ESCCAL-1-食管鱗狀細胞癌的細胞周期進展的調控因子

LncRNAs在人食管鱗狀細胞癌(ESCC)的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。我們之前的研究表明，下調LncRNA ESCCAL-1的表達可抑制ESCC細胞的生長，但其機制尚不清楚。在這項研究中，我們發(fā)現(xiàn)ESCCAL-1的過表達通過阻斷泛素介導的Gal-1的降解來促進ESCC細胞增殖和細胞周期進展。ESCCAL-1在ESCC組織中明顯上調，具有很好的診斷價值。ESCCAL-1的過表達增強了ESCC細胞的增殖和細胞周期的進展，而下調ESCCAL-1則產生相反的效果。在機制上，LncRNA ESCCAL-1直接與Gal-1結合，在不影響其mRNA水平的情況下正向調控其蛋白水平。Gal-1的上調促進ESCC細胞增殖和細胞周期的進展。下調Gal-1可減輕ESCCAL-1介導的細胞高增殖、NF-κB信號通路激活和ESCC細胞致瘤性的影響。因此，我們的研究結果為ESCCAL-1通過與Gal-1蛋白相互作用和穩(wěn)定來促進ESCC腫瘤發(fā)生和細胞周期進展的機制提供了新的見解，提示了一個潛在的ESCC治療靶點。本文于2022年3月發(fā)表于NPJ PRECISION ONCOLOGY（IF=8.254）上。

技術路線

結果

1）多個轉錄數(shù)據(jù)集顯示ESCCAL-1過表達作為ESCC潛在的診斷性生物標志物

通過分析來自GEO的GSE120356和GSE53622的LncRNA表達數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)與匹配的正常組織相比，ESCCAL-1是ESCC中上調最顯著的LncRNA之一(圖1A)。此外，我們還分析了來自ESCC樣本的4個獨立的基因表達數(shù)據(jù)集，包括TCGA隊列、GEPIA隊列、GSE53624隊列、GSE53625隊列。與正常組織相比，ESCCAL-1在ESCC腫瘤中的表達持續(xù)增加(圖1B-E)。我們通過qRT-PCR進一步驗證了ESCC標本中ESCCAL-1的表達模式。與正常組織相比，ESCCAL-1在ESCC腫瘤組織中顯著過表達(圖1F)。此外，ESCCAL-1在ESCC細胞株中的表達也上調(圖1G)。我們進一步分析了ESCCAL-1表達與ESCC患者臨床特點的關系，發(fā)現(xiàn)ESCCAL-1高表達與腫瘤分化不良顯著相關，與腫瘤晚期輕度相關。這些數(shù)據(jù)表明，ESCCAL-1的高表達是一種有潛力的診斷性ESCC的生物標志物。

2）ESCCAL-1過表達促進ESCC細胞增殖

為了闡明ESCCAL-1在維持ESCC細胞增殖中的致癌作用，我們在一個ESCCAL-1表達相對較低的KYSE150細胞株中異位表達了ESCCAL-1，在ESCCAL-1表達較高的EC9706和KYSE450細胞株中沉默了ESCCAL-1的表達，并進行了CCK-8實驗，菌落形成實驗和EdU染色。通過qRTPCR證實了基于慢病毒重組載體的ESCCAL-1過表達(OE-AL-1)和敲低表達的效率(圖2A, B)。過表達ESCCAL-1可提高KYSE150細胞的活力(圖2C)，而敲低ESCCAL-1可隨著時間的推移降低EC9706和KYSE450細胞的活力。集落形成實驗表明，過表達ESCCAL-1能增強體外ESCC細胞的克隆形成能力(圖2F)，而下調ESCCAL-1則能減少集落形成(圖2G)。此外，EdU實驗顯示，異位表達ESCCAL-1促進了KYSE150細胞DNA合成(圖2H)，而下調ESCCAL-1則抑制了EC9706和KYSE450細胞DNA合成(圖2I, J)?？偟膩碚f，體外功能獲得和功能喪失試驗都證明ESCCAL-1促進ESCC細胞增殖。

3）ESCCAL-1過表達促進ESCC細胞周期進展

我們檢測了異位表達的ESCCAL-1對ESCC細胞周期進程的影響。流式細胞術分析顯示，與對照相比，過表達ESCCAL-1可導致KYSE150表達ESCCAL-1的G0/G1期減少，G2/M期增加(圖3A)，而ESCCAL1基因的敲低則導致相反的結果(圖3B-D)。由于CCND1復合物和cyclin依賴性激酶抑制劑 CDKN1A和CDKN1B是控制細胞周期進展的關鍵調控因子，我們隨后檢測了它們在ESCC細胞中的蛋白水平。結果表明，與對照組相比，ESCCAL-1的高表達使CDK4和CCND1的蛋白質水平上調了2倍以上（圖3E），而ESCCAL-1的敲除使其蛋白質水平降低了70%（圖3F，G）。有趣的是，ESCCAL-1的過表達使CDKN1A的蛋白質水平降低了約40%，但沒有降低CDKN1B（圖3E），而ESCCAL-1的敲除使CDKN1A的蛋白質水平顯著增加了至少2.5倍（圖3F，G）。這些結果表明CDK4、CCND1和CDKN1A有助于ESCCAL-1介導的ESCC細胞周期進程。

