去甲基酶ALKBH5通過PKMYT1 m6A修飾抑制胃癌侵襲

胃癌（GC）是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤之一。GC轉(zhuǎn)移是癌癥治療失敗的主要原因之一，但m6A與GC轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性報道較少。在GC樣本中檢測到ALKBH5表達(dá)降低，并且與臨床腫瘤遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。ALKBH5干擾促進(jìn)了GC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，這種作用與ALKBH5的去甲基化酶活性密切相關(guān)。PKMYT1作為ALKBH5的下游靶點(diǎn)，促進(jìn)了GC的侵襲和遷移。由ALKBH5敲除或其去甲基化酶活性突變引起的PKMYT1表達(dá)上調(diào)表明，ALKBH5以m6A依賴的方式調(diào)節(jié)PKMYT1的表達(dá)。IGF2BP3通過其m6A修飾位點(diǎn)幫助穩(wěn)定PKMYT1的mRNA穩(wěn)定性。本研究建立了ALKBH5-PKMYT1-IGF2BP3在轉(zhuǎn)移中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，代表了GC轉(zhuǎn)移的新治療靶點(diǎn)。本文于2022年2月發(fā)表于Molecular Cancer（IF=27.401）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）MeRIP?seq揭示了m6A修飾基因與GC細(xì)胞粘附之間的強(qiáng)相關(guān)性，脫甲基酶ALKBH5的下調(diào)與GC預(yù)后相關(guān)

為了評估GC中m6A修飾的總體水平，隨機(jī)選擇5對臨床腫瘤組織和相鄰的正常樣本。使用EpiQuik m6A RNA甲基化定量試劑盒，我們觀察到GC組織中m6A的水平顯著高于相鄰正常組織（圖1A），表明m6A可能參與GC的發(fā)生或進(jìn)展。選擇三對組織進(jìn)行進(jìn)一步甲基化RNA免疫沉淀測序（MeRIPseq）。在三對組織的MeRIP-seq分析中，m6A信號主要發(fā)生在mRNA轉(zhuǎn)錄本的終止密碼子和3'UTR附近（圖1B）。m6A修飾集中在GGACU基序上（圖1C）。大多數(shù)基因在腫瘤組織中表現(xiàn)出較高水平的m6A修飾和mRNA表達(dá)（圖1D）。GO分析表明，這些基因主要富集于細(xì)胞間粘附和上皮細(xì)胞遷移（圖1E）。通過數(shù)據(jù)分析確定，大多數(shù)在腫瘤組織中表現(xiàn)出高m6A水平的基因也表現(xiàn)出顯著高于相鄰正常組織的mRNA水平（圖1F）。

M6A水平主要由甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基酶平衡，而甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3和METTL14被報道調(diào)節(jié)GC進(jìn)展。然而，GC中去甲基化的機(jī)制報道較少。為了探索參與細(xì)胞遷移的關(guān)鍵去甲基化酶，利用TCGA數(shù)據(jù)庫探索了m6A相關(guān)酶和遷移相關(guān)基因之間的相關(guān)性。數(shù)據(jù)顯示ALKBH5與這些基因呈顯著負(fù)相關(guān)，而FTO主要與它們呈正相關(guān)(圖1G)。檢測49例患者的GC組織和正常組織中的mRNA水平表明，ALKBH5在GC組織中的低水平表達(dá)顯著，而GC和正常組織之間的FTO表達(dá)沒有ALKBH5顯著（圖1H）。因此，我們重點(diǎn)研究了ALKBH5的表達(dá)及其在胃癌轉(zhuǎn)移中的可能機(jī)制。TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫均顯示GC中ALKBH5表達(dá)降低（圖1I-J）。組織微陣列的統(tǒng)計(jì)分析還顯示，相鄰正常組織中ALKBH5的蛋白質(zhì)水平顯著升高（圖1K-L）。ROC曲線表明，ALKBH5對GC的臨床診斷具有高度敏感性和特異性（圖1M）。生存分析還表明，ALKBH5高表達(dá)的患者預(yù)后改善（圖1N）。臨床統(tǒng)計(jì)顯示，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者ALKBH5的表達(dá)低于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者（圖1O）。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中也觀察到類似的結(jié)果（圖1P）。綜上所述，ALKBH5的低表達(dá)可能是胃癌轉(zhuǎn)移的根源。

