lncRNA MIR100HG促進(jìn)結(jié)直腸癌進(jìn)展
上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是一個(gè)與轉(zhuǎn)移和耐藥性相關(guān)的過程，非編碼RNA（ncRNAs）起著關(guān)鍵作用。我們之前的研究表明，嵌入ncRNA宿主基因MIR100HG第三內(nèi)含子的miR-100和miR-125b在結(jié)直腸癌（CRC）中對(duì)西妥昔單抗產(chǎn)生耐藥性。然而，MIR100HG轉(zhuǎn)錄本本身是否在西妥昔單抗耐藥性或EMT中起作用尚不清楚。MIR100HG的表達(dá)與EMT標(biāo)記物密切相關(guān)，并作為EMT的陽性調(diào)節(jié)因子。MIR100HG在體外和體內(nèi)均能維持西妥昔單抗耐藥性，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。hnRNPA2B1被鑒定為MIR100HG的結(jié)合蛋白。在機(jī)制上，MIR100HG通過與hnRNPA2B1相互作用，維持了TCF7L2的mRNA穩(wěn)定性，TCF7L2是Wnt/β-catenin的主要轉(zhuǎn)錄輔激活因子。hnRNPA2B1在MIR100HG存在下識(shí)別TCF7L2 mRNA的m6A位點(diǎn)。TCF7L2反過來激活MIR100HG轉(zhuǎn)錄，形成前饋調(diào)節(jié)回路。MIR100HG/hnRNPA2B1/TCF7L2軸在出現(xiàn)局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或與西妥昔單抗耐藥相關(guān)的疾病進(jìn)展的CRC患者中得到增強(qiáng)。我們的研究發(fā)現(xiàn)，MIR100HG是結(jié)腸癌中一種有效的EMT誘導(dǎo)劑，通過激活MIR100HG/hnRNPA2B1/TCF7L2反饋回路，可能有助于西妥昔單抗耐藥性和轉(zhuǎn)移。本文于2021年3月發(fā)表于Molecular Cancer（IF=27.401）上。
技術(shù)路線
結(jié)果
1）MIR100HG與結(jié)腸癌EMT密切相關(guān)，并參與其調(diào)節(jié)
我們之前描述了從人類HCA-7細(xì)胞中產(chǎn)生西妥昔單抗敏感CC細(xì)胞和西妥昔單抗耐藥CC-CR細(xì)胞。使用1型膠原在3D培養(yǎng)中培養(yǎng)的CC細(xì)胞產(chǎn)生中空的全極化結(jié)構(gòu)。相比之下，大多數(shù)CC-CR細(xì)胞表現(xiàn)出堅(jiān)實(shí)、無組織的結(jié)構(gòu)，失去了頂-基底極性（圖1a）。細(xì)胞極性的喪失被認(rèn)為是癌癥進(jìn)展的標(biāo)志，上皮細(xì)胞經(jīng)歷間質(zhì)轉(zhuǎn)化是一個(gè)重要步驟。與CC細(xì)胞相比，CC-CR細(xì)胞顯示E-鈣粘蛋白介導(dǎo)的粘附連接缺失，緊密連接蛋白ZO-1減少，間充質(zhì)標(biāo)記物N-鈣粘蛋白和波形蛋白表達(dá)增加（圖1b、c）。包括Snail、Twist和ZEB家族成員在內(nèi)的EMT誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子（EMT-TFs）在CC-CR細(xì)胞中的表達(dá)也升高（圖1c）。這些特征表明EMT發(fā)生在3D培養(yǎng)的CC-CR細(xì)胞中。
