適配器SH3BGRL通過(guò)促進(jìn)乳腺癌中PIK3翻譯和ATG12穩(wěn)定性來(lái)驅(qū)動(dòng)自噬介導(dǎo)的化療耐藥

獲得性化療耐藥是乳腺癌復(fù)發(fā)的主要原因之一，但化療耐藥的潛在機(jī)制仍不清楚。目前，有研究指出一種小接頭蛋白SH3BGRL在乳腺癌患者中升高可能是通過(guò)自噬增強(qiáng)導(dǎo)致乳腺癌獲得性化療耐藥的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素，而靶向SH3BGRL可能是一種潛在的治療策略。該研究于2021年12月發(fā)表在《Autophagy》，IF：16.016。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1.   SH3BGRL上調(diào)與乳腺癌不良預(yù)后相關(guān)

與鄰近的正常乳腺癌相比，SH3BGRL mRNA在大多數(shù)乳腺癌中上調(diào)（圖1A,B），SH3BGRL mRNA水平升高的患者總體生存率和無(wú)復(fù)發(fā)生存率較差（圖1C-E）。此外，Kaplan Meier Plotter分析顯示，SH3BGRL蛋白含量高的乳腺癌患者的總生存期較差（圖1F），并且SH3BGRL蛋白在乳腺癌細(xì)胞株（圖1G）和乳腺癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)（圖1H）。與正常乳腺細(xì)胞MCF-10A和配對(duì)的相鄰非癌組織相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p < 0.05）。免疫組化（IHC）發(fā)現(xiàn)與相鄰組織相比，SH3BGRL蛋白在乳腺癌組織中高表達(dá)（圖1I, J），驗(yàn)證了SH3BGRL在乳腺癌中的表達(dá)上調(diào)。綜上所述，這些結(jié)果提示SH3BGRL上調(diào)可能是導(dǎo)致乳腺癌患者預(yù)后不良的原因之一。

圖1  SH3BGRL上調(diào)與乳腺癌預(yù)后不良相關(guān)

2.   SH3BGRL通過(guò)自噬保護(hù)作用對(duì)阿霉素細(xì)胞毒性產(chǎn)生耐藥性

為了了解SH3BGRL在乳腺癌進(jìn)展和不良預(yù)后中的潛在生理作用，對(duì)來(lái)自各種公共數(shù)據(jù)集的乳腺癌患者隊(duì)列進(jìn)行了基因集富集分析（GSEA）。GSEA分析表明SH3BGRL表達(dá)與阿霉素耐藥基因特征的富集呈正相關(guān)，但與阿霉素敏感基因特征呈負(fù)相關(guān)（圖2A）。通過(guò)對(duì)更多乳腺癌患者隊(duì)列（GSE45827和GSE15852）的分析，SH3BGRL表達(dá)也與自噬相關(guān)基因特征呈正相關(guān)（圖2B）。細(xì)胞毒性分析顯示，過(guò)表達(dá)SH3BGRL增加了細(xì)胞對(duì)阿霉素（Dox）的IC₅₀，而敲低SH3BGRL則降低了IC₅₀，而添加CQ抑制細(xì)胞自噬可有效中和這一效應(yīng)（圖2C）。流式細(xì)胞術(shù)和集落形成分析證實(shí)，過(guò)表達(dá)SH3BGRL使細(xì)胞對(duì)Dox產(chǎn)生耐藥性，CQ或3-MA致敏細(xì)胞對(duì)Dox的細(xì)胞毒性阻斷細(xì)胞自噬（圖2D,E）。相比之下，抑制SH3BGRL使細(xì)胞凋亡對(duì)Dox處理敏感，降低了菌落形成能力，抑制自噬幾乎消除了這些差異（圖2D,E）。進(jìn)一步評(píng)估了SH3BGRL過(guò)表達(dá)在皮下異種移植瘤模型中誘導(dǎo)的Dox耐藥性，發(fā)現(xiàn)即使使用Dox治療，SH3BGRL過(guò)表達(dá)也促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的腫瘤生長(zhǎng)，而SH3BGRL沉默顯著增加MDA-MB-453細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤對(duì)Dox的敏感性（圖2F-H）。因此，SH3BGRL可能具有自噬介導(dǎo)的乳腺癌化療耐藥性。