2）ALKBH5在體外抑制GC的侵襲和遷移

為了挖掘ALKBH5在GC進(jìn)展中的潛在特征，我們進(jìn)行了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。在HGC-27和BGC-823細(xì)胞中建立了ALKBH5的穩(wěn)定過表達(dá)(圖2A-B)。我們還沉默了SGC-7901細(xì)胞中的ALKBH5（圖2C-D）。經(jīng)transwell分析驗(yàn)證，ALKBH5過表達(dá)后，GC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力明顯受到抑制（圖2E、G），而在SGC-7901細(xì)胞中，ALKBH5敲除顯著增強(qiáng)了GC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力（圖2F、H）。傷口愈合試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ALKBH5的上調(diào)顯著抑制GC細(xì)胞的遷移能力（圖2I）。ALKBH5表達(dá)的減弱加速了GC細(xì)胞的遷移（圖2J）。為了闡明m6A在遷移中的作用，我們在HGC-27細(xì)胞中使用了ALKBH5 H204A突變體（圖2K）。結(jié)果表明，ALKBH5突變對其mRNA或蛋白質(zhì)水平的影響較?。▓D2M-N），但ALKBH5 H204A細(xì)胞中的m6A水平明顯高于LV-ALKBH5 GC細(xì)胞（圖2L）。與ALKBH5過表達(dá)相比，突變組的遷移和侵襲能力也增強(qiáng)（圖2O-P）。這些數(shù)據(jù)表明，ALKBH5過表達(dá)對細(xì)胞侵襲的抑制主要取決于其去甲基酶活性。

3）PKMYT1被確定為ALKBH5的下游靶點(diǎn)

為了確定在ALKBH5下游起關(guān)鍵作用的主要靶基因，我們進(jìn)行了MeRIP-seq和RNA-seq。為了進(jìn)一步鑒定GC中必需的下游靶基因，我們進(jìn)行GEPIA數(shù)據(jù)庫分析和參考相關(guān)文獻(xiàn)，確定四個候選基因（PKMYT1、NT5E、PXDN和MYH9）（圖3A）。使用MeRIP-qRT-PCR和mRNA水平驗(yàn)證，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)ALKBH5過表達(dá)或破壞時，只有PKMYT1表現(xiàn)出穩(wěn)定的改變（圖3B-F）。ALKBH5干擾SGC-7901細(xì)胞后，PKMYT1的m6A水平穩(wěn)定增加（圖3B）。PKMYT1的表達(dá)在過表達(dá)ALKBH5后顯著降低（圖3C-D），在干擾ALKBH5后顯著增加（圖3E-F）。RIP和RNA下拉試驗(yàn)均證明了ALKBH5和PKMYT1轉(zhuǎn)錄本之間的結(jié)合（圖3G-H）。因此，我們初步懷疑PKMYT1可能是ALKBH5的下游效應(yīng)器。

組織微陣列和TCGA數(shù)據(jù)庫結(jié)果均顯示PKMYT1在GC中高表達(dá)，其表達(dá)與不良預(yù)后密切相關(guān)（圖3I-M）。ROC分析表明，PKMYT1在臨床GC診斷中具有顯著的差異性（圖3N）。組織微陣列表達(dá)統(tǒng)計(jì)顯示，ALKBH5和PKMYT1表達(dá)之間存在顯著的負(fù)相關(guān)（圖3O）。為了驗(yàn)證PKMYT1在GC轉(zhuǎn)移中的獨(dú)特作用，我們首先在GC細(xì)胞系中進(jìn)行PKMYT1破壞和過表達(dá)。transwell分析表明，PKMYT1過表達(dá)后，GC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力明顯增強(qiáng)（圖S3H-J）。為了觀察ALKBH5/PKMYT1對胃癌轉(zhuǎn)移的影響，進(jìn)行了一項(xiàng)挽救實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，PKMYT1的過表達(dá)顯著恢復(fù)了由ALKBH5過表達(dá)引起的轉(zhuǎn)移能力（圖3P-R），這些結(jié)果表明PKMYT1是ALKBH5的下游。

