tRNA m7G修飾通過RPTOR/ULK1/自噬軸促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生

食管癌是一種惡性腫瘤，全世界每年有超過40萬人死于食管癌。轉(zhuǎn)運(yùn)RNA (Transfer RNAs， tRNAs) 是信使RNA上識(shí)別密碼子和連接信使RNA翻譯氨基酸的調(diào)節(jié)因子。然而，tRNA m7G修飾在ESCC中的具體功能和分子機(jī)制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)tRNA m7G甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體蛋白METTL1和WDR4在食管鱗狀細(xì)胞癌 (ESCC) 組織中顯著上調(diào)，于是作者探索METTL1和WDR4在ESCC中的調(diào)控作用。本文于2022年3月發(fā)表于《Nature Communications》，IF=14.919。

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本文主要內(nèi)容：

1 、METTL1 /WDR4在ESCC中上調(diào)，并與ESCC不良預(yù)后相關(guān)

作者使用ESCC樣本隊(duì)列檢測(cè)METTL1/WDR4的表達(dá)。數(shù)據(jù)顯示，與相應(yīng)的對(duì)照組相比，在ESCC樣本中METTL1/WDR4表達(dá)和m7G tRNA修飾均升高(Fig 1a,b)。此外，免疫組化(IHC)染色顯示，METTL1在ESCC腫瘤組織中的表達(dá)高于腫瘤周圍組織(Fig 1c–e)，METTL1的表達(dá)與腫瘤的高分級(jí)和高分期顯著相關(guān)(Fig 1f–h)，說明METTL1在ESCC進(jìn)展中的所必需的。進(jìn)一步研究ESCC患者中METTL1表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。生存分析顯示，METTL1高表達(dá)與較差的總生存和無病生存狀態(tài)相關(guān)(Fig 1i,j)。同樣，WDR4在ESCCs中也上調(diào)，并與預(yù)后不良相關(guān)(Fig 1k,l)。總之， METTL1和WDR4在ESCC中顯著上調(diào)，并與ESCC進(jìn)展和不良預(yù)后相關(guān)。

Fig1  ESCC患者METTL1升高，是ESCC患者的不良預(yù)后因素

2、靶向METTL1表達(dá)可抑制ESCC進(jìn)展

ESCC中METTL1表達(dá)的升高，作者推測(cè)METTL1在ESCC進(jìn)展中起重要的致癌作用。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，首先使用兩個(gè)短發(fā)夾RNA(shM1-1和shM1-2)在KYSE150 (K150)和KYSE30 (K30) ESCC細(xì)胞中進(jìn)行METTL1敲低(Fig. 2a)，抑制METTL1的增殖(Fig 2b)和集落形成能力(Fig 2c,d)。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示shM1-1和shM1-2可導(dǎo)致ESCC細(xì)胞凋亡增加 (Fig. 2e,f)。然后，利用異種移植小鼠模型，探討METTL1在體內(nèi)ESCC進(jìn)展中的作用。與注射shGFP ESCC細(xì)胞的小鼠相比，注射METTL1敲除細(xì)胞的小鼠的腫瘤生長(zhǎng)明顯減慢，腫瘤大小和重量明顯降低(Fig 2g–i)。免疫組化染色顯示shM1-1和shM1-2組腫瘤中METTL1表達(dá)降低，Ki67染色水平降低，證實(shí)下調(diào)METTL1可降低ESCC體內(nèi)增殖活性(Fig 2j,k)?？傊?，作者的研究揭示了METTL1在體外和體內(nèi)ESCC進(jìn)展中的基本功能。

