LHFPL3-AS2通過與SFPQ相互作用調(diào)控TXNIP表達，抑制非小細胞肺癌的轉(zhuǎn)移

肺癌是世界上最常見的癌癥，也是癌癥死亡的主要原因。除了編碼基因外，lncRNA在非小細胞肺癌(NSCLC)中的作用尚不清楚。在這里，我們通過Affymetrix基因芯片人類轉(zhuǎn)錄組陣列2.0在37對腫瘤NSCLC組織和鄰近非腫瘤組織樣本中探索了lncRNA的表達譜。我們發(fā)現(xiàn)LHFPL3-AS2是一種新型的lncRNA，在NSCLC組織中明顯減少。LHFPL3-AS2在另外93對NSCLC樣本中進一步驗證。低水平的LHFPL3-AS2表達與NSCLC患者較差的總生存期、TNM分期和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。LHFPL3-AS2表達的增強抑制了非小細胞肺癌的體內(nèi)外侵襲轉(zhuǎn)移。此外，LHFPL3-AS2的下調(diào)降低了其與SFPQ的特異性相互作用，使SFPQ更多地結(jié)合到TXNIP的啟動子上，引起TXNIP的轉(zhuǎn)錄抑制，從而最終促進NSCLC細胞的遷移和侵襲。此外，LHFPL3- AS2在缺氧條件下受到EGR1的調(diào)控。本文于2022年1月發(fā)表于Cancer Letters（IF=8.679）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）LHFPL3-AS2作為非小細胞肺癌候選抑癌基因的鑒定

為了研究lncRNA在NSCLC中的潛在作用，我們使用Affymetrix人類轉(zhuǎn)錄組陣列2.0 (HTA 2.0)從37對腫瘤NSCLC組織(T)和相應(yīng)的相鄰非腫瘤組織(N)樣本中生成了lncRNA譜圖。共鑒定出1230個異常的lncRNA，其中fold change≥8或≤-8的lncRNA有73個，被認為是需要進一步分析的NSCLC相關(guān)的關(guān)鍵lncRNA(圖1A)。為了確定NSCLC中普遍失調(diào)的lncRNA，我們采用GSE19804數(shù)據(jù)分析進行進一步篩選。在GSE19804數(shù)據(jù)中，我們比較了60對腫瘤NSCLC組織和鄰近非腫瘤組織中差異表達的lncRNAs，發(fā)現(xiàn)了23個異常表達的lncRNAs。在這些lncRNAs中，有2個在HTA2.0和U133 Plus 2.0 Array分析中始終處于失調(diào)狀態(tài)，其中LHFPL3-AS2在NSCLC中被鑒定為一種新的lncRNA(圖1B)，同時也被顯著下調(diào)(圖1C)。我們在另外93對非小細胞肺癌樣本中證實了LHFPL3-AS2的下調(diào)。與相應(yīng)的非腫瘤組織相比，LHFPL3-AS2在腫瘤組織中顯著降低，而在83%的NSCLC組織中觀察到LHFPL3-AS2表達下調(diào)(圖1D)。為了進一步探討LHFPL3-AS2在非小細胞肺癌中的臨床病理和預(yù)后意義，我們研究了LHFPL3-AS2與TNM分期、淋巴結(jié)或遠端轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。結(jié)果顯示LHFPL3-AS2表達下調(diào)與轉(zhuǎn)移和III/ IV期顯著相關(guān)(圖1E)。此外，LHFPL3-AS2表達水平降低與NSCLC患者的總生存期較差相關(guān)(圖1F)。亞細胞定位分析顯示LHFPL3-AS2主要位于NSCLC細胞的細胞核中(圖1G)。RNAscope分析還顯示LHFPL3-AS2在細胞核中表達較多，且在腫瘤NSCLC組織中的表達低于相應(yīng)的相鄰非腫瘤組織(圖1H)。綜上所述，LHFPL3-AS2在腫瘤組織中低水平表達，可能作為非小細胞肺癌的候選腫瘤抑制因子。