4）PKMYT1以m6A依賴的方式促進(jìn)GC的侵襲和遷移

為了確定受ALKBH5影響的特定m6A位點(diǎn)，使用SRAMP網(wǎng)站預(yù)測PKMYT1的mRNA序列。預(yù)測結(jié)果顯示，在PKMYT1的mRNA序列中，有五個潛在的m6A修飾位點(diǎn)具有非常高的可信度（圖4A）。然后，設(shè)計(jì)了這五個位點(diǎn)的特異性引物。MeRIP-qRT-PCR顯示，在ALKBH5過表達(dá)后，前兩個位點(diǎn)對應(yīng)的片段m6A水平顯著降低(圖4B)。當(dāng)涉及ALKBH5去甲基化酶活性的殘基發(fā)生突變時，它們的m6A水平得到恢復(fù)（圖4B）。我們的數(shù)據(jù)表明PKMYT1 mRNA上的兩個位點(diǎn)可能是ALKBH5調(diào)節(jié)的特定位置。在MeRIP-seq中也檢查了GC組織中這兩個位點(diǎn)的m6A水平。來自IGV基因組瀏覽器的結(jié)果表明，與正常組織相比，GC中兩個位點(diǎn)的m6A修飾水平明顯更高（圖4C）。這兩個位點(diǎn)的突變旨在觀察m6A修飾對PKMYT1的影響（圖4D）。結(jié)果顯示，突變組PKMYT1的整體水平降低（圖4E-F）。這兩個位點(diǎn)的突變導(dǎo)致GC轉(zhuǎn)移能力顯著降低。這種現(xiàn)象在ALKBH5敲除后更為明顯(圖4G-H)。因此，PKMYT1以依賴于m6A的方式促進(jìn)GC的侵襲和遷移。

5）PKMYT1 mRNA的M6A修飾通過IGF2BP3維持其穩(wěn)定性

眾所周知，m6A修飾主要依賴于“讀取器”蛋白發(fā)揮額外功能。為了進(jìn)一步研究PKMYT1的m6A修飾中潛在的“讀取器”蛋白，進(jìn)行了RNA下拉實(shí)驗(yàn)和質(zhì)譜分析。質(zhì)譜分析結(jié)果表明，IGF2BP3和RBMX在m6A修飾PKMYT1后可能發(fā)揮作用，而IGF2BP3的得分遠(yuǎn)高于RBMX（圖5A）。我們選擇IGF2BP3進(jìn)行驗(yàn)證。RNA下拉和RIP分析均表明IGF2BP3可與PKMYT1 mRNA結(jié)合（圖5B-C）。組織微陣列和TCGA數(shù)據(jù)庫均顯示IGF2BP3在GC中高表達(dá)，其高表達(dá)對GC患者預(yù)后不良（圖5D-G）。組織微陣列和TCGA數(shù)據(jù)庫結(jié)果均顯示IGF2BP3和PKMYT1在GC中的表達(dá)呈顯著正相關(guān)（圖5H-I）。細(xì)胞系驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證實(shí)，干擾IGF2BP3后，PKMYT1的表達(dá)顯著降低（圖5J-K）。

