腦出血后CCR5激活通過CCR5/PKA/CREB途徑促進(jìn)NLRP1依賴性神經(jīng)元焦亡

   神經(jīng)元性焦亡是一種由促炎信號(hào)觸發(fā)的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡。CCR5（C-C趨化因子受體5）介導(dǎo)的炎癥參與各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過程。目前有研究探討了實(shí)驗(yàn)性腦出血（ICH）后CCR5激活對(duì)神經(jīng)元焦亡的影響以及涉及cAMP依賴的PKA /CREB /NLRP1通路的潛在機(jī)制。該研究2021年11月發(fā)表在《Stroke》，IF：7.9.

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1.   腦出血后腦內(nèi)CCR5的時(shí)空表達(dá)

   采用ELISA和Western blot檢測腦出血后0、3、6、12、24和72小時(shí)同側(cè)（右側(cè)）大腦半球CCL5、CCR5、PKACα、p-CREB和NLRP1的表達(dá)。與Sham組相比，在3小時(shí)時(shí)檢測到CCL5水平顯著升高，經(jīng)ELISA測定，24小時(shí)時(shí)CCL5水平相對(duì)較高。CCR5水平在腦出血后3小時(shí)顯著升高，在24小時(shí)達(dá)到峰值，并在72小時(shí)開始下降（圖1A）。腦出血后，CCR5的潛在下游蛋白PKACα和p-CREB也以與CCR5相似的模式暫時(shí)升高。與Sham組相比，腦出血后6小時(shí)NLRP1炎癥體表達(dá)顯著上調(diào)，72小時(shí)達(dá)到峰值（圖1A）。雙免疫熒光染色顯示腦出血后24小時(shí)CCR5主要表達(dá)于同側(cè)基底皮質(zhì)的神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞(圖1B)。

圖1  ICH后CCL5、CCR5、PKA-Cα、p-CREB、CREB和NLRP1蛋白水平的時(shí)空表達(dá)

2.   用MVC抑制CCR5可減輕腦出血后24和72小時(shí)的神經(jīng)行為缺陷

   在ICH后24小時(shí)，與Sham組相比，ICH+vehicle組有明顯的神經(jīng)損傷（圖2A）。與載體治療ICH組相比，每天150和450 μg/kg劑量的MVC治療在ICH后24小時(shí)的改良Garcia試驗(yàn)、前肢放置試驗(yàn)和轉(zhuǎn)角試驗(yàn)中顯著改善了神經(jīng)功能（圖2A）。

   根據(jù)這一結(jié)果，確定150μg/kg/天的劑量為MVC的最佳劑量，并在隨后的實(shí)驗(yàn)中使用。與ICH+載體組相比，在ICH后72小時(shí)，MVC治療顯著降低ICH小鼠的神經(jīng)行為缺陷（圖2B）。相反，與ICH+載體組相比，ICH后72小時(shí)首次給藥MVC并沒有顯著減少ICH小鼠的神經(jīng)行為缺陷（圖2C）。

圖2 MVC對(duì)ICH后24和72小時(shí)神經(jīng)行為結(jié)果的影響

3.   MVC介導(dǎo)的CCR5抑制降低了腦出血后24小時(shí)內(nèi)神經(jīng)元焦亡細(xì)胞的死亡

        TUNEL染色和Fluoro-Jade C染色分別用于評(píng)估MVC治療是否減少了神經(jīng)細(xì)胞死亡。在腦出血24小時(shí)后，用cleaved caspase-1標(biāo)記的神經(jīng)元核來評(píng)估神經(jīng)元焦亡。腦出血后24小時(shí)，與Sham組相比，腦出血大鼠的TUNEL陽性神經(jīng)元和Fluoro-Jade C陽性變性神經(jīng)元顯著增加（圖3A和3B）。MVC介導(dǎo)的CCR5抑制顯著減少TUNEL陽性神經(jīng)元和Fluoro-Jade C陽性退化神經(jīng)元數(shù)量（圖3A和3B）。與ICH+治療組相比，在ICH后24小時(shí)，MVC治療顯著減少了血腫周圍區(qū)域cleaved caspase-1陽性神經(jīng)元的數(shù)量（圖3C）。

圖3 ICH后24小時(shí)，用MVC抑制CCR5對(duì)神經(jīng)元損傷、焦亡的影響

4.       MVC改善了腦出血后的長期感覺運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)、空間學(xué)習(xí)和參考記憶功能，并減少了海馬氨角1（CA1）神經(jīng)元的丟失