4）LncRNA ESCCAL-1直接與Gal-1蛋白結合并積極調節(jié)其蛋白水平

通過在線工具RNAfold分析了MFE模式和質心模式下ESCCAL-1轉錄本的二級結構，二者均預測了Y形結構（圖4A），表明ESCCAL-1具有蛋白質結合潛力。事實上，我們通過RNA蛋白質下拉分析和質譜分析確定了一組可能與ESCCAL-1發(fā)生物理相互作用的蛋白質。然后，我們選擇覆蓋可靠性最高的前3位ESCCAL-1結合蛋白HSP10、Gal-1和H2B進行RIP驗證。Gal-1被確認為lncRNA-ESCCAL-1結合的底物蛋白，如圖4B，C所示。為了研究Gal-1的表達模式，我們通過qRT PCR檢測了收集的41對新鮮ESCC手術標本中的Gal-1轉錄，我們觀察到腫瘤組織和正常組織中Gal-1的mRNA水平沒有顯著差異（圖4D）。此外，在41例ESCC標本中，Gal-1的mRNA水平和ESCCAL-1的轉錄水平之間沒有顯著相關性（圖4E）。然而，與正常組織相比，15例ESCC腫瘤組織中有12例的Gal-1蛋白水平明顯上調（圖4F）。在15例ESCC腫瘤組織中，Gal-1的蛋白水平與ESCCAL1的轉錄水平呈正相關（圖4G）。 此外，我們還發(fā)現(xiàn)在ESCC細胞系中Gal-1的蛋白水平上調，并與ESCCAL-1的表達呈正相關(圖4H, I)。此外，ESCCAL-1的過表達增加了ESCC細胞中Gal-1的蛋白水平，而ESCCAL-1的敲除降低了Gal1的蛋白水平（圖4J）。這些結果表明，lncRNA-ESCCAL-1直接與Gal-1蛋白結合并積極調節(jié)其蛋白水平，Gal-1蛋白是ESCCAL-1的下游分子。

5）Gal-1是一種致癌蛋白，促進ESCC細胞增殖和細胞周期進展

為了研究Gal-1在ESCC細胞增殖中的生物學作用，我們進行了CCK-8實驗和EdU染色?；诼《局亟M載體的Gal-1過表達（OE-Gal-1）和敲除的效率通過western blot測定（圖5A）。CCK-8試驗和EdU染色結果均顯示，Gal-1的過表達增加了KYSE150的細胞增殖（圖5B，E），而Gal-1的敲除降低了KYSE450和EC9706的增殖能力（圖5C，D，F，G）。隨后，我們檢測了Gal-1異位表達對ESCC細胞周期進程的影響。流式細胞術分析表明，Gal-1的過表達導致G0/G1期顯著減少（圖5H），而Gal-1的敲除增加了ESCC細胞周期的G0/G1期（圖5I，J）。此外，western blot顯示，與對照組相比，Gal-1的高表達使CDK4和CCND1的蛋白質水平上調至少2倍（圖5K），而Gal-1的敲除使其蛋白質水平下調高達60%（圖5K）。Gal-1的過表達降低了CDKN1A的蛋白水平（圖5K），總的來說，Gal-1促進ESCC細胞增殖和細胞周期進展。

6）ESCCAL-1通過Gal-1促進ESCC細胞周期進程

考慮到ESCCAL-1直接與Gal-1蛋白結合，并且它們在調節(jié)ESCC細胞增殖和周期方面具有相似的生物學功能，我們假設ESCCAL-1通過與Gal-1的相互作用在ESCC中發(fā)揮致癌作用。為了驗證這一假設，我們進行了拯救實驗，并使用CCK-8試驗和EdU染色測量了其生物學功能。Gal-1的缺失顯著損害了OE-ESCCAL-1誘導的ESCC中的高細胞增殖（圖6A，B）。同時，流式細胞術和western blot分析顯示，ESCCAL-1過表達對細胞周期和細胞周期調節(jié)因子（CDK4、CCND1和CDKN1A）的影響至少部分被ESCC細胞中Gal-1的敲除所消除（圖6C，D）。為了探索Gal-1介導的可能信號通路，我們使用在線工具STRING預測Gal-1的蛋白質互作網絡。在這個網絡中，作為與Gal-1蛋白最密切相關的信號分子之一，NF-κB引起了我們的注意，因為之前的許多研究已經闡明，NF-κB信號的異常激活與腫瘤進展有關，包括ESCC。Western blot顯示，ESCCAL-1的過表達導致NF-κB的激活，當Gal-1同時被敲除時，該信號顯著減少（圖6E）。這些結果表明，ESCCAL-1可能通過Gal-1依賴的NF-κB激活促進ESCC細胞周期進程。