Fig2體外和異種移植模型中，METTL1基因敲低可抑制ESCC進(jìn)展

3、METTL1調(diào)控ESCCs中m7G tRNA修飾、tRNA表達(dá)和mRNA翻譯

在作者的TRAC seq數(shù)據(jù)中，作者在可變環(huán)中發(fā)現(xiàn)了19個(gè)m7G修飾的帶有ABGWY基序序列的tRNAs (Fig 3a)。METTL1的消耗顯著降低了m7G修飾水平(Fig 3b,c)，RNA質(zhì)譜也證實(shí)了METTL1中tRNA m7G修飾水平的降低。作者的RNA質(zhì)譜也證實(shí)了METTL1敲除細(xì)胞中tRNA m7G修飾水平的降低(Fig 3d)。此外，METTL1的缺失降低了大多數(shù)m7G修飾的tRNAs的表達(dá)水平，而非m7G修飾的tRNAs，其表達(dá)幾乎沒有受到影響(Fig 3e,f)。與測(cè)序數(shù)據(jù)一致，作者的m7G Northern印跡雜交和Northwestern印跡雜交分析證實(shí)，在METTL1敲除細(xì)胞中，m7G修飾水平降低，m7G修飾的tRNAs表達(dá)降低 (Fig 3g)。此外，過表達(dá)野生型METTL1，而非其催化死亡突變體，增加了m7G tRNA的整體修飾水平和m7G修飾的tRNA的表達(dá)(Fig 3h)，證實(shí)METTL1通過其tRNA m7G甲基轉(zhuǎn)移酶活性調(diào)控tRNA的修飾和表達(dá)。同樣，抑制WDR4導(dǎo)致m7G修飾水平和m7G修飾的tRNA表達(dá)下降；WDR4的過表達(dá)增加了K150和K30 ESCC細(xì)胞中m7G tRNA修飾和m7G修飾的tRNA 的表達(dá)(Fig 3i,j)。這些數(shù)據(jù)支持了METTL1/WDR4在調(diào)控tRNA m7G修飾和表達(dá)中的基本功能。

鑒于tRNAs在mRNA翻譯中起作用，作者接下來確定METTL1是否對(duì)ESCC細(xì)胞mRNA翻譯有影響。多聚體分析表明，在METTL1敲低細(xì)胞中mRNA翻譯活性降低，反映在多聚核糖體峰減少(Fig 3k)。 此外，嘌呤霉素?cái)z取量測(cè)定也證實(shí)了這一點(diǎn)。ESCC細(xì)胞中METTL1基因的敲除降低了mRNA的翻譯活性(Fig 3L)。在METTL1缺失的細(xì)胞中，重新表達(dá)野生型METTL1而不是突變型METTL1可以挽救mRNA的翻譯效率(Fig 3l)，證明m7G的催化功能對(duì)METTL1促進(jìn)mRNA翻譯至關(guān)重要?？偟膩碚f，作者的數(shù)據(jù)表明，METTL1介導(dǎo)的m7G tRNA修飾對(duì)ESCC中tRNA的表達(dá)和mRNA的翻譯至關(guān)重要。

為了研究異常m7G修飾介導(dǎo)的翻譯障礙的影響，作者使用METTL1敲除和控制ESCC細(xì)胞進(jìn)行了多核糖體結(jié)合mRNA測(cè)序(Fig 3m)。作者的數(shù)據(jù)顯示，翻譯效率(TEs)降低的mRNA有明顯更多的密碼子被m7G修飾的tRNAs解碼(Fig 3n)。Go和KEGG分析結(jié)果表明，下調(diào)的mRNA顯著富集在在自噬生物學(xué)過程和mTOR信號(hào)通路 (Fig 3o，p)。值得注意的是，與其他檢測(cè)到的mRNA相比，TEs降低，參與自噬生物學(xué)過程或mTOR信號(hào)通路的mRNA，有更多的密碼子被m7G修飾的tRNA解碼 (Fig 3q)。

接下來作者探討METTL1在調(diào)節(jié)自噬負(fù)調(diào)控和mTOR信號(hào)通路基因表達(dá)中的作用，結(jié)果顯示，METTL1減少了它們的蛋白質(zhì)表達(dá)，但對(duì)它們的mRNA幾乎沒有影響(Fig 3r,s)。此外，多核糖體qPCR檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)了RPTOR的翻譯效率(Fig 3I)。mTOR信號(hào)通路通過pULK1負(fù)調(diào)控自噬。研究發(fā)現(xiàn)，METTL1的消耗降低了pULK1的水平，增加了氯喹(CQ)處理和未處理的K150和K30細(xì)胞中LC3-II/LC3-I比例(Fig 3u,v)?？傊?，METTL1以m7G相關(guān)密碼子依賴的方式促進(jìn)mTOR信號(hào)相關(guān)基因的翻譯和自噬通路的負(fù)調(diào)控。

