m6A修飾增強(qiáng)circALG1的海綿吸附力促進(jìn)結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移

大量研究顯示m6A修飾可以增強(qiáng)mRNA或lncRNA結(jié)合miRNA的能力。但是其對circRNA結(jié)合miRNA的影響尚不清楚。本研究證實(shí)m6A修飾circALG1可增強(qiáng)其結(jié)合miR-342-5p和能力進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移。本研究于2022年3月發(fā)表在《Molecular Cancer》IF: 27.401期刊上。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、circALG1在CRC中高表達(dá)

circRNA的芯片分析結(jié)果顯示，和癌旁組織比較，有353個(gè)circRNAs在CRC組織中顯著上調(diào)（圖1A），54個(gè)circRNAs相比于健康對照在CRC患者外周血中顯著上調(diào)（圖1B）。對兩種方法獲得的差異表達(dá)circRNAs取交集，鑒定到兩個(gè)circRNAs，分別是circALG1和circCOL6A3（圖1C）。隨后利用在線網(wǎng)站SRAMP預(yù)測這兩個(gè)circRNA是否發(fā)生m6A修飾，結(jié)果發(fā)現(xiàn)都發(fā)生，但由于在CRC患者的組織和外周血中circALG1的整體表達(dá)水平高于circCOL6A3，所以作者選擇了circALG1作為后續(xù)研究的重點(diǎn)。此外，使用GEO中的GSE126094數(shù)據(jù)集進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)circALG1在CRC癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織（圖1D）。為進(jìn)一步確定circALG1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平，收集了40對結(jié)直腸癌患者的癌旁組織、20例結(jié)直腸癌患者術(shù)前和術(shù)后1周的血液標(biāo)本以及15例健康個(gè)體的外周血標(biāo)本進(jìn)行qRT-PCR檢測。結(jié)果顯示circALG1在CRC癌組織和外周血中均顯著高表達(dá)（圖1E-1F）。有趣的是，circALG1的表達(dá)在CRC術(shù)后一周的患者外周血中顯著下降（圖1G）。ROC曲線顯示circALG1在結(jié)直腸癌患者癌組織和癌旁組織、結(jié)直腸癌患者外周血及健康人群外周血、結(jié)直腸癌患者術(shù)前、術(shù)后外周血的表達(dá)水平均有較好的區(qū)分（圖1H-1J）。

圖1 circRNA的表達(dá)譜揭示circALG1在CRC中高表達(dá)

2、CRC細(xì)胞中circALG1的特征

針對circALG1形成環(huán)的位點(diǎn)作者設(shè)計(jì)了一種聚合引物和一種發(fā)散引物。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，聚合引物在cDNA和gDNA中均擴(kuò)增出條帶，而發(fā)散引物僅擴(kuò)增出cDNA的條帶，進(jìn)一步的cDNA測序發(fā)現(xiàn)環(huán)狀位點(diǎn)的存在(圖2A)，表明circALG1是環(huán)狀的。親本基因ALG1 mRNA相比，circALG1表現(xiàn)出對RNase R消化的抗性（圖2B）。放線菌素處理后，細(xì)胞中circALG1的降解速度明顯慢于ALG1 mRNA的降解速度，表明circALG1是穩(wěn)定的（圖2C）。核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)和FISH實(shí)驗(yàn)表明circALG1主要定位于細(xì)胞質(zhì)（圖2D-2E）。

圖2 CRC細(xì)胞中circALG1的表征

3、circALG1在體內(nèi)外促進(jìn)CRC的轉(zhuǎn)移

作者檢測了5中細(xì)胞系中circALG1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)在HCT116中的最低，在SW480中最高，所以候選選擇這兩個(gè)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在HCT116中構(gòu)建circALG1穩(wěn)定過表達(dá)的細(xì)胞株，在SW480中構(gòu)建circALG1穩(wěn)定干擾的細(xì)胞株。結(jié)果顯示過表達(dá)circALG1后細(xì)胞的遷移和侵襲水平顯著增強(qiáng)，沉默circALG1表達(dá)則相反（圖3A-3B）。同時(shí)，作者構(gòu)建了ALG1過表達(dá)和敲除的對照細(xì)胞株，但結(jié)果顯示無論是過表達(dá)還是干擾ALG1對CRC細(xì)胞遷移和侵襲都無顯著影響。表明線性ALG1不影響circALG1的功能。此外，在體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移模型中，過表達(dá)circALG1的小鼠顯示出更多的肝和肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，沉默circALG1則相反（圖3-3D）。這些結(jié)果說明circALG1與CRC轉(zhuǎn)移相關(guān)。

