RNA N6甲基腺苷讀取器IGF2BP2以m6A依賴的方式穩(wěn)定slug mRNA促進頭頸鱗癌細胞的淋巴轉移和上皮間質轉化

欄目:最新研究動態(tài) 發(fā)布時間:2022-02-17
目前對IGF2BP2在中的功能作用知之甚少,IGF2BP2是否通過m6A修飾在HNSCC中調節(jié)淋巴轉移仍有待確定......



淋巴結轉移是頭頸部鱗癌(HNSCC)患者預后不良的主要原因。N6甲基腺苷(m6ARNA修飾是一種新興的基因表達表觀遺傳調控機制,IGF2BP2作為一種新的m6A讀取器蛋白參與腫瘤的進展和轉移。然而,目前對IGF2BP2在中的功能作用知之甚少,IGF2BP2是否通過m6A修飾在HNSCC中調節(jié)淋巴轉移仍有待確定。目前,有相關研究于20221月發(fā)表在《JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH》,IF: 11.161


技術路線:


主要研究結果:

1.   m6A調控因子在HNSCC中的表達及臨床意義

為了研究m6A修飾在HNSCC中的作用,從TCGA數據庫中分析了502HNSCC44個正常組織中20m6A相關調控因子的表達譜。如圖1AB所示,與正常組織相比,HNSCC組織中20m6A調控基因中有18個顯著上調,包括6writersVIRMAZC3H13、METTL14、METTL3、WTAPRBM15)、2erasersFTOALKBH5)和10readersIGF2BP2、IGF2BP1IGF2BP3、YTHDF3、YTHDF2、YTHDC1、YTHDF1HNRNPC、RBMXHNRNPA2B1)。HNSCC組織和正常組織中YTHDC2RBM15B的表達水平無統(tǒng)計學差異。臨床相關性中,只有IGF2BP2的高表達與HNSCC患者較低的生存概率相關(圖1C)。Kaplan-Meier生存分析、多變量cox回歸分析后和病理N分期均表示IGF2BP2被確定為HNSCC中潛在的預后生物標志物(圖1C-1G)。

1 m6A調控因子在HNSCC中的表達及臨床意義


2.   IGF2BP2HNSCC組織中的高表達與淋巴轉移有關

臨床組織樣本中q-PCRwestern blot均表示IGF2BP2HNSCC腫瘤樣本中過表達(圖2A,2B)。通過臨床病理特征和隨訪數據,IGF2BP2NATs中表達量較低,在未發(fā)生淋巴轉移的HNSCC組織中表達量略有升高,但在有淋巴轉移的HNSCC組織中表達量強烈上調(圖2E,2F),且IGF2BP2高表達與較低的OS概率相關(圖2G)。此外,臨床病理特征分析顯示,IGF2BP2表達與病理N分型和淋巴結轉移顯著相關(表1)。單因素和多因素Cox回歸分析顯示,IGF2BP2表達是HNSCC患者的獨立預后因素(表2)??傊?,這些結果表明,在HNSCCIGF2BP2高表達,并在淋巴結轉移中發(fā)揮重要作用。

2 IGF2BP2HNSCC組織中高表達,與淋巴轉移相關




3.   IGF2BP2在體外促進HNSCC細胞的轉移行為

為了明確IGF2BP2是否能誘導HNSCC細胞的遷移和侵襲能力,對IGF2BP3進行敲降和過表達。通過RT-qPCRwestern blot驗證了敲除和過表達的有效性(圖3A,3B)。創(chuàng)傷愈合分析表明,IGF2BP2的敲除抑制了FaDuSCC15細胞的遷移能力,而過表達IGF2BP2后則出現相反的結果(圖3C,3D)。Transwell分析進一步證實了這一結果,顯示沉默IGF2BP2可減弱FaDuSCC15細胞的遷移性和侵襲性,而過表達IGF2BP2則增強了細胞的轉移??傊?,這些數據表明IGF2BP2促進HNSCC細胞的遷移和侵襲。

