具核梭桿菌減少M(fèi)ETTL3介導(dǎo)的m6A修飾，并有助于結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移

近年來的研究表明，微生物與宿主的相互作用在結(jié)腸直腸癌(Colorectal cancer，CRC)中發(fā)揮重要作用。隨著宏基因組測序技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了多種參與CRC致癌的微生物群，其中具核梭桿菌（Fusbacterium nucleatum，Fn）能通過調(diào)控機(jī)體免疫應(yīng)答、表觀遺傳及宿主代謝等多個方面促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，然而其潛在的機(jī)制仍不清楚。本研究中作者探索在CRC發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控機(jī)制。本研究于2022年3月發(fā)表于《Nature Communications》，IF=14.919。

本文技術(shù)路線：

本文主要內(nèi)容：

1 具核梭桿菌減少了人CRC細(xì)胞和移植模型組織中METTL3介導(dǎo)的m6A修飾

斑點(diǎn)雜交分析顯示，與對照組和大腸桿菌共培養(yǎng)的細(xì)胞相比，與具核梭桿菌共培養(yǎng)的細(xì)胞中m6A水平顯著降低(Fig 1a)。在另一種CRC細(xì)胞LoVo中也觀察到具核梭桿菌對m6A修飾的下調(diào)。有趣的是，具核梭桿菌短期處理能夠誘導(dǎo)mRNA m6A修飾的減少(Fig 1b)。通過超高效液相色譜-四極萃取質(zhì)譜分析也證實(shí)了經(jīng)具核梭桿菌細(xì)胞處理后，m6A在總mRNA中的顯著下降 (Fig 1c)。此外具核梭桿菌處理顯著促進(jìn)了細(xì)胞遷移 (Fig 1d）。

已經(jīng)研究證明，m6A寫入器和擦除器參與了m6A修飾的動態(tài)穩(wěn)態(tài)。Western blot結(jié)果顯示，在HCT116和LoVoF細(xì)胞中，具核梭桿菌處理明顯降低了HCT116細(xì)胞中 m6A甲基化酶METTL3的表達(dá)(Fig 1e)。而具核梭桿菌處理對其他m6A橡皮或讀寫器的表達(dá)無明顯影響(Fig 1e），提示m6A修飾的減少可能是由具核梭桿菌下調(diào)METTL3所致。

作者建立了CRC移植模型模型PDX (Fig 1f)。發(fā)現(xiàn)具核梭桿菌處理的PDX腫瘤組織體外核體m6A整體水平明顯下降(Fig 1g)。與大腸桿菌處理或PBS對照相比，具核梭桿菌處理的PDX組織中METTL3 mRNA水平也顯著降低(Fig 1h)。

野生型METTL3的異位表達(dá)挽救了具核梭桿菌引起的m6A水平下降，而非其催化突變體(Fig 1i)。此外，作者試圖確定METTL3介導(dǎo)了m6A修飾是否參與了具核梭桿菌處理誘導(dǎo)的CRC細(xì)胞遷移增強(qiáng)。Transwell檢測表明，過表達(dá)野生型METTL3，而非其催化突變體，明顯逆轉(zhuǎn)了具核梭桿菌處理增強(qiáng)的HCT116細(xì)胞侵襲能力（Fig 1J）。綜上所述，具核梭桿菌通過下調(diào)人結(jié)直腸癌細(xì)胞和PDX組織中METTL3 介導(dǎo)的m6A修飾水平，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲。

