Rab2A通過(guò)穩(wěn)定PPARγ調(diào)控AMPK-TBC1D1軸下游非酒精性脂肪性肝病的進(jìn)展

  非酒精性脂肪肝(NAFLD)的發(fā)病率約占全世界人口的四分之一，持續(xù)的營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩是其主要原因之一。然而，其潛在的分子基礎(chǔ)尚未完全闡明，也沒(méi)有專門(mén)的藥物被批準(zhǔn)用于這種疾病。目前，由作者發(fā)現(xiàn)了一個(gè)調(diào)控機(jī)制，揭示了Rab2A在NAFLD進(jìn)展中基于能量狀態(tài)和PPARγ的新功能。該研究于2022年1月發(fā)表在《PLoS biology》，IF：8.029。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：
1.阻斷AMPK-TBC1D1軸導(dǎo)致老年小鼠肝臟脂質(zhì)沉積
  作者在4 - 6月齡、12月齡和18月齡的TBC1D1-KI小鼠中檢測(cè)了NAFLD相關(guān)表型：12月齡和18月齡TBC1D1-KI小鼠肝臟切片大脂滴積累顯著增加(圖1A和1B)，同時(shí)TG水平嚴(yán)重升高(圖1C)。上述數(shù)據(jù)表明，阻斷AMPK-TBC1D1軸導(dǎo)致老年小鼠肝脂積累。然后對(duì)18個(gè)月大的小鼠肝臟進(jìn)行RNA測(cè)序，熱圖分析脂質(zhì)沉積類基因Cidea、Cidec和Plin4表達(dá)增加，它們是PPARγ的靶基因(圖1D)，q-PCR結(jié)果也證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)(圖1E)。此外，還觀察到12月齡和18月齡TBC1D1-KI小鼠PPARγ蛋白水平顯著升高，而PPARγ mRNA水平無(wú)明顯差異(圖1F-1H)，這些效應(yīng)導(dǎo)致PPARγ活性升高。綜上所示，阻斷AMPK-TBC1D1軸可能通過(guò)激活PPARγ信號(hào)通路導(dǎo)致老年小鼠發(fā)生NAFLD。

2. AMPK-TBC1D1軸調(diào)控PPARγ的蛋白穩(wěn)定性和功能
  AMPK激活劑A769662處理以劑量依賴的方式增加AMPK及底物乙酰COA羧化酶(ACC)的磷酸化，并且AMPK的激活狀態(tài)在空載體或WT TBC1D1或TBC1D1^S237A突變體的細(xì)胞中是相似的(圖2A和2B)。A769662激活AMPK后，外源性PPARγ2(圖2A)和內(nèi)源性PPARγ(圖2B)逐漸下降，這與A769662的劑量有關(guān)。WT TBC1D1的表達(dá)同時(shí)提高了外源性PPARγ2和內(nèi)源性PPARγ的表達(dá)，而在A769662處理下AMPK激活后，外源性PPARγ2和內(nèi)源性PPARγ的表達(dá)仍然降低(圖2A和2B)。在TBC1D1^S237A突變體細(xì)胞中，A769662誘導(dǎo)的外源性PPARγ2和內(nèi)源性PPARγ的減少被阻止(圖2A和2B)。
  接下來(lái)研究了TBC1D1 KI突變誘導(dǎo)的脂質(zhì)儲(chǔ)存基因的表達(dá)是否確實(shí)是由PPARγ介導(dǎo)的。作者采用了兩種細(xì)胞模型，即表達(dá)TBC1D1^WT或TBC1D1^S237A蛋白的HepG2細(xì)胞和來(lái)自WT和TBC1D1^S231A-KI小鼠的原代肝細(xì)胞。TBC1D1^S237A突變蛋白的表達(dá)顯著增加了PPARγ靶基因PLIN3、PLIN5、CIDEA、FSP27/CIDEC、FABP1、FABP4和FABP5在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)(圖2C)和細(xì)胞中TG含量的升高(圖2D)。同樣，PPARγ基因的敲除挽救了脂質(zhì)儲(chǔ)存基因如Plin3、Plin5、Cidea、Fsp27/Cidec、Fabp1、Fabp4和Fabp5的表達(dá)(圖2E)，并阻止了TG在TBC1D1^S231A-KI小鼠原代肝細(xì)胞中的積累(圖2F)。總之，這些數(shù)據(jù)確定了AMPK-TBC1D1軸在調(diào)節(jié)PPARγ蛋白中的因果作用，并且AMPK-TBC1D1連接的破壞增加PPARγ蛋白，通過(guò)提高肝細(xì)胞中脂質(zhì)儲(chǔ)存基因的表達(dá)促進(jìn)TG積累。