7）ESCCAL-1以Gal-1介導的方式促進ESCC腫瘤生長

為了進一步闡明ESCCAL-1-Gal-1相互作用在控制ESCC腫瘤發(fā)生中的作用，進行了裸鼠成瘤實驗。結果顯示，來源于ESCCAL-1過表達細胞的腫瘤生長速度更快，腫瘤大小更大，腫瘤重量更重（圖7A-C）。然而，Gal-1的缺失顯著削弱了ESCCAL-1過表達對ESCC腫瘤生長的促進作用（圖7A-C）。然后通過IHC染色檢測異種移植瘤中增殖標記物Ki-67的水平。結果顯示，與對照組相比，ESCCAL-1過表達組中Ki-67陽性細胞的數(shù)量顯著增加，這進一步表明ESCCAL-1過表達促進了ESCC細胞在體內的增殖（圖7D）。但是，由ESCCAL-1過表達誘導的Ki-67陽性細胞的增加明顯被Gal-1敲除所抵消（圖7D）。接下來，我們再次進行了體內拯救實驗，以確認ESCCAL-1/Gal-1軸在ESCC生長中的作用。如圖7E所示，我們發(fā)現(xiàn)Gal-1的過表達促進了腫瘤生長，而Gal-1的敲除抑制了體內腫瘤生長，進一步表明Gal-1在ESCC中的致癌作用。此外，ESCCAL-1基因敲除可顯著減輕OE-Gal-1引起的腫瘤促進作用，表明ESCCAL-1/Gal-1軸參與了ESCC的進展?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明ESCCAL-1以Gal-1依賴的方式促進ESCC腫瘤生長。

8）ESCCAL-1通過阻斷Smurf1介導的泛素化增強Gal-1蛋白的穩(wěn)定性

鑒于ESCCAL-1直接與Gal-1蛋白相互作用，并與Gal-1蛋白水平呈正相關，而不影響Gal-1 mRNA水平，我們打算探索ESCCAL-1介導的Gal-1蛋白在ESCC細胞中增加的潛在機制。首先，我們發(fā)現(xiàn)在KYSE450和EC9706細胞中，當用CHX處理指定時間時，ESCCAL-1的敲除縮短了Gal-1蛋白的半衰期（圖8A，B）。此外，蛋白酶體抑制劑MG132（圖8C）至少部分消除了ESCCAL-1敲除誘導的Gal-1蛋白減少，這表明ESCCAL-1通過阻斷其泛素化介導的降解來保護Gal-1蛋白。進一步IP結合western blot證實，在MG132存在的情況下，敲除ESCCAL-1可顯著促進ESCC細胞中Gal-1的泛素化（圖8D），表明ESCCAL-1通過泛素-蛋白酶體途徑（UPP）防止Gal-1蛋白降解，從而穩(wěn)定Gal-1蛋白。為了初步研究ESCCAL-1缺失通過UPP導致Gal-1降解的潛在機制，我們尋找可能介導Gal-1泛素化修飾的E3泛素連接酶。我們重點研究了兩種候選分子Smurf1和CUL4A，以進行實驗驗證。進一步IP結合western blot顯示，敲除ESCCAL-1可促進Smurf1與Gal-1蛋白的結合（圖8E），這表明Gal-1蛋白是Smurf1的底物之一。此外，我們發(fā)現(xiàn)siRNA介導的Smurf1消融增加了ESCC細胞中Gal-1的蛋白水平（圖8F）。這些數(shù)據(jù)表明，ESCCAL-1通過阻斷Smurf1介導的泛素化來穩(wěn)定Gal-1蛋白（圖8G）。

結論：
   我們證明ESCCAL1的過表達通過調節(jié)細胞周期調節(jié)因子促進ESCC的進展。LncRNA ESCCAL-1與Gal-1蛋白發(fā)生物理相互作用，阻止E3泛素連接酶Smurf1和Gal-1蛋白復合物的形成，從而穩(wěn)定Gal-1蛋白。這種lncRNA與蛋白質相互作用的新機制為ESCC提供了潛在的治療策略。

參考文獻：

Cui Y, Yan M, Wu W, Lv P, Wang J, Huo Y, Lou Y, Ma X, Chang J, Guan F, Cao W. ESCCAL-1 promotes cell-cycle progression by interacting with and stabilizing galectin-1 in esophageal squamous cell carcinoma. NPJ Precis Oncol. 2022 Mar 1;6(1):12. doi: 10.1038/s41698-022-00255-x.