由于與CC相比，MIR100HG是CC-CR中過表達(dá)最多的轉(zhuǎn)錄本，因此我們研究了MIR100HG是否參與了EMT。我們首先在一個(gè)大的人類CRC數(shù)據(jù)集中分析了MIR100HG和EMT基因表達(dá)特征列表之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)MIR100HG和EMT高度相關(guān)（圖1d）。通過使用分子特征數(shù)據(jù)庫中的EMT-hallmark基因集，我們通過GSEA證明EMT基因表達(dá)模式在高水平MIR100HG的結(jié)腸癌樣本中顯著富集（圖1e）。此外，對(duì)TCGA CRC數(shù)據(jù)庫的分析顯示，MIR100HG與間充質(zhì)基因或EMT-TF的表達(dá)之間存在很強(qiáng)的正相關(guān)(圖1f)。此外，MIR100HG過表達(dá)的CC細(xì)胞顯示E-鈣粘蛋白表達(dá)減少，間充質(zhì)基因和EMT-TFs表達(dá)增加；相比之下，在MIR100HGKOE4細(xì)胞中觀察到這些基因的表達(dá)增加（圖1g和h）。在通過反義寡核苷酸（ASOs）轉(zhuǎn)染MIR100HG過表達(dá)或敲除后，SW480（低內(nèi)源性MIR100HG表達(dá)）和SW620（中度內(nèi)源性MIR100HG表達(dá)）細(xì)胞中觀察到類似的結(jié)果（圖1i、j）。總之，這些結(jié)果表明MIR100HG在結(jié)腸癌中誘導(dǎo)EMT。
2）MIR100HG對(duì)維持西妥昔單抗耐藥性和促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移很重要
我們研究了MIR100HG是否參與了結(jié)腸癌的耐藥性和轉(zhuǎn)移，以及與EMT密切相關(guān)的表型。我們首先分析了29個(gè)結(jié)直腸癌細(xì)胞系中西妥昔單抗的反應(yīng)性，這些細(xì)胞系由基于基因表達(dá)的共識(shí)分子分型（CMS）分層。我們發(fā)現(xiàn)CMS2和CMS3分類中的細(xì)胞對(duì)西妥昔單抗治療有反應(yīng)，而CMS4間充質(zhì)組中的細(xì)胞表現(xiàn)出西妥昔單抗耐藥性（圖2a），支持EMT在結(jié)腸癌中賦予西妥昔單抗耐藥性。在3D培養(yǎng)中，MIR100HGKOE4 CC-CR細(xì)胞的菌落數(shù)與WT細(xì)胞相當(dāng)；然而，在西妥昔單抗存在的情況下，與WT相比，MIR100HGKOE4細(xì)胞的菌落數(shù)量顯著減少（圖2b）。西妥昔單抗治療后，在MIR100HGKOE4 CC-CR細(xì)胞中觀察到Ki-67減少和cleaved caspase-3染色增加（圖2c）?；謴?fù)全長MIR100HG轉(zhuǎn)錄本（MIR100HG-FL）在很大程度上消除了MIR100HGKOE4 CC-CR細(xì)胞對(duì)西妥昔單抗的反應(yīng)性（圖2d）。為了確定這些發(fā)現(xiàn)是否可以在體內(nèi)重現(xiàn)，我們用表達(dá)熒光素酶的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的MIR100HGKOE4 CC-CR細(xì)胞在裸鼠皮下建立異種移植物，然后用西妥昔單抗治療小鼠（圖2e）。與對(duì)照組相比，西妥昔單抗治療后MIR100HGKOE4組的體內(nèi)生物發(fā)光以及腫瘤體積和重量顯著降低（圖2f和g）。這些結(jié)果表明，MIR100HG對(duì)維持結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)西妥昔單抗的耐藥性很重要，降低MIR100HG水平可以恢復(fù)藥物敏感性。
接下來我們確定MIR100HG是否與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移有關(guān)。對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫的分析顯示，有轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者的MIR100HG表達(dá)顯著高于無轉(zhuǎn)移的患者（圖2h）。MIR100HG在SW480細(xì)胞和DIF細(xì)胞中的上調(diào)顯著增加遷移和侵襲（圖2i）。相比之下，SW620細(xì)胞和HCT116細(xì)胞中MIR100HG的敲除阻礙了它們的遷移和侵襲能力（圖2j）。