       與Sham組相比，ICH+載體組在足部缺陷試驗(yàn)中有更多的左前肢足部缺陷，在ICH后的第一、第二和第三周，在rotarod試驗(yàn)中下降的潛伏期更短（圖4A）。而MVC治療顯著減少了左側(cè)前肢的足部缺陷（圖4A），但增加了ICH小鼠的下降潛伏期（圖4A）。在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，ICH+載體組的游泳距離和逃避潛伏期明顯長于Sham組。然而，與ICH+載體組相比，MVC治療顯著降低了第3-5區(qū)的逃避潛伏期和游泳距離（圖4A）。在探測象限試驗(yàn)中，與Sham組相比，ICH+載體組在目標(biāo)象限花費(fèi)的時(shí)間更少。然而，與ICH+載體組相比，MVC治療顯著增加了在探測象限花費(fèi)的時(shí)間（圖4A）。在ICH后第25天進(jìn)行Nissl染色以評(píng)估海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元丟失。結(jié)果顯示，ICH+載體組海馬CA1區(qū)存活的神經(jīng)元數(shù)量少于Sham組，但與ICH+載體組相比，MVC治療顯著增加了存活的CA1神經(jīng)元數(shù)量（圖4B）。

圖4 MVC改善了ICH后的長期神經(jīng)行為功能

5.   腦出血后24小時(shí)，CREB抑制劑逆轉(zhuǎn)MVC對(duì)神經(jīng)行為缺陷和CCR5/PKA Cα/CREB/NLRP1介導(dǎo)的焦亡的神經(jīng)保護(hù)作用

         ICH后24小時(shí)，用CREB抑制劑666-15預(yù)處理，可顯著逆轉(zhuǎn)MVC對(duì)改良Garcia、前肢放置和轉(zhuǎn)角測試的神經(jīng)行為益處（圖5A）。此外，MVC顯著增加同側(cè)腦出血后腦組織中PKA-Cα和p-CREB的蛋白水平，但降低NLRP1、ASC、C-caspase-1、N-GSDMD、IL-1β和IL-18的表達(dá)（圖5B）。與MVC治療的ICH小鼠相比，666-15一致逆轉(zhuǎn)了MVC對(duì)細(xì)胞死亡和CCR5/PKA-Cα/CREB/NLRP1信號(hào)通路的影響，這與NLRP1、ASC、C-caspase-1、N-GSDMD、IL-1β和IL-18的蛋白水平升高有關(guān)（圖5B）。

圖5 666-15對(duì)CREB的抑制消除了MVC對(duì)ICH小鼠的神經(jīng)功能益處和抗神經(jīng)性過敏作用

6.   在注射rCCL5后24小時(shí)，通過rCCL5激活CCR5，通過CCR5/PKA Cα/CREB/NLRP1信號(hào)通路導(dǎo)致幼稚小鼠出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損和焦亡

   側(cè)腦室注射rCCL5顯著降低了幼稚小鼠改良Garcia、肢體放置和轉(zhuǎn)角試驗(yàn)的神經(jīng)評(píng)分（圖6A），并導(dǎo)致同側(cè)腦組織中NLRP1、ASC、C-caspase-1、N-GSDMD、IL-1β和IL-18的蛋白水平顯著升高（圖6B）。相反，與naive + rCCL5 +載體組相比，PKA激活劑8-溴-cAMP通過顯著增加na?ve + rCCL5 + 8-Bromo-cAMP中PKA-Cα的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)了rCCL5的作用（圖6B）。

圖6 rCCL5通過激活CCR5/PKA-Cα/CREB/NLRP1信號(hào)通路對(duì)幼稚小鼠的有害影響

主要結(jié)論：

該研究表明，小鼠實(shí)驗(yàn)性腦出血后，CCR5激活至少部分通過CCR5/PKA/CREB信號(hào)通路促進(jìn)NLRP1依賴性神經(jīng)元焦亡和神經(jīng)功能缺損。使用MVC抑制CCR5可能在ICH患者的治療中提供一種有希望的治療策略。

參考文獻(xiàn)：

Yan J, Xu W, Lenahan C, Huang L, Wen J, Li G, Hu X, Zheng W, Zhang JH, Tang J. CCR5 Activation Promotes NLRP1-Dependent Neuronal Pyroptosis via CCR5/PKA/CREB Pathway After Intracerebral Hemorrhage. Stroke. 2021, 52(12):4021-4032. doi: 10.1161/STROKEAHA.120.033285.