圖2 SH3BGRL通過(guò)自噬對(duì)阿霉素（Dox）誘導(dǎo)的凋亡產(chǎn)生抗性

3.   SH3BGRL觸發(fā)乳腺癌細(xì)胞自噬

為了驗(yàn)證SH3BGRL對(duì)大細(xì)胞自噬的驅(qū)動(dòng)作用，檢測(cè)兩種典型的自噬標(biāo)志物LC3B和SQSTM1，結(jié)果表明，即使在DOX誘導(dǎo)的應(yīng)激下，過(guò)表達(dá)SH3BGRL也會(huì)降低SQSTM1水平。而SH3BGRL基因敲除增加了乳腺癌細(xì)胞的自噬進(jìn)展（圖3A,B）以及相關(guān)的LC3B-I到LC3B-II的轉(zhuǎn)變（圖3C）。此外，當(dāng)短時(shí)間抑制自噬體-溶酶體融合步驟與巴非霉素A1（Baf A1）以探測(cè)釋放的自噬通量時(shí)，可以觀察到在SH3BGRL過(guò)度表達(dá)的細(xì)胞中LC3B-II明顯富集，相反，在SH3BGRL敲除的細(xì)胞中LC3B-II褪色（圖3D，E），表明SH3BGRL誘導(dǎo)自噬通量。免疫熒光染色顯示，在MCF-7細(xì)胞中，SH3BGRL過(guò)表達(dá)后LC3B聚集點(diǎn)明顯增加，而在MDA-MB -453細(xì)胞中，在無(wú)血清或無(wú)氨基酸的EBSS饑餓條件下，SH3BGRL敲除后LC3B聚集點(diǎn)明顯減少（圖3F-H），也證實(shí)了溶酶體SQSTM1的顯著降解（圖4A），并且沒(méi)有明確的MTOR激活與SH3BGRL誘導(dǎo)的自噬有關(guān)（圖4B）。此外，IHC染色和統(tǒng)計(jì)分析表明，與配對(duì)的相鄰正常組織相比，SH3BGRL高表達(dá)患者的總LC3B蛋白水平明顯降低（圖4C，D）。同時(shí)，患者的SH3BGRL蛋白水平與LC3B蛋白水平呈負(fù)相關(guān)（圖4E）?？傊?，這些結(jié)果表明SH3BGRL升高促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的自噬進(jìn)展。

圖3 SH3BGRL促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的自噬通量

圖4 SH3BGRL可使乳腺癌發(fā)生自噬

4.  SH3BGRL通過(guò)與核糖體相互作用，通過(guò)PIK3C3翻譯增強(qiáng)來(lái)驅(qū)動(dòng)自噬

質(zhì)譜分析法（MS）鑒定顯示SH3BGRL與大量的翻譯機(jī)制蛋白相互作用（圖5A）。分析序列中自噬相關(guān)基因的翻譯效率，發(fā)現(xiàn)自噬啟動(dòng)的PIK3C3 mRNA向較輕的部分平移約4次，表明其翻譯衰減（圖5B）。免疫印跡結(jié)果顯示，PIK3C3在過(guò)表達(dá)SH3BGRL的細(xì)胞中明顯升高，而在敲除SH3BGRL的細(xì)胞中明顯降低（圖5C）。當(dāng)翻譯抑制劑環(huán)己酰亞胺（CHX）阻斷核糖體翻譯后，過(guò)表達(dá)SH3BGRL的細(xì)胞PIK3C3蛋白水平明顯恢復(fù)到親本細(xì)胞水平（圖5D）。進(jìn)一步在細(xì)胞中進(jìn)行了多核糖體分析，并觀察到PIK3C3 mRNA在SH3BGRL高細(xì)胞中轉(zhuǎn)移到較重的多核糖體部分（圖5E），而在SH3BGRL敲除細(xì)胞中，PIK3C3 mRNA又轉(zhuǎn)移到較輕的部分（圖5F）。ATG12（圖5G）和其他自噬基因的蛋白質(zhì)變化（圖5H）沒(méi)有部分移位或轉(zhuǎn)錄表達(dá)變化。綜上所述， SH3BGRL至少可以通過(guò)與核糖體的相互作用促進(jìn)PIK3C3的翻譯，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞自噬。