此外，我們通過將MIR100HG沉默的SW620或LoVo細(xì)胞注射到裸鼠的尾靜脈中來進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)移試驗(yàn)。與對(duì)照組相比，注射MIR100HG沉默細(xì)胞的小鼠表現(xiàn)出轉(zhuǎn)移減少，整體生物發(fā)光信號(hào)和肺轉(zhuǎn)移的數(shù)量表明了這一點(diǎn)，并提高了存活率（圖2k-n）。這些結(jié)果表明MIR100HG促進(jìn)了腫瘤的侵襲，增強(qiáng)了結(jié)直腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。
3）hnRNPA2B1是MIR100HG的直接功能性結(jié)合伙伴
lncRNAs發(fā)揮作用的方式之一是直接與RNA結(jié)合蛋白相互作用。由于MIR100HG主要位于細(xì)胞核內(nèi)，我們通過ChIRP結(jié)合質(zhì)譜分析，以確定CRC細(xì)胞中MIR100HG的核定位相互作用伙伴。我們從CC-CR和HCT116細(xì)胞中分別分離出173和76個(gè)純化蛋白（圖3a）。其中，五個(gè)候選基因hnRNPA2B1、SUPT16H、SNRNP70、DKC1和PES1在所有組中均富集（圖3a）。hnRNPA2B1被選為進(jìn)一步研究的對(duì)象，因?yàn)閾?jù)報(bào)道它是各種癌癥類型中的EMT調(diào)節(jié)因子。在CC-CR和HCT116細(xì)胞中證實(shí)了MIR100HG探針富集hnRNPA2B1（圖3a），并通過RIP分析進(jìn)一步驗(yàn)證，與對(duì)照IgG相比，使用抗hnRNPA2B1的抗體，MIR100HG在下拉中顯著富集（圖3b）。為了確定與hnRNPA2B1結(jié)合的MIR100HG的特定區(qū)域，根據(jù)RNA fold web服務(wù)器（圖3c）預(yù)測的MIR100HG二級(jí)結(jié)構(gòu)生成了一系列MIR100HG片段，然后將這些構(gòu)建體用于生物素標(biāo)記的RNA下拉分析。結(jié)果表明，hnRNPA2B1主要與從核苷酸2170到3100轉(zhuǎn)錄的MIR100HG片段結(jié)合（圖3d）。此外，使用帶有Flag標(biāo)簽的全長或截短hnRNPA2B1抗體進(jìn)行RIP分析，以闡明hnRNPA2B1介導(dǎo)與MIR100HG相互作用的特定結(jié)構(gòu)域（圖3e）。結(jié)果顯示hnRNPA2B1的RNA識(shí)別基序2（RRM2）結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)與MIR100HG的相互作用（圖3f）。然后我們研究了hnRNPA2B1在結(jié)腸癌進(jìn)展中的作用。hnRNPA2B1的沉默增加了CC-CR和LoVo細(xì)胞中E-鈣粘蛋白的表達(dá)，降低了波形蛋白的表達(dá)，這與MIR100HG對(duì)EMT的影響一致（圖3g）。在3D培養(yǎng)中，敲除CC-CR細(xì)胞中的hnRNPA2B1可減少總菌落數(shù)，而西妥昔單抗治療的減少更為明顯，這表明hnRNPA2B1可促進(jìn)西妥昔單抗耐藥性（圖3h）。同時(shí)，hnRNPA2B1的敲除顯著阻礙了細(xì)胞遷移和侵襲（圖3i）。接下來，我們試圖闡明hnRNPA2B1在MIR100HG介導(dǎo)的西妥昔單抗耐藥性和轉(zhuǎn)移中的作用。沉默hnRNPA2B1可逆轉(zhuǎn)CC和SW480細(xì)胞中MIR100HG過表達(dá)介導(dǎo)的E-cadherin減少（圖3j）。在西妥昔單抗存在的情況下，MIR100HGKOE4 CC-CR細(xì)胞的集落數(shù)減少，這部分被hnRNPA2B1過表達(dá)所抵消（圖3k）。敲除hnRNPA2B1也消除了MIR100HG過表達(dá)細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)（圖3l）。總的來說，這些結(jié)果表明MIR100HG通過與hnRNPA2B1的相互作用促進(jìn)CRC進(jìn)展。
