5p的表達(dá)和MMP9的蛋白表達(dá)，下調(diào)TIMP1和TFR-1的蛋白表達(dá)(圖6F-6H)。與Ang II組相比，si-AAB組的鐵離子、ROS、MDA、ptgs2水平和細(xì)胞死亡幾乎沒有變化，而si-AAB +MSN和NM + si-AAB +MSN組的鐵離子、ROS、MDA、ptgs2水平和細(xì)胞死亡明顯降低，且NM + si-AAB +MSN組最低，表明NM + si-AAB +MSN可以有效抑制鐵死亡(圖6I-6M)。這些結(jié)果表明，NM + si-AAB + MSN通過上調(diào)miR-30b-5p對(duì)Ang II暴露的CMECs的鐵死亡抑制作用最有效。

圖6通過NM+si-AAB+MSN沉默lncRNA AAB反轉(zhuǎn)CMEC的鐵死亡

7、NM+si-AAB+MSN修復(fù)心肌肥厚的心肌微血管內(nèi)皮的損傷

在AAC處理建立心肌肥厚動(dòng)物模型后，將心肌肥厚大鼠隨機(jī)分為4組。24 h后，心肌肥厚大鼠分別經(jīng)尾靜脈注射PBS、si-AAB、si-AAB +MSN、NM + si-AAB +MSN，每2 d注射1次，連續(xù)4周（圖7A）。為了確保NM + si-AAB + MSN始終能夠靶向心臟，在AAC后的第3天、第9天和第27天測(cè)定了心肌組織中ICAM-1的蛋白水平。結(jié)果顯示，ICAM-1在這些不同時(shí)間點(diǎn)的蛋白表達(dá)明顯高于假手術(shù)組(圖7B和7C)。然后，通過定量MSN熒光信號(hào)的生物成像研究了納米復(fù)合物在心臟的分布。si-AAB + MSN組心臟出現(xiàn)輕微熒光信號(hào)；在NM + si-AAB + MSN組中，心臟中觀察到明顯信號(hào)，表明納米復(fù)合物對(duì)受損的內(nèi)皮細(xì)胞具有良好的靶向特異性(圖7D)。觀察NM + si-AAB +MSN對(duì)肥厚心臟微血管鐵死亡的體內(nèi)治療作用。電鏡觀察結(jié)果顯示，PBS處理模型組CMEC細(xì)胞線粒體萎縮(圖7E)。si-AAB組和si-AAB +MSN組的鐵離子水平變化不明顯，而NM + si-AAB +MSN組的鐵離子水平明顯下降，說明NM + si-AAB +MSN對(duì)心肌微血管具有良好的抗鐵死亡作用。此外，NM + si-AAB + MSN可增加心肌微血管密度（圖7F），并在恢復(fù)LVEF和LVFS方面表現(xiàn)較好（圖7G-7I）。腦室組織病理學(xué)顯示與PBS處理模型組相比，只有NM + si-AAB + MSN組產(chǎn)生的截面積更小，表現(xiàn)出明顯的心臟形態(tài)保護(hù)作用(圖7J和7K)。與模型組相比，si-AAB和si-AAB +MSN組BNP和β-MHC蛋白水平變化不大，而NM + si-AAB +MSN組BNP和β-MHC蛋白水平顯著降低，表明NM + si-AAB +MSN在體內(nèi)能有效抑制心肌肥厚（圖7L-7M）。以上表明，M+si-AAB+MSN能在體內(nèi)修復(fù)心肌肥厚的心肌微血管內(nèi)皮的損傷。

圖7通過NM+si-AAB+MSN沉默lncRNA AAB抑制心肌肥厚

總之，如圖8所示，本研究通過合理設(shè)計(jì)納米復(fù)合物，實(shí)現(xiàn)了si-AAB高效加載和細(xì)胞膜覆蓋，從而有效地履行其對(duì)心肌肥厚內(nèi)皮損傷的精確修復(fù)功能。

圖8 NM+si-AAB+MSN通過抑制CMEC鐵死亡調(diào)節(jié)心肌肥厚的機(jī)制模型圖

參考文獻(xiàn)：

Shi Pilong., Li Minghui., Song Chao., Qi Hanping., Ba Lina., Cao Yonggang., Zhang Meitian., Xie Yawen., Ren Jing., Wu Jiabi., Ren Ping., Sun Hongli.(2022). AABR07017145.1Neutrophil-like cell membrane-coated siRNA of lncRNA  therapy for cardiac hypertrophy via inhibiting ferroptosis of CMECs. Mol Ther Nucleic Acids, 27(undefined), 16-36. doi:10.1016/j.omtn.2021.10.024