ESCCAL-1-食管鱗狀細(xì)胞癌的細(xì)胞周期進(jìn)展的調(diào)控因子

LncRNAs在人食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。我們之前的研究表明，下調(diào)LncRNA ESCCAL-1的表達(dá)可抑制ESCC細(xì)胞的生長(zhǎng)，但其機(jī)制尚不清楚。在這項(xiàng)研究中，我們發(fā)現(xiàn)ESCCAL-1的過(guò)表達(dá)通過(guò)阻斷泛素介導(dǎo)的Gal-1的降解來(lái)促進(jìn)ESCC細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)展。ESCCAL-1在ESCC組織中明顯上調(diào)，具有很好的診斷價(jià)值。ESCCAL-1的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了ESCC細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期的進(jìn)展，而下調(diào)ESCCAL-1則產(chǎn)生相反的效果。在機(jī)制上，LncRNA ESCCAL-1直接與Gal-1結(jié)合，在不影響其mRNA水平的情況下正向調(diào)控其蛋白水平。Gal-1的上調(diào)促進(jìn)ESCC細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的進(jìn)展。下調(diào)Gal-1可減輕ESCCAL-1介導(dǎo)的細(xì)胞高增殖、NF-κB信號(hào)通路激活和ESCC細(xì)胞致瘤性的影響。因此，我們的研究結(jié)果為ESCCAL-1通過(guò)與Gal-1蛋白相互作用和穩(wěn)定來(lái)促進(jìn)ESCC腫瘤發(fā)生和細(xì)胞周期進(jìn)展的機(jī)制提供了新的見解，提示了一個(gè)潛在的ESCC治療靶點(diǎn)。本文于2022年3月發(fā)表于NPJ PRECISION ONCOLOGY（IF=8.254）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）多個(gè)轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)集顯示ESCCAL-1過(guò)表達(dá)作為ESCC潛在的診斷性生物標(biāo)志物

通過(guò)分析來(lái)自GEO的GSE120356和GSE53622的LncRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)與匹配的正常組織相比，ESCCAL-1是ESCC中上調(diào)最顯著的LncRNA之一(圖1A)。此外，我們還分析了來(lái)自ESCC樣本的4個(gè)獨(dú)立的基因表達(dá)數(shù)據(jù)集，包括TCGA隊(duì)列、GEPIA隊(duì)列、GSE53624隊(duì)列、GSE53625隊(duì)列。與正常組織相比，ESCCAL-1在ESCC腫瘤中的表達(dá)持續(xù)增加(圖1B-E)。我們通過(guò)qRT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證了ESCC標(biāo)本中ESCCAL-1的表達(dá)模式。與正常組織相比，ESCCAL-1在ESCC腫瘤組織中顯著過(guò)表達(dá)(圖1F)。此外，ESCCAL-1在ESCC細(xì)胞株中的表達(dá)也上調(diào)(圖1G)。我們進(jìn)一步分析了ESCCAL-1表達(dá)與ESCC患者臨床特點(diǎn)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)ESCCAL-1高表達(dá)與腫瘤分化不良顯著相關(guān)，與腫瘤晚期輕度相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明，ESCCAL-1的高表達(dá)是一種有潛力的診斷性ESCC的生物標(biāo)志物。

2）ESCCAL-1過(guò)表達(dá)促進(jìn)ESCC細(xì)胞增殖

為了闡明ESCCAL-1在維持ESCC細(xì)胞增殖中的致癌作用，我們?cè)谝粋€(gè)ESCCAL-1表達(dá)相對(duì)較低的KYSE150細(xì)胞株中異位表達(dá)了ESCCAL-1，在ESCCAL-1表達(dá)較高的EC9706和KYSE450細(xì)胞株中沉默了ESCCAL-1的表達(dá)，并進(jìn)行了CCK-8實(shí)驗(yàn)，菌落形成實(shí)驗(yàn)和EdU染色。通過(guò)qRTPCR證實(shí)了基于慢病毒重組載體的ESCCAL-1過(guò)表達(dá)(OE-AL-1)和敲低表達(dá)的效率(圖2A, B)。過(guò)表達(dá)ESCCAL-1可提高KYSE150細(xì)胞的活力(圖2C)，而敲低ESCCAL-1可隨著時(shí)間的推移降低EC9706和KYSE450細(xì)胞的活力。集落形成實(shí)驗(yàn)表明，過(guò)表達(dá)ESCCAL-1能增強(qiáng)體外ESCC細(xì)胞的克隆形成能力(圖2F)，而下調(diào)ESCCAL-1則能減少集落形成(圖2G)。此外，EdU實(shí)驗(yàn)顯示，異位表達(dá)ESCCAL-1促進(jìn)了KYSE150細(xì)胞DNA合成(圖2H)，而下調(diào)ESCCAL-1則抑制了EC9706和KYSE450細(xì)胞DNA合成(圖2I, J)?？偟膩?lái)說(shuō)，體外功能獲得和功能喪失試驗(yàn)都證明ESCCAL-1促進(jìn)ESCC細(xì)胞增殖。

