caspase-4非典型炎癥小體的胞質(zhì)固有免疫感應(yīng)促進(jìn)細(xì)胞衰老

   人類細(xì)胞中微生物脂多糖(LPS)的胞質(zhì)識(shí)別是由caspase-4和caspase-5非典型炎癥小體引起的，它們誘導(dǎo)一種稱為焦亡的炎癥細(xì)胞死亡形式。目前，有研究發(fā)現(xiàn)LPS介導(dǎo)的caspase-4的激活也會(huì)誘導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞衰老，這依賴于caspase-4底物gasdermin-D和腫瘤抑制因子p53。該研究發(fā)表在《Cell Death & Differentiation》，IF：15.828。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1． Caspase-4識(shí)別LPS誘導(dǎo)人二倍體成纖維細(xì)胞衰老

為了檢測(cè)炎癥性caspases在LPS轉(zhuǎn)染后獲得衰老表型中的作用，在轉(zhuǎn)染前用shRNA下調(diào)CASP1或CASP4的表達(dá)(圖1A)。與caspase-1相比，caspase-4在獲得衰老特征方面是必需的(圖1B-D)。然而，CASP4的過表達(dá)加劇了細(xì)胞內(nèi)LPS存在下的衰老特征的獲得(圖1E, F)，表明caspase-4的表達(dá)對(duì)非典型炎癥小體誘導(dǎo)的衰老至關(guān)重要。caspase-4和gasdermin-D的下調(diào)，會(huì)導(dǎo)致LPS轉(zhuǎn)染介導(dǎo)的細(xì)胞死亡，這證實(shí)了細(xì)胞因焦亡而死亡（圖1G）。總之，這些結(jié)果表明，細(xì)胞內(nèi)LPS暴露后的衰老表型的獲得是通過caspase-4介導(dǎo)的，且呈劑量依賴性。

通過shRNA，研究caspase-4底物gasdermin-D和p53在LPS誘導(dǎo)的衰老和焦亡中的作用。TP53和GSDMD基因敲除顯著降低了LPS依賴性細(xì)胞生長(zhǎng)停滯，以及p53和p21^CIP1的誘導(dǎo)(圖1H, I, J)。在LPS誘導(dǎo)的衰老過程中，GSDMD的下調(diào)對(duì)p16^INK4a和caspase-4的誘導(dǎo)產(chǎn)生了強(qiáng)烈的影響(圖1J)。這些結(jié)果表明，由非典型炎癥體感應(yīng)的細(xì)胞質(zhì)LPS誘導(dǎo)了依賴于caspase-4、gasdermin-D和p53表達(dá)的衰老反應(yīng)。

圖1 LPS介導(dǎo)的caspase-4活化誘導(dǎo)人原代成纖維細(xì)胞衰老表型

2. caspase-4介導(dǎo)的LPS誘導(dǎo)的衰老反應(yīng)與IL-1β啟動(dòng)無關(guān)

IMR90成纖維細(xì)胞中唯一過表達(dá)CASP4或CASP1的衰老誘導(dǎo)并沒有誘導(dǎo)IL1B的轉(zhuǎn)錄激活(圖2A)。相比之下，IL1B轉(zhuǎn)錄水平在LPS轉(zhuǎn)染后以caspase-4依賴的方式增加(圖2B)。作者之前已經(jīng)證明TLR2在細(xì)胞衰老中控制IL1B表達(dá)和SASP的作用。因此，進(jìn)一步研究TLR2介導(dǎo)的炎性小體啟動(dòng)是否與LPS介導(dǎo)的caspase-4誘導(dǎo)的衰老協(xié)同作用。用TLR2激動(dòng)劑Pam2CKS4啟動(dòng)炎癥小體與LPS轉(zhuǎn)染顯著協(xié)同，以產(chǎn)生強(qiáng)大的IL-1β誘導(dǎo)，并且這種誘導(dǎo)通過CASP4異位過度表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)(圖2C)。然而，通過添加Pam2CKS4，沒有觀察到LPS誘導(dǎo)的衰老中細(xì)胞增殖或SA-β-半乳糖苷酶誘導(dǎo)的顯著減少(圖2D, E)。然而，與OIS中觀察到的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)相比，在所有條件下，LPS轉(zhuǎn)染細(xì)胞中觀察到的IL1B mRNA水平的增加都是最小的(圖2C)。這些結(jié)果表明，在LPS介導(dǎo)的細(xì)胞衰老過程中，caspase-4刺激的額外信號(hào)，如持續(xù)啟動(dòng)信號(hào)，對(duì)于IL1B和SASP的強(qiáng)烈誘導(dǎo)是必要的。此外，這些數(shù)據(jù)表明LPS誘導(dǎo)的caspase-4衰老反應(yīng)是獨(dú)立于IL1B和SASP的。

圖2 LPS介導(dǎo)的caspase-4誘導(dǎo)的衰老不依賴于炎性小體啟動(dòng)