Fig1  具核梭桿菌可減少人CRC細(xì)胞和PDX組織中METTL3介導(dǎo)的m6A修飾

2 具核梭桿菌通過調(diào)節(jié)Hippo-YAP信號通路抑制METTL3

NF-κB和hippoyap信號通路相關(guān)基因在HCT116和LoVo細(xì)胞中都被激活(Fig 2a，b)。作者分離的細(xì)胞質(zhì)和核成分HCT116細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)具核梭桿菌增加了YAP在細(xì)胞核中的比例(Fig 2C)。免疫熒光檢測結(jié)果也證實(shí)了YAP顯著升高，Transwell實(shí)驗(yàn)表明，YAP基因的敲除可顯著逆轉(zhuǎn)具核梭桿菌誘導(dǎo)的HCT116細(xì)胞和 LoVo細(xì)胞遷移能力的增強(qiáng)(Fig 2g)。于是作者提出YAP是否調(diào)控METTL3的表達(dá)。當(dāng)YAP被兩種不同的siRNA沉默時，METTL3蛋白水平和m6A水平顯著升高(Fig 2 h,i)。相反，YAP異位表達(dá)下調(diào)METTL3和m6A水平，提示YAP信號通路可能是CRC細(xì)胞中METTL3的負(fù)向上游調(diào)節(jié)因子(Fig 2j,k)。此外，過表達(dá)METTL3可以抑制YAP異位表達(dá)引起的細(xì)胞遷移(Fig 2l)。作者還驗(yàn)證了在具核梭桿菌存在下，YAP在調(diào)控基因表達(dá)中的作用對METTL3的調(diào)控作用。結(jié)果表明，具核梭桿菌處理降低了METTL3的表達(dá)，而YAP卻幾乎完全挽救了下調(diào)(Fig 2m)，提示在CRC細(xì)胞中，YAP信號通路參與了具核梭桿菌誘導(dǎo)的METTL3表達(dá)下調(diào)。

Fig2具核梭桿菌通過調(diào)節(jié)hippo-YAP信號通路抑制METTL3

3  FOXD3是METTL3的轉(zhuǎn)錄因子

Venn圖顯示在METTL3的啟動子區(qū)域有很多FOXD3的結(jié)合位點(diǎn)(?1778 -?1957 bp)，暗示FOXD3可能是METTL3的轉(zhuǎn)錄因子(Fig 3a)。

FOXD3的異位表達(dá)顯著增加的METTL3蛋白水平(Fig 3b)。FOXD3的敲低顯著的降低了METTL3蛋白的表達(dá)(Fig 3c)。此外，F(xiàn)OXD3過表達(dá)增加了m6A水平(Fig 3d)，翹除FOXD3降低了m6A水平(Fig 3e)，這表明FOXD3是METTL3的正向調(diào)節(jié)因子。為了驗(yàn)證FOXD3是否是METTL3的直接轉(zhuǎn)錄因子，采用染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)檢測，結(jié)果表明FOXD3與METTL3啟動子結(jié)合(Fig 3f)。 此外，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)FOXD3的過表達(dá)顯著增強(qiáng)了HCT116細(xì)胞中METTL3-熒光素酶活性(Fig 3g)。提示FOXD3是METTL3的一種正轉(zhuǎn)錄因子。

有趣的是，ChIP實(shí)驗(yàn)顯示具核梭桿菌處理顯著降低了FOXD3與METTL3啟動子區(qū)域的相互作用，這表明具核梭桿菌處理抑制了FOXD3介導(dǎo)的METTL3的轉(zhuǎn)錄(Fig 3h)。雙熒光素酶報告基因檢測證實(shí)，具核梭桿菌處理確實(shí)降低了FOXD3刺激METTL3的轉(zhuǎn)錄活性(Fig 3i)。作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，具核梭桿菌處理顯著降低了PDX組織中的FOXD3水平(Fig 3j)。具核梭桿菌處理的HCT116和LoVo細(xì)胞也得到相似的結(jié)果(Fig 3k）。接下來，作者在HCT116細(xì)胞中敲低YAP，發(fā)現(xiàn)FOXD3升高(Fig 3l)。Western blot檢測證實(shí)，YAP的缺失增加了FOXD3的表達(dá)(Fig 3m)?？偟膩碚f，作者的工作揭示了FOXD3是METTL3的轉(zhuǎn)錄因子。具核梭桿菌可能通過YAP/ FOXD3軸下調(diào)METTL3的表達(dá)。

