通過IL6/JAK2/STAT3信號通路靶向小膠質(zhì)細(xì)胞極化表型能減少NSCLC腦轉(zhuǎn)移

腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞已經(jīng)成為轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素。小膠質(zhì)細(xì)胞是腦微環(huán)境不可或缺的組成部分，在腦轉(zhuǎn)移 (brain metastasis, BM) 中發(fā)揮著重要作用。然而，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)腦轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制尚不清楚。本研究純化了具有腦轉(zhuǎn)移傾向的細(xì)胞系，并利用共培養(yǎng)系統(tǒng)揭示了它們與小膠質(zhì)細(xì)胞的通信。本文于2022年2月發(fā)表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》，IF=13.493。

本文技術(shù)路線：

本文主要內(nèi)容：

1. 腦轉(zhuǎn)移微環(huán)境下小膠質(zhì)細(xì)胞表型的改變

為了探討小膠質(zhì)細(xì)胞在非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移中的作用，我們首先評估了幾種常用的EGFR野生型非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株(A549、H460、H292和H1299)的轉(zhuǎn)移能力(Fig 1a,b)。其中，A549細(xì)胞的侵襲和遷移能力最強(qiáng)，因此選擇A549細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步研究。我們將A549細(xì)胞心內(nèi)接種裸鼠，建立腦轉(zhuǎn)移模型。將轉(zhuǎn)移組和未接種對照組小鼠腦組織進(jìn)行Iba-1染色，分析小膠質(zhì)細(xì)胞的分布情況。與對照組相比，治療組腦轉(zhuǎn)移灶可見大量形態(tài)改變、樹枝狀化增強(qiáng)的小膠質(zhì)細(xì)胞(Fig 1c)。同樣的，人NSCLC-BM標(biāo)本Iba-1免疫組化染色顯示，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤于BM病灶附近(Fig 1d)。

為了研究NSCLC細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞的相互作用，我們進(jìn)行了體外細(xì)胞實驗，用A549細(xì)胞(ACM)條件培養(yǎng)液(CM)刺激小膠質(zhì)細(xì)胞，觀察其對不同時間點小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的影響。24 h和48 h后，植株形態(tài)發(fā)生明顯變化，分枝形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閰采螒B(tài)（Fig. 1e）。

為闡明ACM對特異性小膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響，用qRT-PCR分析了促炎M1標(biāo)志物(iNOS和CD86)和抗炎M2標(biāo)記物(CD206和ARG1)的表達(dá)。NOS和CD86的表達(dá)在12 h 上調(diào)， CD206、Arg1表達(dá)水平在24 h、48 h也上調(diào)了(Fig. 1f)。Western blot結(jié)果顯示，HMO6細(xì)胞在0 h時幾乎檢測不到iNOS和CD206水平，提示小膠質(zhì)細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)(Fig 1g)。所有結(jié)果在NSCLC-BM患者樣品中中一致反映為CD206+小膠質(zhì)細(xì)胞明顯多于iNOS+小膠質(zhì)細(xì)胞(Fig 1h)。

Fig1 人NSCLC A549細(xì)胞中小膠質(zhì)細(xì)胞表型改變

2. 抗炎小膠質(zhì)細(xì)胞的腦轉(zhuǎn)移瘤促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞定植

免疫熒光分析顯示，TGF-β1降低了E-cadherin在細(xì)胞突出連接處的表達(dá)，上調(diào)了vimentin的表達(dá)，而共培養(yǎng)CM (co-HCM和co-CCM)可以逆轉(zhuǎn)這一過程(Fig. 2a,b)。為了進(jìn)一步驗證這些觀察結(jié)果，我們進(jìn)行了qRT-PCR和western blot分析。結(jié)果表明，CM共培養(yǎng)可誘導(dǎo)間充質(zhì)樣A549細(xì)胞和H292細(xì)胞MET(圖2c-f)，E-cadherin上調(diào)、vimentin下調(diào)。這些結(jié)果表明，抗炎小膠質(zhì)細(xì)胞足以對癌細(xì)胞進(jìn)行重組，以獲得上皮表型，并促進(jìn)轉(zhuǎn)移性定植。

Figure 2．M2 -小膠質(zhì)細(xì)胞CM促進(jìn)NSCLC細(xì)胞定植

3. 單細(xì)胞測序顯示A549細(xì)胞BM中存在激活的小膠質(zhì)細(xì)胞

為了進(jìn)一步闡明非小細(xì)胞肺癌BM細(xì)胞與激活的小膠質(zhì)細(xì)胞之間的細(xì)胞通信的潛在機(jī)制，我們首先通過將A549細(xì)胞接種到雄性BALB/c nu/nu小鼠左心室中獲得了高腦轉(zhuǎn)移性NSCLC細(xì)胞(Fig 3a)。分別經(jīng)過第一輪、第二輪和第三輪體內(nèi)獲得提取的細(xì)胞A549-F1、A549-F2和A549-F3。值得注意的是，BM的發(fā)生率隨體內(nèi)選擇數(shù)量的增加而增加，A549-F3細(xì)胞最終BM的發(fā)生率最高(63.6%；7/11)。BM發(fā)生率從F0時的10.0%增加到F1時的28.6%，在F0時增加到50.0% (Fig. 3b)。