圖3 circALG1促進(jìn)CRC的體內(nèi)轉(zhuǎn)移

4、m5A修飾circALG1增強(qiáng)CRC細(xì)胞的侵襲和遷移能力

通過在線網(wǎng)站SRAMP，發(fā)現(xiàn)circALG1極有可能發(fā)生m6A修飾，此外，甲基化RNA免疫沉淀(MeRIP)檢測中觀察到circALG1的富集，這證實(shí)了circALG1確實(shí)經(jīng)歷了m6A修飾（圖4A）。隨后研究circALG1 m6A修飾水平對circALG1功能的影響，通過突變circALG1中兩個(gè)最有可能的m6A修飾位點(diǎn)后，構(gòu)建其野生型和突變型質(zhì)粒（圖4B）。用同樣數(shù)量的野生型和突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染circALG1穩(wěn)定沉默的SW480細(xì)胞株。qRT-PCR分析顯示，不同組circALG1表達(dá)水平無差異（圖4C）；當(dāng)一個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變時(shí)，細(xì)胞內(nèi)m6a修飾的circALG1水平降低，而當(dāng)兩個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變時(shí)，細(xì)胞內(nèi)未觀察到m6a修飾的circALG1水平（圖4D）。功能實(shí)驗(yàn)表明，circALG1的m6A位點(diǎn)突變降低了腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力（圖4E）。這些結(jié)果表明，circALG1 m6A修飾水平與CRC細(xì)胞的遷移和侵襲能力呈正相關(guān)。

圖4 m5A修飾的circALG1促進(jìn)CRC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移

5、circALG1通過miR-342-5p促進(jìn)CRC細(xì)胞的侵襲和遷移

作者利用在線軟件預(yù)測到5個(gè)可能和circALG1結(jié)合的miRNAs，利用雙熒光素酶探究了他們與circALG1之間的結(jié)合關(guān)系，結(jié)果顯示，只有miR-342-5p的熒光活性相比于對照組顯著下降（圖5A），提示circALG1和miR-342-5p之間可能存在結(jié)合關(guān)系。如圖5B所示，構(gòu)建circALG1和miR-342-5p結(jié)合位點(diǎn)突變的circALG1質(zhì)粒和野生型質(zhì)粒，檢測熒光素酶活性，結(jié)果顯示共轉(zhuǎn)染circALG1野生型質(zhì)粒和miR-342-5p mimics時(shí)，熒光素酶活性顯著下降，而共轉(zhuǎn)染circALG1野生型質(zhì)粒和miR-342-5p inhibitor時(shí)，則增強(qiáng)熒光素酶活性（圖5B）。此外，在circALG1突變組熒光素酶活性不因miR-342-5p改變。這些結(jié)果表明circALG1可特異性結(jié)合miR-342-5p。在circALG1的RAP實(shí)驗(yàn)中，觀察到miR-342-5p的顯著富集（圖5C）。功能性實(shí)驗(yàn)表明過表達(dá)miR-342-5p可以逆轉(zhuǎn)circALG1過表達(dá)對CRC細(xì)胞遷移和侵襲的增強(qiáng)作用（圖5D）；抑制miR-342-5p則可以逆轉(zhuǎn)circALG1沉默對CRC細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用。這些說明circALG1通過海綿吸附miR-342-5p促進(jìn)CRC細(xì)胞的侵襲和遷移。

圖5 circALG1通過miR-342-5p促進(jìn)CRC細(xì)胞的侵襲和遷移

6、PGF是circALG1/miR-342-5p信號軸的下游靶基因

為了探究circALG1/miR-342-5p信號軸的下游靶基因，作者對沉默circALG1前和沉默后的SW480細(xì)胞進(jìn)行RNA測序?？傆?jì)獲得76個(gè)差異表達(dá)基因，其中有7個(gè)與miR-342-5p的預(yù)測靶基因重疊（圖6A）。通過UALCAN進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)只有PGF的表達(dá)在CRC腫瘤組織中顯著上調(diào)，并與不良預(yù)后相關(guān)，并且在本實(shí)驗(yàn)的CRC臨床樣本中PGF也在CRC中顯著上調(diào)（圖6B-6D）。

相關(guān)性分析結(jié)果顯示PGF的表達(dá)和miR-342-5p的表達(dá)負(fù)相關(guān)（圖6E）。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)也證實(shí)PGF和miR-342-5p之間的存在直接結(jié)合關(guān)系（圖6F）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)PGF在5株細(xì)胞系中的表達(dá)趨勢和circALG1一致。因而在SW480中進(jìn)行PGF沉默表達(dá)的功能缺失實(shí)驗(yàn)，在HCT116中進(jìn)行PGF過表達(dá)的功能獲得實(shí)驗(yàn)，結(jié)果和預(yù)期一致，PGF沉默抑制細(xì)胞的侵襲和遷移，過表達(dá)則相反（圖6G-6H）。隨后發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PGF可以顯著上調(diào)ERK的磷酸化水平并激活上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的表達(dá)，沉默PGF的表達(dá)結(jié)果則相反（圖6I）。

