LHFPL3-AS2通過與SFPQ相互作用調(diào)控TXNIP表達(dá)，抑制非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移

肺癌是世界上最常見的癌癥，也是癌癥死亡的主要原因。除了編碼基因外，lncRNA在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中的作用尚不清楚。在這里，我們通過Affymetrix基因芯片人類轉(zhuǎn)錄組陣列2.0在37對(duì)腫瘤NSCLC組織和鄰近非腫瘤組織樣本中探索了lncRNA的表達(dá)譜。我們發(fā)現(xiàn)LHFPL3-AS2是一種新型的lncRNA，在NSCLC組織中明顯減少。LHFPL3-AS2在另外93對(duì)NSCLC樣本中進(jìn)一步驗(yàn)證。低水平的LHFPL3-AS2表達(dá)與NSCLC患者較差的總生存期、TNM分期和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。LHFPL3-AS2表達(dá)的增強(qiáng)抑制了非小細(xì)胞肺癌的體內(nèi)外侵襲轉(zhuǎn)移。此外，LHFPL3-AS2的下調(diào)降低了其與SFPQ的特異性相互作用，使SFPQ更多地結(jié)合到TXNIP的啟動(dòng)子上，引起TXNIP的轉(zhuǎn)錄抑制，從而最終促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的遷移和侵襲。此外，LHFPL3- AS2在缺氧條件下受到EGR1的調(diào)控。本文于2022年1月發(fā)表于Cancer Letters（IF=8.679）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）LHFPL3-AS2作為非小細(xì)胞肺癌候選抑癌基因的鑒定

為了研究lncRNA在NSCLC中的潛在作用，我們使用Affymetrix人類轉(zhuǎn)錄組陣列2.0 (HTA 2.0)從37對(duì)腫瘤NSCLC組織(T)和相應(yīng)的相鄰非腫瘤組織(N)樣本中生成了lncRNA譜圖。共鑒定出1230個(gè)異常的lncRNA，其中fold change≥8或≤-8的lncRNA有73個(gè)，被認(rèn)為是需要進(jìn)一步分析的NSCLC相關(guān)的關(guān)鍵lncRNA(圖1A)。為了確定NSCLC中普遍失調(diào)的lncRNA，我們采用GSE19804數(shù)據(jù)分析進(jìn)行進(jìn)一步篩選。在GSE19804數(shù)據(jù)中，我們比較了60對(duì)腫瘤NSCLC組織和鄰近非腫瘤組織中差異表達(dá)的lncRNAs，發(fā)現(xiàn)了23個(gè)異常表達(dá)的lncRNAs。在這些lncRNAs中，有2個(gè)在HTA2.0和U133 Plus 2.0 Array分析中始終處于失調(diào)狀態(tài)，其中LHFPL3-AS2在NSCLC中被鑒定為一種新的lncRNA(圖1B)，同時(shí)也被顯著下調(diào)(圖1C)。我們?cè)诹硗?/span>93對(duì)非小細(xì)胞肺癌樣本中證實(shí)了LHFPL3-AS2的下調(diào)。與相應(yīng)的非腫瘤組織相比，LHFPL3-AS2在腫瘤組織中顯著降低，而在83%的NSCLC組織中觀察到LHFPL3-AS2表達(dá)下調(diào)(圖1D)。為了進(jìn)一步探討LHFPL3-AS2在非小細(xì)胞肺癌中的臨床病理和預(yù)后意義，我們研究了LHFPL3-AS2與TNM分期、淋巴結(jié)或遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。結(jié)果顯示LHFPL3-AS2表達(dá)下調(diào)與轉(zhuǎn)移和III/ IV期顯著相關(guān)(圖1E)。此外，LHFPL3-AS2表達(dá)水平降低與NSCLC患者的總生存期較差相關(guān)(圖1F)。亞細(xì)胞定位分析顯示LHFPL3-AS2主要位于NSCLC細(xì)胞的細(xì)胞核中(圖1G)。RNAscope分析還顯示LHFPL3-AS2在細(xì)胞核中表達(dá)較多，且在腫瘤NSCLC組織中的表達(dá)低于相應(yīng)的相鄰非腫瘤組織(圖1H)。綜上所述，LHFPL3-AS2在腫瘤組織中低水平表達(dá)，可能作為非小細(xì)胞肺癌的候選腫瘤抑制因子。

2）LHFPL3-AS2在體外和體內(nèi)抑制NSCLC細(xì)胞的遷移和侵襲

為了闡明LHFPL3-AS2在NSCLC細(xì)胞生物學(xué)過程中的作用，我們構(gòu)建了含有LHFPL3-AS2的慢病毒載體，并將其導(dǎo)入HCC827、H1299和H2170細(xì)胞中，以建立穩(wěn)定的LHFPL3-AS2過表達(dá)(圖2A)。Transwell檢測(cè)顯示LHFPL3-AS2過表達(dá)顯著抑制NSCLC細(xì)胞的遷移和侵襲能力(圖2B-D)。傷口愈合檢測(cè)顯示，與載體對(duì)照相比，過表達(dá)LHFPL3-AS2顯著降低了NSCLC細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力(圖2E)。為了研究LHFPL3-AS2在體內(nèi)對(duì)NSCLC細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響，我們將過表達(dá)LHFPL3-AS2的HCC827和H1299細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注射到裸鼠體內(nèi)。H&E染色分析顯示，與載體組相比，LHFPL3-AS2顯著降低了肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量(圖2F)。這些結(jié)果表明LHFPL3-AS2在體內(nèi)外均能抑制NSCLC細(xì)胞的遷移和侵襲。