3 IGF2BP2促進體外HNSCC細胞轉移行為


4.  
在體內,IGF2BP2基因敲除可抑制淋巴轉移和淋巴管生成

為了進一步確定IGF2BP2HNSCC淋巴轉移中的作用,使用裸鼠建立腘窩淋巴結轉移模型(圖4A)。RT-qPCRwestern blot驗證IGF2BP2的沉默效率(圖4B,4C),然后將這些細胞注射插入裸鼠中。4周后,通過體內生物發(fā)光成像檢測IGF2BP2對淋巴轉移的影響。IGF2BP2基因敲除顯著抑制了HNSCC細胞的淋巴轉移(圖4D)。此外,sh-IGF2BP2組的腳掌腫瘤和腘窩淋巴結均比sh-NC組小、輕,提示IGF2BP2抑制了HNSCC的腫瘤發(fā)生和淋巴轉移(圖4E-J)。此外,sh-IGF2BP2組的LN轉移率低于sh-NC組(圖4K)。免疫組化分析顯示,沉默IGF2BP2顯著降低了小鼠組織瘤內和瘤周區(qū)域的微淋巴管密度水平,這由lyve1陽性微血管表明(圖4L)。這些結果表明,在體內,IGF2BP2基因敲除顯著抑制淋巴轉移和淋巴管生成。

4體內IGF2BP2基因敲除抑制淋巴轉移和淋巴管生成


5.   
IGF2BP2調控HNSCC細胞的EMT程序

為了分析IGF2BP2在調節(jié)EMT中的作用,用TGF-β處理FaDuSCC15細胞。72小時后,觀察到細胞-細胞接觸減少,梭形形態(tài)為間充質細胞(圖5A)。此外,免疫熒光染色和共聚焦成像分析顯示,經TGF-β處理的FaDuSCC15細胞形成了廣泛的絲狀足和板狀足,如白色箭頭所示,使細胞獲得了遷移和侵襲能力(圖5B)。此外,western blot分析顯示,TGF-β誘導兩種HNSCC細胞E-Cadherin表達減少,這被認為是EMT轉移的標志(圖5C)。這些數據表明,經TGF-β處理的HNSCC細胞系處于EMT過程中。

RT-qPCRwestern blot分析顯示,在經TGF-β處理的FaDuSCC15細胞中,IGF2BP2缺失可下調N-Cadherinvimentin的表達水平,而E- cadherinmRNA和蛋白水平上上調(圖5D-E)。免疫熒光染色和共聚焦成像分析進一步證實,沉默IGF2BP2導致波形蛋白表達的丟失,同時在兩種HNSCC細胞的細胞表面E-Cadherin的保留,這表明IGF2BP2可能調節(jié)EMT程序(圖5F)。為了進一步證實IGF2BP2EMT中的作用,在沒有TGF-β處理的情況下,用IGF2BP2和相應的對照載體轉導FaDuSCC15細胞,檢測了EMT相關標記物,發(fā)現E-Cadherin確實下調了,而N-CadherinvimentinmRNA和蛋白水平均上調(圖5G-H)。綜上所述,這些發(fā)現表明IGF2BP2在調節(jié)HNSCC細胞的EMT程序中具有重要的功能。