回復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PGF沉默逆轉(zhuǎn)了因circALG1過表達(dá)或miR-342-5p抑制導(dǎo)致的HCT116細(xì)胞遷移和侵襲的增強(qiáng)；反過來PGF過表達(dá)同樣可逆轉(zhuǎn)因circALG1抑制或miR-342-5p過表達(dá)導(dǎo)致的HCT116細(xì)胞遷移和侵襲的減弱（圖6J-6K）。在CRC臨床樣本中，同樣可觀察到PGF的高表達(dá)，以及上調(diào)的ERK磷酸化和激活的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化基因的表達(dá)（圖6L）。

綜上所述，PGF是circALG1/miR-342-5p信號軸的下游靶基因。

圖6 PGF是circALG1/miR-342-5p信號軸的下游靶基因

7、m6A修飾circALG1增強(qiáng)其結(jié)合miR-342-5p的能力

為研究m6A修飾對circALG1功能的影響，進(jìn)行了circALG1的RAP實(shí)驗(yàn)使用SW480細(xì)胞，在該細(xì)胞中提前轉(zhuǎn)染了circALG1的野生型載體和m6A修飾位點(diǎn)突變的載體。結(jié)果顯示，circALG1中m6A修飾的減少減弱了其與miR-342-5p的結(jié)合（圖7A）。隨后構(gòu)建類似的雙熒光素酶質(zhì)粒即circALG1上m6A修飾位點(diǎn)突變或不突變的質(zhì)粒。結(jié)果顯示circALG1 m6A修飾位點(diǎn)的突變增強(qiáng)了miR-342-5p mimics組熒光素酶的表達(dá)，熒光強(qiáng)度增加，當(dāng)兩個(gè)m6A修飾位點(diǎn)都發(fā)生突變時(shí)，熒光強(qiáng)度最高，但在mimics NC組熒光素酶強(qiáng)度不受circALG1上m6A修飾位點(diǎn)突變的影響（圖7B）。這些結(jié)果表明，miR-342-5p mimic對含有m6A修飾位點(diǎn)突變序列的circALG1的螢火蟲熒光素酶質(zhì)粒表達(dá)的抑制作用減弱，提示circALG1與miR-342-5p的結(jié)合受m6A修飾的調(diào)控。

然后研究了m6A修飾影響circALG1與miR-342-5p結(jié)合的具體機(jī)制。文獻(xiàn)表明，circRNA m6A修飾的功能往往需要m6A修飾相關(guān)蛋白的參與。對circALG1 RAP中拉下的蛋白進(jìn)行MS檢測，YTHDF1在m6A修飾相關(guān)蛋白中富集最高；因此，初步選擇該蛋白作為研究重點(diǎn)（圖7C）。此外，我們在YTHDF1 RIP實(shí)驗(yàn)中檢測到circALG1的富集（圖7D）。當(dāng)circALG1 m6A修飾位點(diǎn)發(fā)生突變時(shí)，YTHDF1的RIP檢測結(jié)果顯示，富集的circALG1明顯減少，這說明circALG1與YTHDF1的結(jié)合依賴于m6A修飾（圖7E）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)干擾YTHDF1的表達(dá)降低了circALG1對miR-342-5p的結(jié)合能力（圖7F），并降低了靶基因PGF的表達(dá)（圖7G），該作用是通過YTHDF1特異性增強(qiáng)circALG1的穩(wěn)定性實(shí)現(xiàn)的（圖7H）。

作者還從m6A writer的角度研究了circALG1 m6A修飾后ceRNA功能的變化。circALG1 m6A基序?yàn)?/span>RACH (R = A或G；H = A, C或U)，它可以被METTL3讀取，并催化腺苷酸的甲基化。作者設(shè)計(jì)了METTL3 siRNA進(jìn)行相關(guān)功能缺失實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示METTL3的沉默降低了circALG1 m6A修飾的水平，削弱了對miR-342-5p的結(jié)合能力（圖7I）。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，含有circALG1野生型質(zhì)粒序列時(shí)，沉默METTL3削弱了miR-342-5p對熒光素酶活性的抑制作用，增強(qiáng)了熒光素酶強(qiáng)度。而在circALG1上m6A修飾位點(diǎn)突變的質(zhì)粒中，METTL3的沉默不影響熒光素酶活性（圖7J）。這些結(jié)果說明circALG1 m6A修飾增強(qiáng)其結(jié)合miR-342-5p的能力。

圖7 m6A修飾circALG1增強(qiáng)其結(jié)合miR-342-5p的能力

圖8 實(shí)驗(yàn)猜想：CircALG1通過競爭性結(jié)合miR-342-5p，減輕miR-342-5p對PGF mRNA表達(dá)的抑制作用，促進(jìn)PGF表達(dá)，導(dǎo)致CRC侵襲增強(qiáng)

參考文獻(xiàn)：

Lin, C., Ma, M., Zhang, Y. et al. The N6-methyladenosine modification of circALG1 promotes the metastasis of colorectal cancer mediated by the miR-342-5p/PGF signalling pathway. Mol Cancer 21, 80 (2022). https://doi.org/10.1186/s12943-022-01560-6