Fig 3 METTL1調(diào)控tRNA m7G修飾、tRNA表達(dá)和致癌mRNA翻譯

4、 RPTOR是METTL1的重要下游靶點(diǎn)

作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，RPTOR的重新表達(dá)挽救了METTL1衰竭的增殖和集落形成能力ESCC細(xì)胞(Fig. 4a–d)。此外，RPTOR過表達(dá)增加了ULK1蛋白的磷酸化水平，降低了METTL1耗竭細(xì)胞的LC3-II/LC3-I比值，并消除自噬通量(Fig. 4e–h)?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明RPTOR是METTL1的重要下游靶點(diǎn)，進(jìn)一步證實(shí)METTL1介導(dǎo)的tRNA m7G修飾通過調(diào)控RPTOR促進(jìn)ESCC進(jìn)展。

鑒于在METTL1敲除的ESCC細(xì)胞中，RPTOR可以挽救ULK1的磷酸化水平，減少自噬，作者接下來在METTL1敲除的ESCC細(xì)胞中敲除ULK1，以確定METTL1和RPTOR是否通過調(diào)節(jié)ULK1介導(dǎo)的自噬來促進(jìn)ESCC進(jìn)展(Fig. 4i)。數(shù)據(jù)表明，抑制ULK1可以挽救METTL1枯竭的ESCC細(xì)胞的生長(zhǎng)(Fig. 4j)，進(jìn)一步證明METTL1和RPTOR通過ULK1調(diào)控ESCC的進(jìn)展。此外，自噬通量檢測(cè)表明，敲除ULK1可以消除METTL1缺失的ESCC細(xì)胞中增加的自噬通量(Fig. 4k–m)?？偟膩碚f， RPTOR/自噬軸在介導(dǎo)METTL1在ESCC進(jìn)展中的功能中具有重要作用。

Fig4 METTL1/RPTOR/ULK1軸在ESCC進(jìn)展中起重要作用

 5、METTL1的敲除(cKO)可在體內(nèi)抑制ESCC的腫瘤發(fā)生

為了直接探究m7G tRNA修飾在體內(nèi)ESCC腫瘤發(fā)生中的作用，作者構(gòu)建了上皮組織特異性Mettl1條件敲除)小鼠模型(Keratin14-CreER; Mettl1fl/fl， cKO。用他莫西芬誘導(dǎo)Mettl1敲除后，用DNA烷基化劑二乙基亞硝胺(DEN)和多激酶抑制劑索拉非尼(sorafenib)誘導(dǎo)cKO小鼠和對(duì)照組小鼠發(fā)生ESCC腫瘤(Fig 5a)。在DEN治療8周，sorafenib治療12周后，作者發(fā)現(xiàn)對(duì)照小鼠的食道有明顯的病理改變，而metttl1 cKO小鼠的病變面積和ESCC數(shù)量明顯減少(Fig 5a–e)。組織學(xué)分析顯示，與對(duì)照組相比，cKO小鼠腫瘤組織中METTL1和Ki67染色水平降低(Fig 5f,g)。

作者還發(fā)現(xiàn)Mettl1 cKO降低了Mettl1 cKO小鼠腫瘤中m7G tRNA修飾，降低了RPTOR蛋白水平(Fig 5h-j)，而RPTOR mRNA水平保持不變(Fig 5k)。值得注意的是，cKO組腫瘤中LC3蛋白水平明顯高于對(duì)照組(Fig 5l,m)，cKO組的LC3蛋白水平明顯高于對(duì)照組，說明METTL1基因敲除導(dǎo)致體內(nèi)自噬增加。