為了表征激活的小膠質(zhì)細(xì)胞參與腦轉(zhuǎn)移定植的特征，我們通過單細(xì)胞RNA-seq對小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行分類，并使用指數(shù)排序策略分析了轉(zhuǎn)移組和健康組大腦中細(xì)胞簇的差異，從而可以回顧性分析每個單個細(xì)胞的表面標(biāo)記組合(Fig 3c)。共鑒定28165個細(xì)胞，其中A549-BM有11305個，A549-F3-BM有10459個，來自正常大腦組織的6401個。

接下來，我們分析了20個細(xì)胞群（0-19）(Fig. 3d)。絕大多數(shù)細(xì)胞為小膠質(zhì)細(xì)胞(簇0,1,2,3,5,9,10,16,17，19)，大多數(shù)細(xì)胞簇在A549和A549-f3細(xì)胞轉(zhuǎn)移病灶之間重疊(Fig 3e、f)。我們通過HeatMap隨機(jī)選擇100個細(xì)胞，分析了每個集群中差異基因的前10個，結(jié)果顯示，A549和A549- 3組中以特征性抗炎小膠質(zhì)細(xì)胞為主，而對照組中抗炎和促炎小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量相近，維持平衡狀態(tài)(Fig 3g)。KEGG通路分析腦轉(zhuǎn)移瘤中小膠質(zhì)細(xì)胞重疊簇。結(jié)果表明，JAK/STAT通路及其他幾個通路均顯著上調(diào)(Fig 3h)。已知JAK/STAT通路的上調(diào)與TAM的激活有關(guān)。在這些結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們在體內(nèi)證實了M2小膠質(zhì)細(xì)胞在NSCLC-BM中的存在。

Figure 3 單細(xì)胞RNA-Seq揭示轉(zhuǎn)移性病變中活化的小膠質(zhì)細(xì)胞

4. IL6在腦脊髓炎中作為A549-F3和M2小膠質(zhì)細(xì)胞通訊的中介

比較轉(zhuǎn)錄組芯片分析被用來比較A549-F3細(xì)胞、A549-F0細(xì)胞與HMO6小膠質(zhì)細(xì)胞與親本A549細(xì)胞共培養(yǎng)時的高轉(zhuǎn)移性基因的全基因組表達(dá)譜。結(jié)果顯示，腦脊髓瘤衍生的差異表達(dá)基因(DEGs)有4857個A549-f3細(xì)胞，共培養(yǎng)的A549細(xì)胞中有1769個DEGs (Fig. 4a,b)。為了進(jìn)一步優(yōu)選候選基因，我們在標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，使用兩組基因芯片進(jìn)行相關(guān)分析，得到維恩圖(Fig 4c)。對前30個DEGs進(jìn)行進(jìn)一步分析(Fig.4d)。在A549-F3及共培養(yǎng)細(xì)胞中，IL6上調(diào)最顯著(Fig 4e)。

qRT-PCR和Western blot結(jié)果證實A549-f3和共培養(yǎng)的A549細(xì)胞中IL6表達(dá)升高(Fig 4f,g)。此外，ELISA檢測顯示與A549細(xì)胞培養(yǎng)相比，A549- F3細(xì)胞中IL6水平較高(Fig 4h)。為了證實IL6對BM的影響，將A549-F3/mock或IL6/敲除細(xì)胞注射到裸鼠體內(nèi)（Fig 4i)。四周后，利用體內(nèi)BLI信號檢測轉(zhuǎn)移活性。il-6的下調(diào)降低了BM的發(fā)生率，從58.3%(7 / 12)降至38.5%(5 / 13)，轉(zhuǎn)移病灶的光子通量也較弱(Fig. 4j,k)。這些結(jié)果提示了IL6在A549-F3 BM中的重要性，并提示了IL6相關(guān)信號的參與。

