首次發(fā)現(xiàn)線粒體自噬有利于細(xì)胞死亡和主動脈瓣鈣化

在過去的15年里，一些觀察試圖闡明鈣化性主動脈瓣狹窄(CAVS)的細(xì)胞自我消化過程的失調(diào)，但得到的結(jié)果仍然存在爭議。本研究旨在明確CAVS患者的自噬趨勢，分析影響線粒體質(zhì)量控制機(jī)制的其他可能參與的決定因素，并探索CAVS治療中可能的藥物干預(yù)途徑。本研究于2021年8月發(fā)表在《Cardiovascular Research》IF：10.787期刊上。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、鈣化的瓣膜增加了自噬，和持續(xù)的細(xì)胞死亡

為了確定CAVS患者中的自噬趨勢，作者首先檢測了鈣化的主動脈瓣（AV）的自噬水平。由于部分瓣葉鈣化程度高，并非44例CAVS患者的AVs全部產(chǎn)生活細(xì)胞，其產(chǎn)率約為50%。茜素紅染色證實(shí)了CAVS的鈣化表型(Figure 1A)。然后通過免疫熒光、GFP-LC3構(gòu)建的HAVICs轉(zhuǎn)染和western blot檢測特異性自噬標(biāo)志物，如p62、LC3-II和BECN1，來評估自噬。每個細(xì)胞的GFP-LC3點(diǎn)數(shù)(Figure 1B)、BECN1和LC3-II表達(dá)的增加以及p62表達(dá)水平的降低(Figure 1C)均證實(shí)鈣化AV中自噬水平高于未鈣化AV。

為了區(qū)分自噬過程的增加是由于自噬通量的有效激活還是由于自噬體溶酶體融合的抑制，用BAF-A1處理細(xì)胞，BAF-A1是溶酶體酸化的抑制劑，廣泛用于模擬自噬通量的阻斷(Figure 1D)。BAF-A1暴露后，在ARA和CAVS細(xì)胞中LC3-II的表達(dá)均增加，這些數(shù)據(jù)也被免疫熒光證實(shí)(Figure 1E)。這一發(fā)現(xiàn)證實(shí)了CAVS瓣膜比ARA標(biāo)本具有更持久的自噬水平，并證明了這一特征并非由于自噬通量的改變。通過增加PARP、RIP和CAS3等切割蛋白的數(shù)量，以及Annexin V和PI探針熒光信號的表達(dá)，可見CAVS組細(xì)胞死亡顯著增加(Figure 1F– H)。在活細(xì)胞中的下游分析也表明存在失調(diào)的Ca2+動力學(xué)。與ARA組相比，CAVS細(xì)胞的胞質(zhì)Ca2+減少，無論是基礎(chǔ)Ca2+還是對激動劑的反應(yīng)(Figure 1I)。

以上結(jié)果表明，與未鈣化ARA相比，CAVS患者的HAVICs細(xì)胞自噬水平更高，且是因?yàn)樽允审w溶酶體抑制而非自噬通路增加，并且細(xì)胞死亡更多。

圖1評估CAVS和ARA患者來源的HAVICs的自噬

2、CAVS中的線粒體功能和線粒體自噬

在不同病理?xiàng)l件下的研究表明，細(xì)胞內(nèi)Ca2+通量和自噬是細(xì)胞生物能的正確維持的決定因素。特別是自噬程度和Ca2+均可激活和調(diào)節(jié)線粒體氧化磷酸化和ATP生成。鑒于Ca2+動態(tài)水平的改變和CAVS中自噬的增加，作者決定確定這些細(xì)胞中線粒體呼吸的狀態(tài)。利用Seahorse XF分析儀檢測到與ARA相比，CAVS患者線粒體OCR明顯下降(Figure 2A)，ATP產(chǎn)量減少，最大呼吸能降低(Figure 2B)，提示線粒體解偶聯(lián)。這些變化伴隨著乳酸生成的增加(Figure 2C)，這可能是為了通過糖酵解活動產(chǎn)生無氧ATP。

圖2中報告的數(shù)據(jù)涉及旨在控制HAVICs線粒體質(zhì)量和功能的過程。為了保持有功能和健康的線粒體群，細(xì)胞必須用更有功能的線粒體替換有缺陷的線粒體。這樣的線粒體轉(zhuǎn)換是由幾種機(jī)制保證的，最重要的是線粒體自噬和線粒體生物發(fā)生的比率。為了研究線粒體的轉(zhuǎn)換，使用了熒光質(zhì)粒MITO TIMER，該質(zhì)粒以綠色標(biāo)記新合成的線粒體，而熒光隨著線粒體種群的老化而變?yōu)榧t色。熒光顯示，與ARA瓣相比，CAVS的線粒體明顯老化，功能較差(Figure 2D)。通過測量PGC1α的表達(dá)來評估線粒體的生物發(fā)生，而PGC1α在CAVS中表達(dá)強(qiáng)烈下調(diào)(Figure 2E)。綜上所述，細(xì)胞死亡的增加伴隨著線粒體生物發(fā)生的減少和老化，表明線粒體轉(zhuǎn)換存在缺陷。