3． caspase-4的蛋白水解活性對(duì)LPS誘導(dǎo)的衰老不是必需的

為了進(jìn)一步研究caspase-4蛋白酶的蛋白酶活性對(duì)衰老的貢獻(xiàn)，caspase-4野生型和催化死亡突變體C258A（CASP4^C258A）在IMR90細(xì)胞中過度表達(dá)(圖3A)，并評(píng)估表型結(jié)果。野生型CASP4或CASP4^C258A的過度表達(dá)在類似程度上減少了細(xì)胞增殖并增加了SA-β-半乳糖苷酶活性(圖3B, C)。LPS轉(zhuǎn)染前，CASP4野生型和CASP4^C258A在IMR90成纖維細(xì)胞中穩(wěn)定過表達(dá)(圖3D)。在LPS轉(zhuǎn)染后，表達(dá)CASP4^C258A而非CASP4野生型的IMR90細(xì)胞對(duì)細(xì)胞死亡具有抵抗力(圖3E)，表明caspase-4缺陷型在細(xì)胞焦亡中起主要的負(fù)作用。然而，在LPS刺激后，CASP4野生型和CASP4^C258A過表達(dá)細(xì)胞對(duì)衰老特征的獲得同樣敏感(圖3F)。這些結(jié)果表明，與caspase-4介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡相反，caspase-4在LPS誘導(dǎo)的衰老中的作用與其催化活性無關(guān)。

圖3 Caspase-4介導(dǎo)的衰老調(diào)控獨(dú)立于其催化功能

4． 在癌基因誘導(dǎo)的衰老過程中，caspase-4非經(jīng)典炎癥體被誘導(dǎo)和組裝

接下來，研究炎性caspase-4在癌基因誘導(dǎo)衰老(OIS)中的作用。為了誘導(dǎo)OIS, HRASG12V(以下簡(jiǎn)稱RASG12V) 在IMR90人成纖維細(xì)胞中持續(xù)過度表達(dá)。RASG12V過表達(dá)降低了細(xì)胞增殖，增加了SA-β-半乳糖苷酶活性(圖4A)。與細(xì)胞周期抑制劑p21CIP1、p16INK4a和p15INK4b的上調(diào)相一致，RASG12V過表達(dá)后，caspase-4在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)均增加(圖4B, C)。接下來，作者利用他們和其他人廣泛使用的誘導(dǎo)系統(tǒng)來嚴(yán)格控制衰老的開始。在該系統(tǒng)中，雌激素受體(ER)配體結(jié)合域的突變形式與相關(guān)蛋白（RAS）融合；因此，在添加4-羥基三苯氧胺(4OHT)后，ER:RAS細(xì)胞發(fā)生OIS(圖4D)。與未處理的IMR90 ER:RAS細(xì)胞相比，加入4OHT后，IMR90 ER:RAS細(xì)胞增殖停止，SA-β-半乳糖苷酶活性增加(圖4D)。使用該系統(tǒng)的時(shí)間過程實(shí)驗(yàn)顯示，在OIS處理的細(xì)胞中，CASP4 mRNA水平與IL1B mRNA表達(dá)呈指數(shù)增長(zhǎng)并行增加(圖4E, F)， caspase-4蛋白水平也呈指數(shù)增長(zhǎng)(圖4G)。4OHT處理后3天，在IMR90 ER:RAS衰老細(xì)胞中檢測(cè)到內(nèi)源性caspase-4寡聚，但在對(duì)照細(xì)胞中未檢測(cè)到(圖4H)。此外，在添加4OHT后4天和8天，IMR90 ER:RAS細(xì)胞中caspase-4蛋白水解活性也增加(圖4I)。這些結(jié)果表明，在OIS中誘導(dǎo)了caspase-4的表達(dá)，并組裝了非標(biāo)準(zhǔn)炎癥小體。

圖4 caspase-4非典型炎癥小體在癌基因誘導(dǎo)的衰老中被激活

5． 在OIS中，caspase-4非典型炎癥小體是炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的