Figure 4   IL6是BM中A549-F3和M2小膠質(zhì)細(xì)胞通訊的中介

5. IL6/JAK2/STAT3信號通路介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞M2極化

在添加F3-CM或iL- 6的培養(yǎng)基中加入不同濃度的托珠單抗后，HMO6和CHME5細(xì)胞中CD206和Arg1的表達(dá)水平下降(Fig 5a). 接下來分析JAK/STAT通路成員如JAK1、JAK2、STAT3和STAT1的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)可以通過添加IL6或F3-CM刺激HMO6或CHME5細(xì)胞，而在托珠單抗治療的情況下磷酸化的JAK2和STAT3水平均降低(Fig 5b）。為研究M2極化中的JAK2/STAT3 信號，我們用JAK2抑制劑菲卓替尼治療HMO6或CHME5細(xì)胞。不出所料，在IL6或菲卓替尼存在的情況下，JAK2/STAT3活性被抑制(Fig 5c），綜上所述，這些結(jié)果表明F3-CM誘導(dǎo)的M2極化需要IL6/JAK2/STAT3信號的激活。隨后，我們研究了STAT3是否可以直接調(diào)控ARG1或CD206的表達(dá)。使用生信軟件來預(yù)測和鑒定ARG1基因含保守的STAT3結(jié)合位點的啟動子區(qū)域包，我們選擇最保守的結(jié)合位點(#1)進(jìn)行詳細(xì)分析（Fig 5d）。STAT3的過表達(dá)導(dǎo)致腫瘤的ARG1-promoter-WT報告基因表達(dá)增加，但未增加ARG1-promoter-MT報告基因的表達(dá)(Fig 5e)。接下來，在CHME5細(xì)胞中進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)-PCR分析，以確定ARG1啟動子激活的精確序列。免疫沉淀后，推測的STAT3結(jié)合位點(-1108 ~ -1098 bp)顯著富集，而陰性對照IgG抗體則無明顯條帶(Fig 5f)。qRT-PCR結(jié)果顯示，在CHME5細(xì)胞中，蛋白/ARG1基因復(fù)合物被抗STAT3抗體拉下(Fig 5g)?？傊?，ARG1可能是STAT3的潛在靶基因，介導(dǎo)il6誘導(dǎo)的M2極化。

Fig 5. IL6/JAK2/STAT3信號通路介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞M2極化

6. 靶向IL6/JAK2/STAT3信號通路能抑制A549-F3體內(nèi)轉(zhuǎn)移

體外數(shù)據(jù)表明IL6在M2極化中的關(guān)鍵作用，于是作者提出抑制IL6是否可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞中JAK2/STAT3信號通路的活性，從而降低A549-F3腦轉(zhuǎn)移的問題。將裸鼠分成四組，將A549-F3細(xì)胞注入左心室建立骨髓。此后，四組小鼠均給予托珠單抗(5mg /kg)腹腔注射，每周1次，每日給予PLX5622(抑制劑與磷酸鹽緩沖鹽水聯(lián)合)12000 mg/kg治療，注射PBS作為對照。實時成像顯示，托珠單抗治療組BM發(fā)生率為38.5%(5 / 13)，對照組為70.0%(7 / 10)，而聯(lián)合治療組BM發(fā)生率高于托珠單抗治療組(50.0%，5 / 10) (Fig 6a, b)。與此結(jié)果一致的是，轉(zhuǎn)移灶的總BLI信號強(qiáng)度在單抗治療組是最低的(Fig 6c)。在結(jié)束時，治療組BM負(fù)擔(dān)顯著低于對照組(45.5%[5 / 11]，而對照組為70% [7 / 10])，并伴有轉(zhuǎn)移灶較低的發(fā)光(Fig 6d-f).

為了進(jìn)一步證實IL6在NSCLC-BM中的臨床價值，采集了120例非NSCLC患者的外周血標(biāo)本，并評估了血清IL6水平預(yù)測BM的可行性。根據(jù)IL-6水平分為兩組(n = 120)。隨訪28個月后，分析兩組腦脊髓炎的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組有不同的腦轉(zhuǎn)移率，iL-6水平較高的組有更高的腦轉(zhuǎn)移風(fēng)險 (Fig 6g). 雖然由于隨訪時間有限，無法獲得生存數(shù)據(jù)，但TCGA數(shù)據(jù)顯示IL6水平低的NSCLC患者(n = 318，中位生存時間=21.87個月)的總生存期長于il - 6高的患者(n = 314，中位生存時間= 26.33個月;P = 0.0006) (Fig.6h)。

Fig6 靶向IL6/JAK2/STAT3信號通路抑制A549-F3體內(nèi)轉(zhuǎn)移

本研究闡明了腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞(A549-F3)和活化的M2 -小膠質(zhì)細(xì)胞之間的相互交流機(jī)制。強(qiáng)調(diào)了NSCLC-BM中IL6是BM發(fā)生的一個預(yù)后因素，也是一個潛在的預(yù)防治療靶點。提出可以通過IL6/JAK2/STAT3信號通路調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞表型，探索了新的潛在的預(yù)防和治療方法。

參考文獻(xiàn)：
Jin, Y., et al., Targeting polarized phenotype of microglia via IL6/JAK2/STAT3 signaling to reduce NSCLC brain metastasis. Signal Transduct Target Ther, 2022. 7(1): p. 52.