Fig 3 FOXD3是METTL3的轉(zhuǎn)錄因子

4具核梭桿菌處理后，結(jié)直腸癌細(xì)胞中m6a調(diào)控基因發(fā)生變異

為了研究特定基因中m6A修飾的變化，作者在具核梭桿菌處理的HCT116細(xì)胞中進(jìn)行了全轉(zhuǎn)錄組的m6A測序，m6A測序分析發(fā)現(xiàn)，與未處理的細(xì)胞相比，經(jīng)具核梭桿菌處理的HCT116細(xì)胞中發(fā)生了5841個m6A峰的變化，包括2835個m6A- up峰和3006個m6A- down峰。一個特殊的WGGAM motif (W = A/T， M= A/C)在未處理組的m6A位點(diǎn)中高度富集，而AVWGGA (V = C/G/A， W= A/T)基序只存在于具核梭桿菌處理的細(xì)胞中(Fig 4a)。此外，作者還觀察到m6A峰在起始密碼子和終止密碼子附近特別豐富。具核梭桿菌處理的細(xì)胞中m6A峰明顯下降(Fig 4b)?；?/span>m6A-seq結(jié)果，作者進(jìn)一步分析了總的m6A mRNA分布模式。作者觀察到具核梭桿菌處理后細(xì)胞中mRNA的5'UTR附近的m6A峰和CDS區(qū)減少，但3'UTR區(qū)保持了類似的豐度(Fig 4c)。

在具核梭桿菌處理的細(xì)胞中共鑒定出3589個基因，m6A水平有顯著差異。其中1585個基因m6A表達(dá)上調(diào)，2004個基因m6A表達(dá)下調(diào)。基于這些差異基因，KEGG通路富集分析顯示，具核梭桿菌影響CRC細(xì)胞的多個方面，包括局灶性黏著、緊密連接和Hippo信號通路。在具核梭桿菌處理的細(xì)胞中共鑒定出3589個基因，其中1585個基因m6A表達(dá)上調(diào)，2004個基因m6A表達(dá)下調(diào)。此外，基因本體論(GO)富集分析顯示，在具核梭桿菌處理的CRC細(xì)胞中，少數(shù)與GTPase活性調(diào)節(jié)、細(xì)胞骨架組織和細(xì)胞極性重塑相關(guān)的基因發(fā)生了m6A修飾((Fig 4e)。

Fig4具核梭桿菌處理后，結(jié)直腸癌細(xì)胞中m6a調(diào)控基因發(fā)生變異

 5 m6A-seq和RNA-seq顯示KIF26B是和METTL3的下游靶點(diǎn)

為了確定具核梭桿菌刺激m6a調(diào)控的CRC侵襲性的潛在下游靶點(diǎn)，作者對具核梭桿菌處理的HCT116細(xì)胞進(jìn)行了mRNA測序。表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)155個基因上調(diào)，88個基因下調(diào)基因(Fig 5a)。作者發(fā)現(xiàn)在2004個m6a下調(diào)基因和155個mRNA上調(diào)基因之間有5個基因重疊(Fig 5b)。在鑒定的5個基因中，驅(qū)動蛋白家族成員26B (KIF26B)參與細(xì)胞骨架重組，氧化石墨烯分析表明，細(xì)胞骨架重組，對CRC侵襲性至關(guān)重要(Fig 4e)。m6A測序顯示，具核梭桿菌處理后的kif26b mRNA中終止密碼子附近的m6A峰值顯著下降(Fig 5c)。m6A qpcr檢測結(jié)果表明，m6A的富集經(jīng)具核梭桿菌處理后，KIF26B mRNA確實(shí)減少(Fig 5d)。同時，作者的數(shù)據(jù)證實(shí)了具核梭桿菌處理的HCT116和LoVo細(xì)胞中KIF26B的mRNA和蛋白水平均顯著升高(圖5e， f)。因此，作者選擇KIF26B作為METTL3介導(dǎo)的m6A修飾在CRC細(xì)胞中的候選靶點(diǎn)。