4）MIR100HG和hnRNPA2B1調(diào)節(jié)TCF7L2 mRNA的穩(wěn)定性并激活Wnt信號(hào)
我們推測某些mRNAs可能受到MIR100HG和hnRNPA2B1之間相互作用的影響。為了分析受MIR100HG和hnRNPA2B1調(diào)節(jié)的候選mRNA，我們沉默了MIR100HG或hnRNPA2B1，并進(jìn)行了RNA測序。值得注意的是，TCF7L2被確定為所有MIR100HG-和hnRNPA2B1沉默組中唯一一個(gè)顯著下調(diào)的基因（圖4a）。因?yàn)槲覀冎暗难芯勘砻?/span>MIR100HG和Wnt信號(hào)之間存在正相關(guān)，我們決定集中精力研究TCF7L2，因?yàn)樗?/span>Wnt信號(hào)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄輔激活因子，與耐藥性、轉(zhuǎn)移和EMT密切相關(guān)。如圖4b所示，敲除MIR100HG或hnRNPA2B1可降低CC-CR和HCT116細(xì)胞中TCF7L2 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，而MIR100HG或hnRNPA2B1的過表達(dá)增加了CC和SW480細(xì)胞中TCF7L2 mRNA和蛋白質(zhì)水平。hnRNPs是已知的RNA穩(wěn)定性調(diào)節(jié)因子。為了測試HRNPA2B1是否會(huì)影響TCF7L2 mRNA的穩(wěn)定性，我們用放線菌素D處理細(xì)胞，并檢測TCF7L2 mRNA水平。在CC-CR和HCT116細(xì)胞（圖4c）中證實(shí)了hnRNPA2B1敲除后TCF7L2 mRNA的加速衰變，表明hnRNPA2B1起到穩(wěn)定TCF7L2 mRNA的作用。MIR100HG的敲除也增強(qiáng)了TCF7L2 mRNA的降解（圖4d）。MIR100HG的過表達(dá)延長了CC和Caco-2細(xì)胞中TCF7L2 mRNA的半衰期，但hnRNPA2B1的沉默消除了MIR100HG的穩(wěn)定作用（圖4e）。這些結(jié)果表明HRNPA2B1和MIR100HG通過增強(qiáng)mRNA穩(wěn)定性協(xié)同上調(diào)TCF7L2的表達(dá)。接下來我們確定TCF7L2是否參與MIR100HG或hnRNPA2B1介導(dǎo)的CRC進(jìn)展。TCF7L2在MIR100HG或hnRNPA2B1缺失的CRC細(xì)胞中的過表達(dá)挽救了西妥昔單抗耐藥性、細(xì)胞遷移和侵襲（圖4f、g）?；謴?fù)TCF7L2誘導(dǎo)的EMT，其被MIR100HG或hnRNPA2B1下調(diào)抑制（圖4h）。接下來，我們研究了MIR100HG/hnRNPA2B1/TCF7L2軸的功能是否通過激活Wnt信號(hào)來介導(dǎo)。在MIR100HG或hnRNPA2B1敲除后，TOP/FOP flash活性受到顯著抑制，而TCF7L2過表達(dá)可緩解這種抑制，尤其是在給予標(biāo)準(zhǔn)Wnt配體Wnt3A后（圖4i）。此外，與細(xì)胞生長（c-Myc和Cyclin D1）和EMT（ZEB1和Slug）相關(guān)的Wnt靶基因子集在MIR100HG-和hnRNPA2B1過表達(dá)的CC細(xì)胞中顯著上調(diào)（圖4j，k）。相反，MIR100HG和hnRNPA2B1的敲除導(dǎo)致CC-CR細(xì)胞中這些Wnt靶基因的減少（圖4j，k）?？傊?，這些結(jié)果表明MIR100HG通過與hnRNPA2B1相互作用增強(qiáng)TCF7L2 mRNA的穩(wěn)定性，并隨后激活Wnt信號(hào)通路。
5）hnRNPA2B1和MIR100HG對(duì)TCF7L2 mRNA的穩(wěn)定作用依賴于m6A