圖5 SH3BGRL通過(guò)核糖體相互作用，通過(guò)PIK3C3翻譯，驅(qū)動(dòng)自噬

5.  SH3BGRL也通過(guò)維持ATG12的穩(wěn)定性來(lái)促進(jìn)自噬

SH3BGRL在蛋白質(zhì)水平上有效地上調(diào)乳腺癌細(xì)胞中的ATG12 （圖6A），但其mRNA水平和所述的翻譯事件不起作用。CHX追蹤實(shí)驗(yàn)表明，SH3BGRL充分降低了MCF-7細(xì)胞中ATG12的降解率，而SH3BGRL沉默則加速了MDA-MB-453細(xì)胞中ATG12的降解率（圖6B）。免疫共沉淀（co-IP）顯示SH3BGRL與ATG12和BECN相互作用，但在所有細(xì)胞中沒(méi)有其他自噬相關(guān)蛋白（圖6C）。為了進(jìn)一步研究較少SH3BGRL突變體的ATG12可能的蛋白酶體降解，用蛋白酶體抑制劑MG132處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)SH3BGRL中的α3螺旋或β3片對(duì)SH3BGRL與ATG12的結(jié)合仍然至關(guān)重要（圖6D）。免疫印跡結(jié)果顯示，阻斷蛋白酶體過(guò)程、在親本MCF-7細(xì)胞或MDA-MB-453 SH3BGRL敲除細(xì)胞中ATG12的表達(dá)水平與高SH3BGRL的對(duì)應(yīng)細(xì)胞相似（圖6E），表明原生體抑制對(duì)SH3BGRL的模擬效應(yīng)。泛素化分析直接表明SH3BGRL過(guò)表達(dá)細(xì)胞中泛素結(jié)合的ATG12減少，而SH3BGRL沉默細(xì)胞中泛素結(jié)合的ATG12增加（圖6F）。因此，這些結(jié)果表明SH3BGRL可以通過(guò)與ATG12相互作用阻止其降解或通過(guò)結(jié)合并削弱乳腺癌細(xì)胞中的ATG12 E3連接酶功能來(lái)穩(wěn)定ATG12，從而平行增強(qiáng)自噬。

圖6 SH3BGRL也通過(guò)維持ATG12的穩(wěn)定性來(lái)增強(qiáng)自噬

6.   PIK3C3和ATG12有助于SH3BGRL介導(dǎo)的阿霉素耐藥

為了驗(yàn)證SH3BGRL-PIK3C3/ATG12軸所表征的自噬介導(dǎo)的Dox抗性，我們分別在SH3BGRL過(guò)表達(dá)細(xì)胞中敲除PIK3C3或ATG12（圖7A），或在SH3BGRL敲除細(xì)胞中強(qiáng)制表達(dá)它們（圖7B）。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，在SH3BGRL-overexpressing MCF-7的細(xì)胞中，內(nèi)源性PIK3C3或ATG12的額外沉默可顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡（圖7C），自噬減少（圖7D），同時(shí)在Dox作用下，PARP和CASP3切割導(dǎo)致細(xì)胞凋亡升高（圖7E）。同時(shí)，這種PIK3C3或ATG12沉默導(dǎo)致細(xì)胞活力降低，Dox處理下菌落形成減少（圖7F-J）。相反，在SH3BGRL敲低MDA-MB-453細(xì)胞中強(qiáng)制表達(dá)PIK3C3或ATG12可抑制細(xì)胞凋亡，增加自噬水平和Dox耐藥（圖7A-J），證實(shí)自噬在SH3BGRL誘導(dǎo)的化療耐藥中對(duì)PIK3C3或/和ATG12上調(diào)的重要作用。