3）LHFPL3-AS2在NSCLC細(xì)胞中特異性與SFPQ相互作用

lncRNA通過與不同類型的分子(包括DNA、RNA和蛋白質(zhì))相互作用發(fā)揮重要作用。結(jié)合LHFPL3-AS2主要位于細(xì)胞核的證據(jù)，我們推測(cè)LHFPL3-AS2可能通過與蛋白質(zhì)相互作用發(fā)揮關(guān)鍵作用。我們采用RNA下拉試驗(yàn)來鑒定LHFPL3- AS2相互作用體。LHFPL3-AS2在100 kDa附近富集了一條明顯的條帶，隨后通過質(zhì)譜分析(圖3A)。通過下拉試驗(yàn)獲得LHFPL3-AS2的8個(gè)潛在的相互作用蛋白。在LHFPL3-AS2樣品中SFPQ特異性下降，其次為SF3B2和DHX15。我們通過Western blot分析進(jìn)一步檢查了它們的相互作用，僅SFPQ沉淀(圖3B)，這也被RIP檢測(cè)證實(shí)(圖3C)。我們研究了LHFPL3-AS2的哪一個(gè)片段是特異性結(jié)合SFPQ所必需的。用RNAfold軟件預(yù)測(cè)LHFPL3-AS2的二級(jí)結(jié)構(gòu)，然后將其截?cái)喑?/span>6個(gè)片段，分別進(jìn)行RNA拉下(圖3D)。缺失映射分析發(fā)現(xiàn)LHFPL3-AS2的750-1120 nt區(qū)域是其與SFPQ相互作用所必需的(圖3E)，這表明LHFPL3-AS2與SFPQ特異性相互作用。

4）TXNIP作為LHFPL3-AS2調(diào)控的下游靶點(diǎn)的鑒定

為了了解LHFPL3-AS2參與NSCLC轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，我們使用了Agilent SurePrint G3人類基因表達(dá)V2陣列來評(píng)估LHFPL3-AS2過表達(dá)的NSCLC細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜。LHFPL3-AS2的上調(diào)分別改變了HCC827和H1299細(xì)胞中1708和1627個(gè)基因的表達(dá)，其中73個(gè)基因在兩種細(xì)胞中共失調(diào)，包括36個(gè)上調(diào)基因和37個(gè)下調(diào)基因(圖4A)。然后我們集中研究了73個(gè)共失調(diào)基因(圖4B)。在這些基因中，11個(gè)表達(dá)差異最大的基因與腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移 (ETV1、TXNIP、CLU3、CMPK2、SSTR2、CCND2、GAS6和HEBEGF)，以及細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體(IL17RA、CXCL2和IL6) 相關(guān)。我們進(jìn)一步通過qRT-PCR證實(shí)了這些被選擇的基因在LHFPL3-AS2過表達(dá)的HCC827、H1299和H2170細(xì)胞中的mRNA水平(圖4C)。TXNIP在三種LHFPL3-AS2過表達(dá)的NSCLC細(xì)胞系中均顯著上調(diào)。敲低LHFPL3-AS2顯著降低了TXNIP的mRNA水平(圖4D)。通過Western blot分析驗(yàn)證LHFPL3-AS2對(duì)TXNIP蛋白水平的影響，與其對(duì)TXNIP mRNA的影響一致(圖4E)。此外，通過分析TXNIP在裸鼠肺樣品中的表達(dá)，IHC數(shù)據(jù)顯示LHFPL3-AS2增強(qiáng)了TXNIP的表達(dá)(圖4F)。沉默TXNIP顯著促進(jìn)遷移和侵襲，而促進(jìn)作用隨著LHFPL3-AS2表達(dá)的增加而減弱(圖4G)。

5）LHFPL3-AS2通過消除SFPQ介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制促進(jìn)TXNIP的表達(dá)