2）LHFPL3-AS2在體外和體內(nèi)抑制NSCLC細胞的遷移和侵襲

為了闡明LHFPL3-AS2在NSCLC細胞生物學(xué)過程中的作用，我們構(gòu)建了含有LHFPL3-AS2的慢病毒載體，并將其導(dǎo)入HCC827、H1299和H2170細胞中，以建立穩(wěn)定的LHFPL3-AS2過表達(圖2A)。Transwell檢測顯示LHFPL3-AS2過表達顯著抑制NSCLC細胞的遷移和侵襲能力(圖2B-D)。傷口愈合檢測顯示，與載體對照相比，過表達LHFPL3-AS2顯著降低了NSCLC細胞的運動能力(圖2E)。為了研究LHFPL3-AS2在體內(nèi)對NSCLC細胞轉(zhuǎn)移的影響，我們將過表達LHFPL3-AS2的HCC827和H1299細胞經(jīng)尾靜脈注射到裸鼠體內(nèi)。H&E染色分析顯示，與載體組相比，LHFPL3-AS2顯著降低了肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量(圖2F)。這些結(jié)果表明LHFPL3-AS2在體內(nèi)外均能抑制NSCLC細胞的遷移和侵襲。

3）LHFPL3-AS2在NSCLC細胞中特異性與SFPQ相互作用

lncRNA通過與不同類型的分子(包括DNA、RNA和蛋白質(zhì))相互作用發(fā)揮重要作用。結(jié)合LHFPL3-AS2主要位于細胞核的證據(jù)，我們推測LHFPL3-AS2可能通過與蛋白質(zhì)相互作用發(fā)揮關(guān)鍵作用。我們采用RNA下拉試驗來鑒定LHFPL3- AS2相互作用體。LHFPL3-AS2在100 kDa附近富集了一條明顯的條帶，隨后通過質(zhì)譜分析(圖3A)。通過下拉試驗獲得LHFPL3-AS2的8個潛在的相互作用蛋白。在LHFPL3-AS2樣品中SFPQ特異性下降，其次為SF3B2和DHX15。我們通過Western blot分析進一步檢查了它們的相互作用，僅SFPQ沉淀(圖3B)，這也被RIP檢測證實(圖3C)。我們研究了LHFPL3-AS2的哪一個片段是特異性結(jié)合SFPQ所必需的。用RNAfold軟件預(yù)測LHFPL3-AS2的二級結(jié)構(gòu)，然后將其截斷成6個片段，分別進行RNA拉下(圖3D)。缺失映射分析發(fā)現(xiàn)LHFPL3-AS2的750-1120 nt區(qū)域是其與SFPQ相互作用所必需的(圖3E)，這表明LHFPL3-AS2與SFPQ特異性相互作用。

4）TXNIP作為LHFPL3-AS2調(diào)控的下游靶點的鑒定

為了了解LHFPL3-AS2參與NSCLC轉(zhuǎn)移的分子機制，我們使用了Agilent SurePrint G3人類基因表達V2陣列來評估LHFPL3-AS2過表達的NSCLC細胞的轉(zhuǎn)錄譜。LHFPL3-AS2的上調(diào)分別改變了HCC827和H1299細胞中1708和1627個基因的表達，其中73個基因在兩種細胞中共失調(diào)，包括36個上調(diào)基因和37個下調(diào)基因(圖4A)。然后我們集中研究了73個共失調(diào)基因(圖4B)。在這些基因中，11個表達差異最大的基因與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移 (ETV1、TXNIP、CLU3、CMPK2、SSTR2、CCND2、GAS6和HEBEGF)，以及細胞因子和細胞因子受體(IL17RA、CXCL2和IL6) 相關(guān)。我們進一步通過qRT-PCR證實了這些被選擇的基因在LHFPL3-AS2過表達的HCC827、H1299和H2170細胞中的mRNA水平(圖4C)。TXNIP在三種LHFPL3-AS2過表達的NSCLC細胞系中均顯著上調(diào)。敲低LHFPL3-AS2顯著降低了TXNIP的mRNA水平(圖4D)。通過Western blot分析驗證LHFPL3-AS2對TXNIP蛋白水平的影響，與其對TXNIP mRNA的影響一致(圖4E)。此外，通過分析TXNIP在裸鼠肺樣品中的表達，IHC數(shù)據(jù)顯示LHFPL3-AS2增強了TXNIP的表達(圖4F)。沉默TXNIP顯著促進遷移和侵襲，而促進作用隨著LHFPL3-AS2表達的增加而減弱(圖4G)。

5）LHFPL3-AS2通過消除SFPQ介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制促進TXNIP的表達