為了驗(yàn)證KIF26B mRNA是METTL3的靶點(diǎn)，作者進(jìn)行了RNA免疫沉淀(RIP)，以METTL3靶基因CREBBP為陽性對照，HPRT1為陰性對照。結(jié)果顯示，KIF26B mRNA與METTL3之間存在明顯的相互作用，表明KIF26B mRNA作為METTL3的直接靶點(diǎn)(Fig 5g)。敲除METTL3可顯著增加表達(dá)KIF26B在HCT116和LoVo細(xì)胞中的表達(dá)(Fig 5h，i)。這些數(shù)據(jù)表明KIF26B的表達(dá)受YAP/FOXD3/METTL3軸的調(diào)控。此外，具核梭桿菌誘導(dǎo)的KIF26B的上調(diào)被野生型METTL3的異位表達(dá)所逆轉(zhuǎn)，而不是其催化突變體，這表明具核梭桿菌的KIF26B的上調(diào)被野生型METTL3的異位表達(dá)所逆轉(zhuǎn)，具核梭桿菌對KIF26B的上調(diào)依賴于METTL3的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶活性(Fig 5j)。

為了進(jìn)一步證實(shí)m6A修飾有助于調(diào)控KIF26B的表達(dá)，作者用甲基化抑制劑DAA處理HCT116細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)DAA處理誘導(dǎo)明顯增加KIF26B mRNA和蛋白表達(dá) (Fig 5k, l)。具核梭桿菌處理誘導(dǎo)KIF26B mRNA和蛋白通過METTL3介導(dǎo)的m6A修飾上調(diào)KIF26B表達(dá)。qRT-PCR結(jié)果顯示，具核梭桿菌顯著延長了HCT116和LoVo細(xì)胞中KIF26B mRNA的半衰期(Fig 5m)。以往的研究報道，YTHDF2特異性識別m6a修飾的mRNA，調(diào)節(jié)其穩(wěn)定性。基于此，作者進(jìn)行了RIP實(shí)驗(yàn)并發(fā)現(xiàn)YTHDF2與KIF26B mRNA結(jié)合(Fig 5n)。YTHDF2誘導(dǎo)KIF26B mRNA顯著升高(Fig 5o)。

綜上所述，這些結(jié)果表明具核梭桿菌誘導(dǎo)的METTL3下調(diào)降低KIF26B的m6A修飾水平，進(jìn)一步減少YTHDF2依賴的mRNA降解，從而促進(jìn)KIF26B在CRC細(xì)胞中的表達(dá)。

Fig 5  KIF26B是和METTL3的下游靶點(diǎn)

6具核梭桿菌通過上調(diào)KIF26B促進(jìn)CRC侵襲和轉(zhuǎn)移

最近的研究報道，KIF26B作為一種癌基因參與胃癌和乳腺癌的發(fā)病。然而，KIF26B在CRC侵襲性和轉(zhuǎn)移中的潛在作用尚未被研究。作者敲除了HCT116細(xì)胞中的KIF26B，并進(jìn)行了mRNA測序(Fig 6a)。轉(zhuǎn)錄組分析揭示KIF26B與細(xì)胞-細(xì)胞連接和對生長因子刺激的反應(yīng)有關(guān)(Fig 6b)， 這對CRC細(xì)胞的侵襲性很重要。Go和KEGG通路富集分析表明，Hippo信號通路在kif26b調(diào)控的基因簽名中顯著富集(Fig 6C)。此外， 具核梭桿菌可顯促進(jìn)細(xì)胞遷移，而KIF26B的下調(diào)則可明顯降低具核梭桿菌誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移能力(Fig 6d,e )。此外，METTL3敲低的 HCT116細(xì)胞中沉默KIF26B，發(fā)現(xiàn)KIF26B的缺失顯著逆轉(zhuǎn)了METTL3敲除引起的細(xì)胞遷移增強(qiáng)(Fig 6g)， 提示KIF26B，至少部分地，介導(dǎo)了METTL3在CRC侵襲性中的功能。