接下來，在IMR90 ER:RAS系統(tǒng)中研究了caspase-4在OIS中的功能作用。IMR90 ER:STOP和ER:RAS細(xì)胞轉(zhuǎn)染對(duì)照組和CASP4靶向小干擾RNA（siRNA），在加入4OHT后5天和8天收集樣本，分別在caspase-4激活后和完全SASP形成后收集樣本，并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析(圖5A)。差異表達(dá)基因分析發(fā)現(xiàn)，在CASP4敲除后，有557和478個(gè)基因顯著差異表達(dá)(FDR 10%)，其中340個(gè)和240個(gè)基因分別在加入4OHT5天和8天后，在RASG12V-OIS細(xì)胞中以CASP4依賴方式誘導(dǎo)表達(dá)(圖5A)。進(jìn)行基因組富集分析(GSEA)顯示，在加入4OHT5天和8天后，RASG12V-OIS細(xì)胞中與炎癥過程(包括TNF-α信號(hào)和干擾素反應(yīng))相關(guān)的基因組存在CASP4依賴調(diào)節(jié)(圖5B)。繪制炎癥反應(yīng)基因組中所有基因的對(duì)照組IMR90 ER:STOP和CASP4敲除與對(duì)照組IMR90 ER:RAS細(xì)胞的折疊變化值的熱圖，揭示了一種模式，通過該模式，如果以CASP4為靶點(diǎn)，包括SASP因子，在衰老過程中增加的炎癥相關(guān)基因的表達(dá)被消除(圖5C)。RT-qPCR驗(yàn)證IL1A和IL1B表達(dá)的變化(圖5D, E)。當(dāng)CASP4在OIS中被靶向時(shí)，SAA1和SAA2的表達(dá)也降低了(圖5F, G)。此外，當(dāng)CASP1或CASP4被靶向時(shí)，細(xì)胞內(nèi)成熟IL-1β的水平也顯著降低(圖5H, I, J)。此外，當(dāng)CASP4被靶向時(shí)，在RAS^G12V誘導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)液中，分泌IL-1β的濃度顯著降低(圖5K)。此外，用兩個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒shRNA載體抑制CASP4的表達(dá)也會(huì)影響OIS中IL1B、IL6和IL8 mRNA的誘導(dǎo)，增加了數(shù)據(jù)的特異性和穩(wěn)健性(圖5L)?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明caspase-4參與了caspase-1介導(dǎo)的OIS中SASP的激活。

圖5 Caspase-4激活調(diào)控促炎SASP

6． 在OIS中，caspase-4非典型炎癥小體有助于抑制細(xì)胞增殖

在使用shRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的長(zhǎng)期細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)中，casp4靶向siRNA轉(zhuǎn)染顯著挽救了早期細(xì)胞增殖停滯(圖6A)，并增加了總細(xì)胞含量(圖6B, C)。GSEA顯示CASP4在RAS^G12V-OIS基因標(biāo)記”G2M CHECKPOINT”和”E2F TARGET”中呈負(fù)性調(diào)控，CDKN2A (p16^INK4a-p14^ARF)和CDKN2B (p15^INK4b)位點(diǎn)的表達(dá)，而p21^CIP1沒有表達(dá)(圖5B、6D)。靶向CASP4降低了p16^INK4a的表達(dá)，挽救了pRb的磷酸化（圖6E），并導(dǎo)致E2F靶基因水平的轉(zhuǎn)錄增加（圖6F），這表明caspase-4通過控制OIS中p16^INK4a和p15^INK4b的表達(dá)來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。這些結(jié)果表明，caspase-4有助于阻止細(xì)胞衰老過程中的增殖，最終影響pRb的磷酸化狀態(tài)，從而導(dǎo)致E2F靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制。

圖6在OIS中Caspase-4有助于抑制細(xì)胞增殖

7． Caspase-11在體內(nèi)細(xì)胞衰老過程中被誘導(dǎo)

在OIS模型中分析了caspase-4小鼠同源caspase-11的表達(dá)，在該模型中，Pdx-CRE條件表達(dá)Kras^G12D誘導(dǎo)小鼠胰腺中胰腺上皮內(nèi)瘤變(PanIN)(圖7A)。在野生型小鼠中，與周圍胰腺腺泡細(xì)胞、較高級(jí)別的PanINs以及導(dǎo)管和腺泡細(xì)胞相比，低級(jí)別PanINs對(duì)caspase-11呈陽性染色(圖7A)。PanIN中Ki-67染色的定量顯示，caspase-11的表達(dá)僅限于具有低增殖指數(shù)的早期衰老病變(圖7B)，表明caspase-11表達(dá)與低級(jí)別PanIN病變中的低細(xì)胞增殖相關(guān)。與野生型小鼠相比，nfkb1^-/-小鼠的肺中脂褐素積累增加(圖7C)。在表達(dá)caspase-11的細(xì)胞中檢測(cè)到類似的脂褐素積累增加(圖7C)。此外，在野生型和nfkb1^-/-小鼠的小氣道上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了p21和caspase-11之間的相關(guān)性(圖7D)，表明在小鼠加速衰老模型中，caspase-11與衰老標(biāo)志物相關(guān)。老年小鼠(24個(gè)月)的肺泡細(xì)胞顯示端粒相關(guān)DNA損傷反應(yīng)foci數(shù)量增加(圖7E)，這是組織中衰老細(xì)胞積累的標(biāo)志，我們發(fā)現(xiàn)這與caspase-11的增加同時(shí)發(fā)生(圖7F)。總之，這些結(jié)果支持非典型炎癥小體促進(jìn)體內(nèi)衰老的模型。

圖7 Caspase-11在體內(nèi)衰老過程中的表達(dá)

主要結(jié)論：

細(xì)胞衰老是由非典型炎癥小體的胞質(zhì)LPS識(shí)別誘導(dǎo)的，并且這一途徑在細(xì)胞對(duì)致癌應(yīng)激的反應(yīng)中是保守的。作者提出非經(jīng)典炎癥小體的操縱可以為針對(duì)SASP的seno-therapies提供新的理論基礎(chǔ)，并誘導(dǎo)癌癥和衰老中的細(xì)胞焦亡。