然后，研究了分離的HAVICs的線粒體自噬，數(shù)據(jù)表明，通過溶酶體跟蹤器(溶酶體標(biāo)記物)和線粒體標(biāo)記物熒光探針之間的共定位分析，線粒體自噬顯著增加(Figure 2F)。最近，Saito等展示了在體內(nèi)能量應(yīng)激(如缺血)時，線粒體如何通過一種替代途徑被激活，該途徑不包括Parkin和PINK1，但涉及ULK1/Rab9/RIP1/Drp1軸。事實(shí)上，該多蛋白復(fù)合物的形成由磷酸化級聯(lián)(ULK1的S555, Rab9的S179, Drp1的S616)觸發(fā)，允許Drp1依賴的線粒體破碎和線粒體自噬。雖然本研究沒有發(fā)現(xiàn)缺血現(xiàn)象，但考慮到線粒體自噬在體內(nèi)可以通過其他途徑發(fā)生，所以作者研究了在CAVS中觀察到的線粒體自噬是否遵循ULK1/Rab9/RIP1/ drp1依賴途徑。為此，分析了ULK1在S555位點(diǎn)和Drp1在S616位點(diǎn)的磷酸化狀態(tài)，結(jié)果顯示在ARA和CAVS樣品之間沒有顯著差異(Figure 2G)。

圖2 HAVICs的線粒體自噬

3、自噬和線粒體自噬在CAVS患者血清中上調(diào)，并與晚期心臟病相關(guān)

為了進(jìn)一步評估CAVS的自噬，作者在圖1和圖2中檢測并定量了來自同一隊(duì)列患者的血清中的自噬生物標(biāo)志物ATG5和BECN，即44例AS患者，15例ARA患者(表1)，以及另外45名健康志愿者。

結(jié)果顯示，健康志愿者與ARA組及CAVS組之間ATG5值均呈升高趨勢，而BECN1水平無顯著性差異，僅ARA組與CAVS組及健康志愿者與CAVS組之間差異顯著?？偟膩碚f，CAVS患者的循環(huán)自噬蛋白顯著高于對照組和ARA患者(Figure 3A and B)。與其他兩組相比，CAVS的炎癥細(xì)胞因子IL-1β和IL-18水平也顯著升高(Figure 3G and H)。與此同時，為了證實(shí)圖2所示的結(jié)果，利用同一隊(duì)列患者的生物標(biāo)志物Parkin、PINK1、ATG7和OPTN對CAVS血清中的線粒體自噬進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)和健康對照和ARA相比，這些指標(biāo)都在CAVS組上調(diào)表達(dá)(Figure 3C–F)。根據(jù)ATG5 (17 ng/mL)、BECN1 (5 ng/mL)、ATG7 (8 ng/mL)、OPTN (6 ng/mL)的中位值對CAVS患者進(jìn)行分層。如圖3I和3J所示，ATG5、BECN1、ATG7、OPTN水平高于中位值的患者左室收縮末期容積(LV ESVi)較大，這是臨床危重晚期的指標(biāo)。隨后作者探究這一人群中瓣膜鈣化級別和自噬和線粒體自噬水平之間的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)線粒體自噬OPTN和茜紅素正相關(guān)，OPTN/PINK1和CT-AVC正相關(guān)(Figure 3K and L)。

圖3 患者血清中自噬和線粒體自噬標(biāo)志物和炎癥細(xì)胞因子檢測及鈣化分級

4、誘導(dǎo)自噬可以恢復(fù)大部分的CAVS表型特征

前面的數(shù)據(jù)表明，CAVS的特征是自噬增加、細(xì)胞死亡增多和線粒體吞噬水平增加，老化線粒體無法更新。然后，作者驗(yàn)證其假說：進(jìn)一步促進(jìn)自噬可以促進(jìn)死亡細(xì)胞的清除和改善鈣化表型。圖3A表明100 nM雷帕霉素處理3 h可抑制MTOR和P70S6K的磷酸化。圖4B-4C表明CAVS細(xì)胞用雷帕霉素處理增加了自噬點(diǎn)（用GFP-LC3檢測）和線粒體自噬（溶酶體熒光和線粒體熒光共定位表示）。通過PARP、CAS3和RIP標(biāo)記物以及流式檢測評估雷帕霉素誘導(dǎo)的自噬和線粒體自噬減少了細(xì)胞死亡(Figure 4D– F)。用雷帕霉素長期治療7天改善鈣化表型，通過茜素紅染色檢測發(fā)現(xiàn)含鈣骨細(xì)胞信號降低(Figure 4G)。雷帕霉素也部分恢復(fù)了細(xì)胞內(nèi)Ca2+的整體動態(tài)。事實(shí)上，當(dāng)用雷帕霉素處理CAVS樣本時，觀察到基礎(chǔ)細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平顯著恢復(fù)。盡管如此，雷帕霉素并不能改善激動劑刺激后Ca2+的增加(Figure 4H)。

圖4雷帕霉素對自噬和線粒體自噬過程的調(diào)節(jié)

總之，本研究發(fā)現(xiàn)自噬和線粒體自噬通路在CAVS中是活躍的，并且增加了。還首次表明，主動脈鈣化引起重要的線粒體改變，包括老化的線粒體群體，抑制生物發(fā)生，Ca2t失調(diào)，和低ATP形成。這種改變可能是細(xì)胞死亡和成骨驅(qū)動的鈣化過程的部分原因，這表明，盡管自噬和自噬在高水平上表達(dá)，但這些分解代謝過程的激活不足以抵消危險的表型。因此，至少在體外，通過用雷帕霉素增強(qiáng)它們，可以減少細(xì)胞死亡，并部分恢復(fù)Ca2t失調(diào)。

圖5 模擬機(jī)制圖

參考文獻(xiàn)：

Morciano Giampaolo., Patergnani Simone., Pedriali Gaia., Cimaglia Paolo., Mikus Elisa., Calvi Simone., Albertini Alberto., Giorgi Carlotta., Campo Gianluca., Ferrari Roberto., Pinton Paolo.(2021). Impairment of mitophagy and autophagy accompanies calcific aortic valve stenosis favoring cell death and the severity of disease. Cardiovasc Res, undefined(undefined), undefined. doi:10.1093/cvr/cvab267