3. Rab2A作為AMPK-TBC1D1軸的下游蛋白，調(diào)控PPARγ的蛋白水平
  體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了TBC1D1和PPARγ2之間的直接相互作用(圖3A)。而TBC1D1^S237A突變蛋白仍然具有與PPARγ相互作用的能力，其方式與WT TBC1D1類似(圖3A)，表明TBC1D1- s237磷酸化并不影響TBC1D1與PPARγ的相互作用。GAP非活性TBC1D1^R854K突變體的過(guò)度表達(dá)增加了PPARγ2蛋白，其程度類似于TBC1D1^S237A突變體蛋白(圖3B)。內(nèi)源性PPARγ在Rab2A過(guò)表達(dá)細(xì)胞中升高(圖3C)，而在Rab2A敲低表達(dá)細(xì)胞中降低(圖3D)。在HepG2細(xì)胞中，TBC1D1^S237A蛋白的過(guò)度表達(dá)(而非WT TBC1D1)顯著增加了Rab2A的GTP結(jié)合形式(圖3E)。此外，在TBC1D1-KI小鼠(18個(gè)月大)的肝臟中，Rab2A的GTP結(jié)合形式顯著增加，而Rab2A的總水平不變(圖3F和3G)。這些數(shù)據(jù)表明，TBC1D1-S231A突變導(dǎo)致細(xì)胞中Rab2A的激活。TBC1D1 WT或S237A蛋白誘導(dǎo)的外源性PPARγ2(圖3H)的增加通過(guò)shRNA敲除Rab2A而減弱。在HepG2細(xì)胞中，Rab2A的敲除阻止了TBC1D1^S237A突變蛋白誘導(dǎo)的脂質(zhì)儲(chǔ)存基因，包括PLIN3、CIDEA、FSP27/CIDEC、FABP1和FABP5(圖3I)，并阻斷了TG的積累(圖3J)。同樣，Rab2A基因的下調(diào)也恢復(fù)了脂質(zhì)儲(chǔ)存基因Plin2、Plin3、Plin5、Cidea、Fsp27/Cidec、Fabp1、Fabp4和Fabp5的表達(dá)(圖3K)，并阻止了TG在TBC1D1S231A-KI小鼠原代肝細(xì)胞中的積累(圖3L)。這些數(shù)據(jù)表明，Rab2A在TBC1D1下游發(fā)揮基因作用，調(diào)控PPARγ在肝臟脂質(zhì)儲(chǔ)存中的作用。

4.Rab2A的GTP結(jié)合形式結(jié)合并抑制PPARγ的蛋白酶體降解
  在共免疫沉淀試驗(yàn)中，在Flag-Rab2A的免疫沉淀中發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性PPARγ(圖4A)。在體外GST-pulldown實(shí)驗(yàn)中，GST-PPARγ2也能與Flag-Rab2A結(jié)合(圖4B)。此外，影像學(xué)研究顯示，部分PPARγ2-mCherry存在于細(xì)胞質(zhì)中，并與主要存在于細(xì)胞質(zhì)中的EGFP-Rab2A共定位(圖4C)。Rab2A的GTP結(jié)合形式顯著提高了內(nèi)源性PPARγ(圖4D)的蛋白水平。此外，在共免疫沉淀試驗(yàn)中，Rab2A的GTP結(jié)合形式與PPARγ2-MYC相互作用(圖4E)。在共免疫沉淀試驗(yàn)中，AF-2結(jié)構(gòu)域的缺失阻止了PPARγ2與Rab2A的結(jié)合(圖4F)。這些數(shù)據(jù)表明，Rab2A的GTP結(jié)合活性形式可能與PPARγ的AF-2結(jié)構(gòu)域相互作用，從而提高PPARγ的蛋白質(zhì)水平。用蛋白酶體抑制劑MG132和ALLN處理，都能以濃度和時(shí)間依賴的方式導(dǎo)致PPARγ2-MYC的積累(圖4G-4N)。過(guò)表達(dá)Rab2A顯著減弱了這些蛋白酶體抑制劑對(duì)PPARγ2-MYC積累速率的影響(圖4G-4N)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明Rab2A的GTP結(jié)合形式與PPARγ的AF-2結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并抑制PPARγ的蛋白酶體降解。