由于hnRNPA2B1是m6A依賴性核RNA處理事件的介質(zhì)，我們推測hnRNPA2B1可能以m6A依賴性的方式調(diào)節(jié)TCF7L2 mRNA的穩(wěn)定性。我們發(fā)現(xiàn)CC-CR和HCT116細(xì)胞中m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3的沉默降低了TCF7L2 mRNA水平（圖5a）。MeRIP檢測進(jìn)一步證實(shí)，METTL3沉默降低了TCF7L2 mRNA的m6A修飾水平(圖5b)。使用SRAMP在線工具確定了TCF7L2 mRNA中五個(gè)預(yù)測的m6A位點(diǎn)，然后通過MeRIP分析進(jìn)行驗(yàn)證（圖5c）。用m6A抗體下拉后，TCF7L2 mRNA的最大富集是終止密碼子附近3’UTR中的+2133位點(diǎn)（圖5c）。接下來，我們確定hnRNPA2B1和TCF7L2之間的相互作用是否取決于m6A修飾。RIP檢測表明，在CC-CR和HCT116細(xì)胞中，hnRNPA2B1抗體可富集TCF7L2 mRNA(圖5d)，表明hnRNPA2B1和TCF7L2 mRNA之間存在相互作用。METTL3的敲除降低了這種富集（圖5e），表明TCF7L2 mRNA上的m6A修飾對(duì)于其與hnRNPA2B1的相互作用是必要的。值得注意的是，在MIR100HGKOE4 CC-CR和HCT116細(xì)胞中，HRNPA2B1沉淀的TCF7L2 mRNA顯著減少（圖5f），這意味著HRNPA2B1和TCF7L2之間的相互作用也依賴于MIR100HG。此外，我們進(jìn)行了體內(nèi)RNA沉淀分析，以驗(yàn)證hnRNPA2B1和TCF7L2之間的相互作用是否依賴于m6A。在這種情況下，含有WT或突變+2133 m6A修飾位點(diǎn)的TCF7L2片段被S1m標(biāo)記（圖5g），S1m是一種修飾的鏈霉親和素結(jié)合適體，其作用類似于生物素，但具有更高的親和力。利用將S1m標(biāo)記的TCF7L2構(gòu)建物轉(zhuǎn)染CC和HCT8細(xì)胞的系統(tǒng)，可以在體內(nèi)進(jìn)行m6A修飾?；阪溍褂H和素適體的捕獲顯示TCF7L2的m6A位點(diǎn)突變消除了與hnRNPA2B1的關(guān)聯(lián)（圖5g）。這表明TCF7L2 mRNA的m6A修飾對(duì)于其與hnRNPA2B1的關(guān)聯(lián)至關(guān)重要。此外，我們構(gòu)建了攜帶WT或突變體TCF7L2序列的熒光素酶報(bào)告基因。異位hnRNPA2B1誘導(dǎo)WT報(bào)告基因的熒光素酶活性顯著增加，但這種增加被HCT8和HEK293T細(xì)胞m6A位點(diǎn)突變削弱（圖5h和i）。hnRNPA2B1介導(dǎo)的熒光素酶活性的增加被METTL3或MIR100HG敲除所阻斷（圖5j和k）?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明TCF7L2 mRNA的m6A修飾是其與hnRNPA2B1結(jié)合所必需的，MIR100HG是相互作用不可或缺的伙伴。
6）TCF7L2激活MIR100HG轉(zhuǎn)錄并形成一個(gè)互惠的正反饋回路
為了進(jìn)一步探索MIR100HG在CC-CR細(xì)胞中上調(diào)的機(jī)制，我們使用JASPAR數(shù)據(jù)庫分析了MIR100HG 2-kb啟動(dòng)子區(qū)域中預(yù)測的TF結(jié)合基序。值得注意的是，在MIR100HG啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)了四個(gè)TCF7L2結(jié)合位點(diǎn)（圖6a）。與此一致，CC-CR和HCT116細(xì)胞中TCF7L2的沉默導(dǎo)致MIR100HG表達(dá)減少（圖6b），表明TCF7L2可能是MIR100HG的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器。