據(jù)報道，m6A讀取器蛋白IGF2BP3主要通過增強(qiáng)mRNA穩(wěn)定性發(fā)揮作用。因此，我們評估了干擾和過表達(dá)ALKBH5后PKMYT1 mRNA的穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)，在放線菌素D處理下過表達(dá)ALKBH5后，PKMYT1的mRNA穩(wěn)定性顯著降低，但在干擾ALKBH5后，PKMYT1的mRNA穩(wěn)定性顯著增加（圖5L-M）。在ALKBH5 H204A組中，PKMYT1 mRNA的穩(wěn)定性得到恢復(fù)（圖5N）。在干擾IGF2BP3后，觀察到PKMYT1的mRNA穩(wěn)定性顯著降低（圖5O）。為了研究m6A位點(diǎn)修飾對PKMYT1 mRNA穩(wěn)定性的影響，在放線菌素D的作用下，用PKMYT1-CDS、mut1和mut2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染GC細(xì)胞。觀察到，這兩個位點(diǎn)突變后，PKMYT1 mRNA的穩(wěn)定性也降低了(圖5P)。為了進(jìn)一步探討IGF2BP3和PKMYT1的m6A修飾位點(diǎn)之間的關(guān)系，我們采用體外轉(zhuǎn)錄分析和生物素標(biāo)記的方法，分別合成了包含PKMYT1中單個m6A修飾位點(diǎn)突變的全長mRNA序列。在RNA下拉試驗(yàn)中，使用鏈霉親和素結(jié)合免疫磁珠驗(yàn)證IGF2BP3和PKMYT1 mRNA之間的直接相互作用。發(fā)現(xiàn)在這兩個位點(diǎn)突變后，IGF2BP3與PKMYT1 mRNA的結(jié)合能力顯著下降（圖5Q）。RIP分析也證實(shí)了類似的結(jié)果（圖5R）。

6）ALKBH5、PKMYT1和IGF2BP3在體內(nèi)的相關(guān)性

我們分別使用組織微陣列和TCGA數(shù)據(jù)庫對腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中PKMYT1和IGF2BP3的表達(dá)進(jìn)行分析（圖6A-D）。轉(zhuǎn)移組PKMYT1的表達(dá)明顯高于非轉(zhuǎn)移組（圖6A，C）。IGF2BP3和PKMYT1表現(xiàn)出相同的現(xiàn)象（圖6B，D）。生存分析顯示，高ALKBH5和低PKMYT1表達(dá)的患者預(yù)后最佳（圖6 E）。值得注意的是，PKMYT1和IGF2BP3低表達(dá)的患者預(yù)后也最好（圖6F）。接著，我們采用尾靜脈注射法建立裸鼠腫瘤肺轉(zhuǎn)移模型。通過分子成像軟件觀察肺轉(zhuǎn)移的形成。ALKBH5的過表達(dá)降低了這些細(xì)胞形成肺轉(zhuǎn)移的能力（圖6G-H），而ALKBH5的突變（H204A）挽救了這種能力（圖6G-H）。相反，ALKBH5的敲除顯著加快了小鼠轉(zhuǎn)移的形成（圖6I-J）。肺組織切片的HE染色也顯示，GC細(xì)胞中ALKBH5過表達(dá)后，轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)的數(shù)量顯著減少（圖6K-L）。通過IHC評估肺組織切片轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)中ALKBH5和PKMYT1表達(dá)的相關(guān)性（圖6M-N）。PKMYT1的表達(dá)在ALKBH5過表達(dá)后明顯受到抑制，但在ALKBH5突變后得到恢復(fù)（圖6M-N）。ALKBH5敲除后觀察到相反的結(jié)果（圖6O-R）。

結(jié)論：我們確定ALKBH5是GC轉(zhuǎn)移中的一種腫瘤抑制因子，這種作用依賴于ALKBH5的去甲基化酶活性。PKMYT1是ALKBH5的下游靶基因，經(jīng)m6A修飾后可被IGF2BP3識別和結(jié)合。PKMYT1的mRNA穩(wěn)定性增強(qiáng)，導(dǎo)致更高的表達(dá)水平，最終顯著促進(jìn)GC轉(zhuǎn)移。

參考文獻(xiàn)：

Hu Y, Gong C, Li Z, Liu J, Chen Y, Huang Y, Luo Q, Wang S, Hou Y, Yang S, Xiao Y. Demethylase ALKBH5 suppresses invasion of gastric cancer via PKMYT1 m6A modification. Mol Cancer. 2022 Feb 3;21(1):34. doi: 10.1186/s12943-022-01522-y.