在另外兩種CRC細(xì)胞，RKO和SW620細(xì)胞中進(jìn)一步驗(yàn)證KIF26B在CRC轉(zhuǎn)移中的重要作用。HE染色觀察到，注射CRC細(xì)胞的小鼠肝臟出現(xiàn)嚴(yán)重的轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)(Fig 6h)。KIF26B基因的下調(diào)顯著減少了肝轉(zhuǎn)移(Fig 6h，i)。與大腸桿菌處理過的對照細(xì)胞相比，注射具核梭桿菌細(xì)胞的小鼠形成了明顯的肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，KIF26B基因敲低顯著降低具核梭桿菌誘導(dǎo)的肝轉(zhuǎn)移(Fig 6j,k)。

Fig6具核梭桿菌通過上調(diào)KIF26B促進(jìn)CRC侵襲和轉(zhuǎn)移

7具核梭桿菌與CRC患者METTL3和KIF26B的表達(dá)相關(guān)

為了在結(jié)腸直腸中建立高具核梭桿菌環(huán)境，C57BL/6小鼠在接受抗生素鏈霉素治療3天后，每天進(jìn)行具核梭桿菌或大腸桿菌處理(Fig 7a)。治療15天后，作者觀察到小鼠結(jié)腸直腸中有具核梭桿菌富集(Fig 7b)。值得注意的是，qRT-PCR分析顯示，與大腸桿菌組相比經(jīng)具核梭桿菌處理的小鼠結(jié)腸組織中METTL3 mRNA顯著下降，KIF26B mRNA表達(dá)增加(Fig 7c,d)。

為探討核仁具核梭桿菌/METTL3/KIF26B在晚期CRC患者中的臨床意義，進(jìn)行了CRC樣本收集。作者的研究結(jié)果表明，具核梭桿菌在腫瘤組織中的豐度顯著高于匹配的非腫瘤組織(Fig 7e)。有趣的是，METTL3在腫瘤組織中的表達(dá)水平被下調(diào)(Fig 7f)，而KIF26B在腫瘤組織中的表達(dá)水平顯著高于匹配的非腫瘤組織(Fig 7g)。在CRC腫瘤組織中，核仁芽孢桿菌(具核梭桿菌)的豐度與METTL3的含量呈負(fù)相關(guān)(Fig 7h)。在CRC腫瘤組織中，METTL3和KIF26B的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(Fig 7i)。此外，作者還分析了KIF26B表達(dá)對患者預(yù)后的影響。Cancer Genome Atlas (TCGA)數(shù)據(jù)庫的Kaplan-Meier分析顯示，KIF26B高表達(dá)與CRC患者較短的總生存時間顯著相關(guān)(Fig 7j)。多因素Cox分析證實(shí)KIF26B高表達(dá)與CRC患者不良預(yù)后獨(dú)立相關(guān)(Fig 7k)。

本研究為腸道菌群對人m6A轉(zhuǎn)錄組的影響及其在促進(jìn)CRC轉(zhuǎn)移中的作用提供了關(guān)鍵的見解。具核梭桿菌通過YAP/FOXD3/METTL3軸誘導(dǎo)m6A修飾的減少，導(dǎo)致KIF26B上調(diào)，增強(qiáng)CRC細(xì)胞的侵襲性。提供了一種潛在的一種潛在的靶向具核梭桿菌或KIF26B的治療策略。

參考文獻(xiàn)：
Chen, S., et al., Fusobacterium nucleatum reduces METTL3-mediated m(6)A modification and contributes to colorectal cancer metastasis. Nat Commun, 2022. 13(1): p. 1248.