TCF7L2的過表達(dá)增強(qiáng)了CC和Caco-2細(xì)胞中MIR100HG的表達(dá)（圖6b）。為了確定TCF7L2是否激活MIR100HG轉(zhuǎn)錄，將含有MIR100HG啟動(dòng)子中TCF7L2結(jié)合位點(diǎn)的熒光素酶報(bào)告構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)到CC-CR和HCT116細(xì)胞中（圖6c）。MIR100HG啟動(dòng)子的序列缺失分析和定點(diǎn)突變表明，TCF7L2結(jié)合位點(diǎn)1和2是TCF7L2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活的主要位點(diǎn)（圖6d和e）。染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）分析證實(shí)TCF7L2蛋白在TCF7L2結(jié)合位點(diǎn)1和2直接結(jié)合到MIR100HG啟動(dòng)子（圖6f）。此外，在一組CRC細(xì)胞系以及TCGA數(shù)據(jù)庫中觀察到TCF7L2和MIR100HG表達(dá)之間存在正相關(guān)（圖6g和h）?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明MIR100HG和TCF7L2之間存在相互調(diào)節(jié)機(jī)制，其中MIR100HG和hnRNPA2B1穩(wěn)定TCF7L2 mRNA，而TCF7L2通過轉(zhuǎn)錄激活提高MIR100HG豐度（圖6i）。
7）結(jié)腸癌標(biāo)本中MIR100HG、hnRNPA2B1和TCF7L2表達(dá)的驗(yàn)證
為了檢測MIR100HG/hnRNPA2B1/TCF7L2軸是否在結(jié)腸癌患者的西妥昔單抗耐藥性中起作用，我們在西妥昔單抗治療開始前和腫瘤進(jìn)展時(shí)從12名個(gè)體中獲得了成對(duì)的腫瘤標(biāo)本。使用顯色RNAscope原位雜交，我們發(fā)現(xiàn)，與治療前相比，西妥昔單抗治療進(jìn)展的腫瘤中，MIR100HG和TCF7L2顯著過表達(dá)（圖7a和b）。在使用西妥昔單抗進(jìn)展的腫瘤的連續(xù)切片中也觀察到hnRNPA2B1免疫反應(yīng)性增加（圖7a和b）。觀察到MIR100HG或hnRNPA2B1與TCF7L2表達(dá)之間存在正相關(guān)（圖7c）。這些結(jié)果表明，在結(jié)腸癌患者中，西妥昔單抗耐藥時(shí)，MIR100HG、hnRNPA2B1和TCF7L2的表達(dá)上調(diào)。接下來，我們分析了14對(duì)原發(fā)性結(jié)直腸癌組織、鄰近非腫瘤組織及其匹配的淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移樣本中MIR100HG、hnRNPA2B1和TCF7L2的表達(dá)。與原發(fā)性病變相比，淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的MIR100HG、hnRNPA2B1和TCF7L2的表達(dá)顯著增加（圖7d-f）。在原發(fā)性結(jié)直腸癌組織和轉(zhuǎn)移性病變中，MIR100HG或hnRNPA2B1與TCF7L2表達(dá)之間也存在正相關(guān)性（圖7g和h）。這些結(jié)果提示MIR100HG、hnRNPA2B1和TCF7L2在這些CRC患者的轉(zhuǎn)移灶中較原發(fā)灶表達(dá)增加。
結(jié)論：我們的研究結(jié)果揭示了一個(gè)以前未知的作用—MIR100HG通過形成涉及hnRNPA2B1和TCF7L2的調(diào)控回路，調(diào)控CRC中EMT相關(guān)的西妥昔單抗耐藥和轉(zhuǎn)移。
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