5.營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)調(diào)控AMPK-TBC1D1-Rab2A軸的活性，進(jìn)而調(diào)控PPARγ的蛋白水平
  DIO小鼠中的過(guò)度營(yíng)養(yǎng)會(huì)使AMPK失活，從而導(dǎo)致肝臟中TBC1D1的磷酸化降低(圖5A和5B)。Rab2A在DIO小鼠的肝臟中成為GTP負(fù)載的活性形式(圖5A和5B)。DIO小鼠肝臟中Pparγ1和Pparγ2 mRNA水平均未發(fā)生變化(圖5C)，而蛋白水平顯著升高(圖5A和5B)。此外，DIO小鼠肝臟PPARγ靶基因也顯著增加(圖5C)。這些數(shù)據(jù)表明，AMPK-TBC1D1-Rab2A軸對(duì)營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩做出反應(yīng)，以增加小鼠肝臟中的PPARγ蛋白。在HEK293T和HepG2細(xì)胞中，葡萄糖饑餓激活了AMPK通路，AMPK和ACC的磷酸化增加，使TBC1D1在237絲氨酸位點(diǎn)磷酸化(圖5D-5G)。葡萄糖饑餓降低了HEK293T細(xì)胞外源性PPARγ2- MYC的蛋白水平(圖5D和5F)，也降低了HepG2細(xì)胞內(nèi)源性PPARγ的蛋白水平(圖5E和5G)。AMPK抑制劑化合物C劑量依賴性地抑制了葡萄糖饑餓誘導(dǎo)的AMPK激活，進(jìn)而抑制了兩種細(xì)胞類型中葡萄糖饑餓誘導(dǎo)的TBC1D1磷酸化(圖5H和5I)。化合物C劑量依賴性地恢復(fù)外源PPARγ2- MYC在葡萄糖饑餓HEK293T細(xì)胞中的蛋白水平(圖5H)以及內(nèi)源性PPARγ在葡萄糖饑餓HepG2細(xì)胞中的蛋白水平(圖5I)。此外，在HepG2細(xì)胞中，葡萄糖消耗降低了Rab2A的GTP結(jié)合形式，而化合物C逆轉(zhuǎn)了這種效應(yīng)(圖5J)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明AMPK-TCB1D1-Rab2A軸調(diào)節(jié)PPARγ蛋白水平以響應(yīng)營(yíng)養(yǎng)狀況。

6.Rab2A調(diào)節(jié)細(xì)胞脂質(zhì)積累
  油紅O染色顯示，Rab2A穩(wěn)定過(guò)表達(dá)導(dǎo)致HepG2細(xì)胞脂滴積累(圖6A和6B)。與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)Rab2A的HepG2細(xì)胞的細(xì)胞TG和總膽固醇(TC)水平顯著升高(圖6C和6D)?；虮倔w論表達(dá)的差異基因主要參與TG穩(wěn)態(tài)和脂蛋白顆粒重塑和運(yùn)輸(圖6E)。在穩(wěn)定過(guò)度表達(dá)Rab2A的HepG2細(xì)胞中，PPARγ靶基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著增加，如PLIN4、CIDEA和FSP27/CIDEC(圖6F)。Rab2A對(duì)PPARγ靶基因表達(dá)及細(xì)胞TG積累的影響取決于其鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合狀態(tài)。與GTP結(jié)合的Rab2A^Q65L促進(jìn)PPARγ靶基因的表達(dá)(圖6G)，并引起細(xì)胞中TG的積累(圖6H)。PPARγ基因的下調(diào)抑制了Rab2A^Q65L誘導(dǎo)的PPARγ靶基因的表達(dá)(圖6G)，并阻止了Rab2A^Q65L誘導(dǎo)的細(xì)胞TG積累(圖6H)。與過(guò)表達(dá)Rab2A相比，在HepG2細(xì)胞中穩(wěn)定下調(diào)Rab2A可降低細(xì)胞脂滴數(shù)量(圖6I和6J)并抑制PPARγ靶基因的mRNA表達(dá)(圖6K)。這些數(shù)據(jù)表明，Rab2A通過(guò)PPARγ調(diào)控脂質(zhì)儲(chǔ)存基因表達(dá)和細(xì)胞TG積累。

7.抑制Rab2A可減輕飲食誘導(dǎo)的肝脂積累
  通過(guò)AAV8介導(dǎo)的shRab2A下調(diào)DIO小鼠肝臟中Rab2A的表達(dá)。在給予表達(dá)shRNA的AAV8 2個(gè)月后，對(duì)小鼠進(jìn)行分子和生理分析。小鼠肝臟的分子分析證實(shí)了Rab2A在mRNA和蛋白水平上的顯著下降(圖7A)。不僅shRab2A小鼠肝臟內(nèi)源性PPARγ2蛋白顯著降低，而且這些小鼠的內(nèi)源性PPARγ1蛋白也觀察到較不明顯的降低(p = 0.057)，同時(shí)PPARγmRNA保持正常(圖7A和7B)。除了PPARγ蛋白的降低，脂質(zhì)代謝相關(guān)基因和膽固醇合成相關(guān)基因在蛋白水平上的表達(dá)降低，而FGF21在shRab2A小鼠的肝臟中顯著增加(圖7A和7B)。shRab2A小鼠肝臟中TG含量顯著降低(圖7C)，shRab2A小鼠肝臟TC水平下降(圖7D)，shRab2A小鼠血清TG和TC水平均顯著降低(圖7E和7F)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，抑制Rab2A降低了PPARγ蛋白，從而減輕了飲食誘導(dǎo)的體內(nèi)肝脂積累。

結(jié)論：
  綜上所述，作者發(fā)現(xiàn)Rab2A在AMPK-TBC1D1軸下游發(fā)揮遺傳作用，調(diào)控肝臟PPARγ蛋白的穩(wěn)定性，從而調(diào)控PPARγ靶基因的表達(dá)，使TG在肝臟中積累，以響應(yīng)能量/營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，這對(duì)脂肪肝的治療有重要意義。