通過(guò)皮下移植瘤模型進(jìn)一步評(píng)價(jià)了SH3BGRL介導(dǎo)的自噬對(duì)乳腺癌Dox耐藥的生理作用。乳腺癌細(xì)胞中，敲低SH3BGRL使腫瘤對(duì)Dox治療顯著敏感，導(dǎo)致腫瘤負(fù)荷降低，而過(guò)表達(dá)PIK3C3或ATG12則使腫瘤消退消失（圖8A, B）。Dox與自噬抑制劑CQ聯(lián)合使用可以有效地使MDA-MB-453細(xì)胞中SH3BGRL高腫瘤的消退（圖8A,B）。去除SH3BGRL能充分抑制Dox作用下的細(xì)胞自噬和腫瘤細(xì)胞凋亡（圖8C,D）。而在SH3BGRRL沉默的腫瘤中，過(guò)表達(dá)PIK3C3或ATG12可促進(jìn)自噬，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，Dox與CQ聯(lián)合使用可促進(jìn)更多的腫瘤細(xì)胞凋亡（圖8C,D）。此外，SH3BGRL對(duì)其他化療耐藥基因沒(méi)有明顯影響，表明SH3BGRL衍生的自噬是化療的主要原因（圖8E，F）。總之，這些結(jié)果表明SH3BGRL-PIK3C3-ATG12自噬軸賦予乳腺癌有效的Dox或其他化療耐藥。

圖7 PIK3C3和ATG12參與了SH3BGRL介導(dǎo)的阿霉素耐藥

圖8 PIK3C3和ATG12有助于致瘤性和Dox耐藥

7.   乳腺癌患者SH3BGRL-PIK3C3/ATG12典型自噬的激活

接下來(lái)研究SH3BGRL-PIK3C3/ATG12自噬在乳腺癌中的臨床意義。對(duì)乳腺癌標(biāo)本進(jìn)行SH3BGRL、PIK3C3、ATG12和LC3B的免疫組化染色。結(jié)果顯示，與配對(duì)的相鄰正常組織相比，SH3BGRL、ATG12和PIK3C3在乳腺癌中協(xié)同升高，而LC3B下調(diào)（圖9A-C）。統(tǒng)計(jì)分析顯示，SH3BGRL與PIK3C3、ATG12表達(dá)呈正相關(guān)，與LC3B表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（圖9D）。免疫印跡進(jìn)一步驗(yàn)證， SH3BGRL表達(dá)與PIK3C3和ATG12呈正相關(guān)，與SQSTM1和LC3B呈負(fù)相關(guān)（圖9E-G）。PIK3C3和ATG12 mRNA水平的小于1.2倍的邊緣變化也通過(guò)其他乳腺癌隊(duì)列（GSE45827、GSE26304和TCGA數(shù)據(jù)集）的分析來(lái)驗(yàn)證（圖9H）。Kaplan Meier Plotter表明，PIK3C3或ATG12水平高的患者乳腺癌患者的5年總生存期、無(wú)復(fù)發(fā)生存期和無(wú)轉(zhuǎn)移生存期明顯較差（圖9I）。以上所有結(jié)果通過(guò)乳腺癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)和較差臨床結(jié)果的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，驗(yàn)證了SH3BGRL-PIK3C3-ATG12自噬軸與乳腺癌Dox化療耐藥的相關(guān)性（圖9J）。

圖9 乳腺癌患者SH3BGRL-PIK3C3/ATG12自噬軸的激活

主要結(jié)論：

該研究結(jié)果至少揭示了SH3BGRL是一種新型耐藥基因，通過(guò)上調(diào)PIK3C3和ATG12，促進(jìn)乳腺癌自噬介導(dǎo)的Dox耐藥。因此，靶向SH3BGRL或其下游關(guān)鍵效應(yīng)因子將是克服乳腺癌化療耐藥性的可能策略。