5 IGF2BP2調控HNSCC細胞EMT程序


6.   
HNSCC細胞中,Slug參與IGF2BP2調控的EMT

HNSCCTCGA數據庫中,spearman相關分析顯示,與Snail、ZEB1Twist相比,在502HNSCC組織樣本中,SlugIGF2BP2之間的正相關性最強,表明在HNSCCIGF2BP2Slug之間可能存在正調控機制(6A)。此外,根據TCGA數據庫,從IGF2BP2high表達的HNSCC組織到IGF2BP2low表達的HNSCC組織,再到正常的鄰近組織,均觀察到Slug的表達水平顯著降低(6B)。RT-qPCRwestern blot分析顯示,抑制IGF2BP2顯著降低了FaDuSCC15細胞中mRNA和蛋白水平的Slug表達,而過表達IGF2BP2顯著增強了Slug的表達(6C-F)。同時,在FaDuSCC15細胞中,SnailZEB1TwistmRNA水平無顯著或一致的變化(6C)。western blot分析結果顯示,在FaDu細胞中,敲除Slug可拮抗過表達IGF2BP2誘導的波形蛋白上調和E-Cadherin下調(6G)。相反,在FaDu細胞中,IGF2BP2過表達部分逆轉了由Slug抑制引起的波形蛋白下調和E-Cadherin上調(6G)。此外,創(chuàng)傷愈合實驗表明,沉默Slug可減弱FaDu細胞中IGF2BP2過表達對細胞遷移的促進作用(6H)。另外,IGF2BP2高表達標本表現為高Slug表達,而IGF2BP2低表達標本表現為低至中等Slug表達(6I)。根據免疫組化定量評分,IGF2BP2Slug表達呈穩(wěn)健的正相關(r =0.752, p-value < 0.001)(6 j)。這些發(fā)現表明,SlugIGF2BP2調控的HNSCC EMT中具有關鍵作用。

6 Slug參與了HNSCC細胞中IGF2BP2調節(jié)的EMT


7.   
IGF2BP2通過修飾m6A調控slug mRNA的穩(wěn)定性

使用抗IGF2BP2抗體在FaDuSCC15細胞中進行了RIP-qPCR檢測,結果顯示與IgG對照組相比,Slug mRNA顯著富集,證實了IGF2BP2Slug mRNA之間的相互作用(7A)。為了驗證Slug是否受m6A修飾的影響,從而導致IGF2BP2識別甲基化Slug,我們進行了MeRIP qPCR分析,并確定與相應的對照細胞相比,IGF2BP2的敲除顯著降低了FaDuSCC15細胞中Slugm6A水平(圖7B)?;?/span>SRAMP軟件分析,在Slug mRNACDS區(qū)域發(fā)現了一個非??尚诺?/span>m6A位點(7C)。為了驗證假設的m6A位點,使用含有野生型(WT) Slug-CDS或突變型(MT) Slug-CDS序列的熒光素酶報告基因進行了檢測(7D)。如預期的那樣,當IGF2BP2沉默時,SlugWT的熒光素酶活性顯著減弱,而Slug-MT的熒光素酶活性似乎不受影響(7E)。此外,mRNA穩(wěn)定性分析顯示,在FaDuSCC15細胞中,IGF2BP2沉默后,Slug mRNA的表達量降低,且Slug mRNA的半衰期持續(xù)縮短(7F)??偟膩碚f,這些發(fā)現表明IGF2BP2m6A修飾依賴的方式直接將CDS區(qū)與Slug mRNA結合并穩(wěn)定其mRNA。

7 IGF2BP2通過修飾m6A調控slug mRNA的穩(wěn)定性


結論:

綜上所述,該研究首次揭示了IGF2BP2在促進HNSCC淋巴轉移中的臨床和生物學功能,并證明IGF2BP2通過穩(wěn)定Slug mRNA,以m6A依賴的方式促進EMT和細胞轉移(圖7G)。這些結果表明,IGF2BP2可以作為LN轉移的預測生物標志物,也是HNSCC患者抗轉移治療的潛在靶點。


參考文獻:

Yu D, Pan M, Li Y, Lu T, Wang Z, Liu C, Hu G. RNA N6-methyladenosine reader IGF2BP2 promotes lymphatic metastasis and epithelial-mesenchymal transition of head and neck squamous carcinoma cells via stabilizing slug mRNA in an m6A-dependent manner. J Exp Clin Cancer Res. 2022, 41(1):6.