Fig5 敲除METTL1可抑制ESCC體內(nèi)腫瘤發(fā)生

6、METTL1 /WDR4介導(dǎo)的m7G tRNA修飾促進(jìn) ESCC進(jìn)展

為了進(jìn)一步加強(qiáng)m7G tRNA修飾與ESCC進(jìn)展之間的功能聯(lián)系，作者進(jìn)行了功能獲得研究(Fig 6a)。數(shù)據(jù)表明，過表達(dá)野生型METTL1而非其催化死亡的突變體可以促進(jìn)ESCC細(xì)胞的生長(zhǎng)和集落形成 (Fig 6b–e)。此外，過表達(dá)而非突變的METTL1可以上調(diào)RPTOR蛋白的表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡和自噬 (Fig 6f–i)。總之，METTL1在調(diào)節(jié)靶向表達(dá)和ESCC進(jìn)展中，tRNA m7G的催化功能是必不可少的。

然后作者在ESCC細(xì)胞中過表達(dá)WDR4，進(jìn)一步證實(shí)了作者的結(jié)論，m7G tRNA修飾促進(jìn)了WDR4的表達(dá)ESCC進(jìn)展。作者的數(shù)據(jù)顯示過表達(dá)WDR4穩(wěn)定了METTL1蛋白的表達(dá)，增加了下游靶蛋白R(shí)PTOR的表達(dá) (Fig 6j)。功能分析表明，過表達(dá)WDR4可促進(jìn)ESCC細(xì)胞生長(zhǎng)和集落形成 (Fig 6k–m)。這些數(shù)據(jù)說明ESCC進(jìn)展中WDR4是一個(gè)重要的致癌基因?？傊?， MRTTL1 /WDR4介導(dǎo)的m7G tRNA修飾在調(diào)節(jié)ESCC進(jìn)展中的重要致癌功能。

Fig 6  METTL1或WDR4過表達(dá)促進(jìn)ESCC進(jìn)展

7、METTL1在體內(nèi)促進(jìn)ESCC腫瘤的發(fā)生

在DEN/sorafenib治療18周后，Mettl1 CKI小鼠的食道出現(xiàn)了巨大的腫瘤負(fù)荷，而對(duì)照組小鼠的食道只出現(xiàn)了少量和小的病變(Fig 7a-c)。此外，CKI小鼠異常增生和鱗狀細(xì)胞癌的數(shù)量明顯高于對(duì)照組(Fig 7d–f)。組織學(xué)分析顯示，cKI小鼠腫瘤中METTL1表達(dá)水平和增殖活性均高于對(duì)照組(Fig 7g，h)。此外， cKI小鼠腫瘤中m7G tRNA修飾和m7G修飾的tRNA表達(dá)水平均高于對(duì)照組小鼠(Fig 7i)。此外，在Mettl1 cKI小鼠腫瘤中，RPTOR蛋白水平升高，但其mRNA水平?jīng)]有升高(Fig 7j–m)。綜上所述，METTL1和m7G tRNA修飾促進(jìn)了ESCC體內(nèi)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

Fig7 METTL1過表達(dá)促進(jìn)ESCC體內(nèi)腫瘤發(fā)生

本研究揭示了METTL1介導(dǎo)的ESCC腫瘤發(fā)生的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)METTL1/WDR4介導(dǎo)tRNA m7G修飾在選擇性致癌mRNA翻譯和ESCC進(jìn)展中發(fā)揮著重要的生理功能，為建立新的ESCC治療策略提供了分子基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

 Han H, Yang C, Ma J, Zhang S, Zheng S, Ling R, Sun K, Guo S, Huang B, Liang Y, Wang L, Chen S, Wang Z, Wei W, Huang Y, Peng H, Jiang YZ, Choe J, Lin S. N⁷-methylguanosine tRNA modification promotes esophageal squamous cell carcinoma tumorigenesis via the RPTOR/ULK1/autophagy axis. Nat Commun. 2022 Mar 18;13(1):1478. doi: 10.1038/s41467-022-29125-7. PMID: 35304469.