SFPQ是一種多功能核蛋白，參與RNA加工、RNA剪接和轉(zhuǎn)錄調(diào)控。為了研究LHFPL3-AS2如何調(diào)控TXNIP的表達，我們在轉(zhuǎn)染SFPQ siRNA后檢測了TXNIP在NSCLC細胞中的表達。我們觀察到SFPQ的沉默導(dǎo)致TXNIP表達的增加(圖5A)。此外，SFPQ過表達顯著抑制TXNIP的表達，但這種效應(yīng)可以通過提高LHFPL3-AS2的表達來逆轉(zhuǎn)(圖5B)。這說明LHFPL3-AS2可以通過SFPQ調(diào)控TXNIP的表達。SFPQ的主要生物學(xué)作用之一是轉(zhuǎn)錄抑制，因此我們進行了TXNIP啟動子熒光素酶報告研究以進一步分析。SFPQ的下調(diào)刺激了NSCLC細胞中TXNIP啟動子的熒光素酶活性(圖5C)，表明SFPQ抑制了TXNIP啟動子的轉(zhuǎn)錄。通過TRANSFAC軟件預(yù)測SFPQ結(jié)合基序。生物信息學(xué)分析表明，SFPQ可能結(jié)合TXNIP啟動子?978~-953 nt區(qū)域。因此，我們圍繞該區(qū)域設(shè)計了3對引物，用于后續(xù)的ChIP檢測(圖5D)。ChIP實驗驗證了SFPQ與TXNIP啟動子?994~-898 nt區(qū)域直接結(jié)合，如圖5E所示。此外，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)NSCLC細胞轉(zhuǎn)染LHFPL3-AS2時，在SFPQ結(jié)合區(qū)TXNIP的富集程度較低(圖5F)。這些觀察結(jié)果表明，SFPQ與TXNIP啟動子結(jié)合抑制TXNIP的轉(zhuǎn)錄。因此，LHFPL3-AS2可以特異性地與SFPQ相互作用，導(dǎo)致SFPQ介導(dǎo)的TXNIP的轉(zhuǎn)錄抑制降低。

6）LHFPL3-AS2受EGR1調(diào)控

為了探索NSCLC中LHFPL3-AS2表達的影響機制，我們首先利用MethPrimer Prediction和Mexpress Prediction分析了LHFPL3-AS2啟動子區(qū)域的DNA甲基化狀態(tài)。我們在LHFPL3-AS2啟動子上沒有發(fā)現(xiàn)CpG島，這表明DNA甲基化可能與NSCLC中LHFPL3-AS2的下調(diào)無關(guān)。我們推測可能與轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)。利用在線轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測軟件JASPAR對LHFPL3-AS2啟動子區(qū)域的2000個堿基對進行分析。在這里，我們發(fā)現(xiàn)了16個潛在的EGR1結(jié)合位點。與相鄰的非腫瘤組織相比，非小細胞肺癌組織中EGR1的表達也下調(diào)(圖6A)，這與LHFPL3-AS2的表達呈正相關(guān)(圖6B)。因此，我們評估了EGR1是否可以調(diào)控LHFPL3-AS2的表達。結(jié)果顯示，EGR1表達的增強促進了LHFPL3-AS2的上調(diào)(圖6C)。根據(jù)JASPAR預(yù)測的EGR1結(jié)合位點，我們將LHFPL3-AS2啟動子片段構(gòu)建到熒光素酶報告基因中(圖6D)。在P2(?697~-587 nt)和P3(?1266~-698 nt)的LHFPL3-AS2啟動子區(qū)域檢測到強熒光素酶活性信號(圖6E)。根據(jù)JASPAR的預(yù)測，LHFPL3-AS2-P2區(qū)域包含3個推測的EGR1結(jié)合位點，而LHFPL3-AS2-P3區(qū)域包含5個推測的EGR1結(jié)合位點。隨后的ChIP分析證實了這兩個片段中EGR1的直接相互作用(圖6F)。以往的研究表明，EGR1受缺氧調(diào)節(jié)。因此，我們檢測了缺氧處理后不同時間點EGR1 mRNA水平。結(jié)果顯示，1% O2處理NSCLC細胞24小時后，EGR1表達迅速下降。然后我們檢測缺氧條件下LHFPL3-AS2的表達，其表達與EGR1相似。HCC827細胞缺氧48 h、H1299細胞缺氧72 h后LHFPL3-AS2也顯著降低，說明LHFPL3-AS2在缺氧條件下可能受到EGR1的調(diào)節(jié)。

結(jié)論：我們的研究結(jié)果為我們對NSCLC轉(zhuǎn)移的理解提供了新的見解，LHFPL3-AS2是NSCLC的潛在靶點。

參考文獻：Cheng Z, Lu C, Wang H, Wang N, Cui S, Yu C, Wang C, Zuo Q, Wang S, Lv Y, Yao M, Jiang L, Qin W. Long noncoding RNA LHFPL3-AS2 suppresses metastasis of non-small cell lung cancer by interacting with SFPQ to regulate TXNIP expression. Cancer Lett. 2022 Jan 29;531:1-13. doi: 10.1016/j.canlet.2022.01.031.