SFPQ是一種多功能核蛋白，參與RNA加工、RNA剪接和轉(zhuǎn)錄調(diào)控。為了研究LHFPL3-AS2如何調(diào)控TXNIP的表達(dá)，我們?cè)谵D(zhuǎn)染SFPQ siRNA后檢測(cè)了TXNIP在NSCLC細(xì)胞中的表達(dá)。我們觀察到SFPQ的沉默導(dǎo)致TXNIP表達(dá)的增加(圖5A)。此外，SFPQ過表達(dá)顯著抑制TXNIP的表達(dá)，但這種效應(yīng)可以通過提高LHFPL3-AS2的表達(dá)來逆轉(zhuǎn)(圖5B)。這說明LHFPL3-AS2可以通過SFPQ調(diào)控TXNIP的表達(dá)。SFPQ的主要生物學(xué)作用之一是轉(zhuǎn)錄抑制，因此我們進(jìn)行了TXNIP啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告研究以進(jìn)一步分析。SFPQ的下調(diào)刺激了NSCLC細(xì)胞中TXNIP啟動(dòng)子的熒光素酶活性(圖5C)，表明SFPQ抑制了TXNIP啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。通過TRANSFAC軟件預(yù)測(cè)SFPQ結(jié)合基序。生物信息學(xué)分析表明，SFPQ可能結(jié)合TXNIP啟動(dòng)子?978~-953 nt區(qū)域。因此，我們圍繞該區(qū)域設(shè)計(jì)了3對(duì)引物，用于后續(xù)的ChIP檢測(cè)(圖5D)。ChIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了SFPQ與TXNIP啟動(dòng)子?994~-898 nt區(qū)域直接結(jié)合，如圖5E所示。此外，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)NSCLC細(xì)胞轉(zhuǎn)染LHFPL3-AS2時(shí)，在SFPQ結(jié)合區(qū)TXNIP的富集程度較低(圖5F)。這些觀察結(jié)果表明，SFPQ與TXNIP啟動(dòng)子結(jié)合抑制TXNIP的轉(zhuǎn)錄。因此，LHFPL3-AS2可以特異性地與SFPQ相互作用，導(dǎo)致SFPQ介導(dǎo)的TXNIP的轉(zhuǎn)錄抑制降低。

6）LHFPL3-AS2受EGR1調(diào)控

為了探索NSCLC中LHFPL3-AS2表達(dá)的影響機(jī)制，我們首先利用MethPrimer Prediction和Mexpress Prediction分析了LHFPL3-AS2啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化狀態(tài)。我們?cè)?/span>LHFPL3-AS2啟動(dòng)子上沒有發(fā)現(xiàn)CpG島，這表明DNA甲基化可能與NSCLC中LHFPL3-AS2的下調(diào)無關(guān)。我們推測(cè)可能與轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)。利用在線轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)軟件JASPAR對(duì)LHFPL3-AS2啟動(dòng)子區(qū)域的2000個(gè)堿基對(duì)進(jìn)行分析。在這里，我們發(fā)現(xiàn)了16個(gè)潛在的EGR1結(jié)合位點(diǎn)。與相鄰的非腫瘤組織相比，非小細(xì)胞肺癌組織中EGR1的表達(dá)也下調(diào)(圖6A)，這與LHFPL3-AS2的表達(dá)呈正相關(guān)(圖6B)。因此，我們?cè)u(píng)估了EGR1是否可以調(diào)控LHFPL3-AS2的表達(dá)。結(jié)果顯示，EGR1表達(dá)的增強(qiáng)促進(jìn)了LHFPL3-AS2的上調(diào)(圖6C)。根據(jù)JASPAR預(yù)測(cè)的EGR1結(jié)合位點(diǎn)，我們將LHFPL3-AS2啟動(dòng)子片段構(gòu)建到熒光素酶報(bào)告基因中(圖6D)。在P2(?697~-587 nt)和P3(?1266~-698 nt)的LHFPL3-AS2啟動(dòng)子區(qū)域檢測(cè)到強(qiáng)熒光素酶活性信號(hào)(圖6E)。根據(jù)JASPAR的預(yù)測(cè)，LHFPL3-AS2-P2區(qū)域包含3個(gè)推測(cè)的EGR1結(jié)合位點(diǎn)，而LHFPL3-AS2-P3區(qū)域包含5個(gè)推測(cè)的EGR1結(jié)合位點(diǎn)。隨后的ChIP分析證實(shí)了這兩個(gè)片段中EGR1的直接相互作用(圖6F)。以往的研究表明，EGR1受缺氧調(diào)節(jié)。因此，我們檢測(cè)了缺氧處理后不同時(shí)間點(diǎn)EGR1 mRNA水平。結(jié)果顯示，1% O2處理NSCLC細(xì)胞24小時(shí)后，EGR1表達(dá)迅速下降。然后我們檢測(cè)缺氧條件下LHFPL3-AS2的表達(dá)，其表達(dá)與EGR1相似。HCC827細(xì)胞缺氧48 h、H1299細(xì)胞缺氧72 h后LHFPL3-AS2也顯著降低，說明LHFPL3-AS2在缺氧條件下可能受到EGR1的調(diào)節(jié)。

結(jié)論：我們的研究結(jié)果為我們對(duì)NSCLC轉(zhuǎn)移的理解提供了新的見解，LHFPL3-AS2是NSCLC的潛在靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：Cheng Z, Lu C, Wang H, Wang N, Cui S, Yu C, Wang C, Zuo Q, Wang S, Lv Y, Yao M, Jiang L, Qin W. Long noncoding RNA LHFPL3-AS2 suppresses metastasis of non-small cell lung cancer by interacting with SFPQ to regulate TXNIP expression. Cancer Lett. 2022 Jan 29;531:1-13. doi: 10.1016/j.canlet.2022.01.031.