3）ESCCAL-1過(guò)表達(dá)促進(jìn)ESCC細(xì)胞周期進(jìn)展

我們檢測(cè)了異位表達(dá)的ESCCAL-1對(duì)ESCC細(xì)胞周期進(jìn)程的影響。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，與對(duì)照相比，過(guò)表達(dá)ESCCAL-1可導(dǎo)致KYSE150表達(dá)ESCCAL-1的G0/G1期減少，G2/M期增加(圖3A)，而ESCCAL1基因的敲低則導(dǎo)致相反的結(jié)果(圖3B-D)。由于CCND1復(fù)合物和cyclin依賴性激酶抑制劑 CDKN1A和CDKN1B是控制細(xì)胞周期進(jìn)展的關(guān)鍵調(diào)控因子，我們隨后檢測(cè)了它們?cè)?/span>ESCC細(xì)胞中的蛋白水平。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，ESCCAL-1的高表達(dá)使CDK4和CCND1的蛋白質(zhì)水平上調(diào)了2倍以上（圖3E），而ESCCAL-1的敲除使其蛋白質(zhì)水平降低了70%（圖3F，G）。有趣的是，ESCCAL-1的過(guò)表達(dá)使CDKN1A的蛋白質(zhì)水平降低了約40%，但沒(méi)有降低CDKN1B（圖3E），而ESCCAL-1的敲除使CDKN1A的蛋白質(zhì)水平顯著增加了至少2.5倍（圖3F，G）。這些結(jié)果表明CDK4、CCND1和CDKN1A有助于ESCCAL-1介導(dǎo)的ESCC細(xì)胞周期進(jìn)程。

4）LncRNA ESCCAL-1直接與Gal-1蛋白結(jié)合并積極調(diào)節(jié)其蛋白水平

通過(guò)在線工具RNAfold分析了MFE模式和質(zhì)心模式下ESCCAL-1轉(zhuǎn)錄本的二級(jí)結(jié)構(gòu)，二者均預(yù)測(cè)了Y形結(jié)構(gòu)（圖4A），表明ESCCAL-1具有蛋白質(zhì)結(jié)合潛力。事實(shí)上，我們通過(guò)RNA蛋白質(zhì)下拉分析和質(zhì)譜分析確定了一組可能與ESCCAL-1發(fā)生物理相互作用的蛋白質(zhì)。然后，我們選擇覆蓋可靠性最高的前3位ESCCAL-1結(jié)合蛋白HSP10、Gal-1和H2B進(jìn)行RIP驗(yàn)證。Gal-1被確認(rèn)為lncRNA-ESCCAL-1結(jié)合的底物蛋白，如圖4B，C所示。為了研究Gal-1的表達(dá)模式，我們通過(guò)qRT PCR檢測(cè)了收集的41對(duì)新鮮ESCC手術(shù)標(biāo)本中的Gal-1轉(zhuǎn)錄，我們觀察到腫瘤組織和正常組織中Gal-1的mRNA水平?jīng)]有顯著差異（圖4D）。此外，在41例ESCC標(biāo)本中，Gal-1的mRNA水平和ESCCAL-1的轉(zhuǎn)錄水平之間沒(méi)有顯著相關(guān)性（圖4E）。然而，與正常組織相比，15例ESCC腫瘤組織中有12例的Gal-1蛋白水平明顯上調(diào)（圖4F）。在15例ESCC腫瘤組織中，Gal-1的蛋白水平與ESCCAL1的轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)（圖4G）。 此外，我們還發(fā)現(xiàn)在ESCC細(xì)胞系中Gal-1的蛋白水平上調(diào)，并與ESCCAL-1的表達(dá)呈正相關(guān)(圖4H, I)。此外，ESCCAL-1的過(guò)表達(dá)增加了ESCC細(xì)胞中Gal-1的蛋白水平，而ESCCAL-1的敲除降低了Gal1的蛋白水平（圖4J）。這些結(jié)果表明，lncRNA-ESCCAL-1直接與Gal-1蛋白結(jié)合并積極調(diào)節(jié)其蛋白水平，Gal-1蛋白是ESCCAL-1的下游分子。

5）Gal-1是一種致癌蛋白，促進(jìn)ESCC細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)展

為了研究Gal-1在ESCC細(xì)胞增殖中的生物學(xué)作用，我們進(jìn)行了CCK-8實(shí)驗(yàn)和EdU染色。基于慢病毒重組載體的Gal-1過(guò)表達(dá)（OE-Gal-1）和敲除的效率通過(guò)western blot測(cè)定（圖5A）。CCK-8試驗(yàn)和EdU染色結(jié)果均顯示，Gal-1的過(guò)表達(dá)增加了KYSE150的細(xì)胞增殖（圖5B，E），而Gal-1的敲除降低了KYSE450和EC9706的增殖能力（圖5C，D，F，G）。隨后，我們檢測(cè)了Gal-1異位表達(dá)對(duì)ESCC細(xì)胞周期進(jìn)程的影響。流式細(xì)胞術(shù)分析表明，Gal-1的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致G0/G1期顯著減少（圖5H），而Gal-1的敲除增加了ESCC細(xì)胞周期的G0/G1期（圖5I，J）。此外，western blot顯示，與對(duì)照組相比，Gal-1的高表達(dá)使CDK4和CCND1的蛋白質(zhì)水平上調(diào)至少2倍（圖5K），而Gal-1的敲除使其蛋白質(zhì)水平下調(diào)高達(dá)60%（圖5K）。Gal-1的過(guò)表達(dá)降低了CDKN1A的蛋白水平（圖5K），總的來(lái)說(shuō)，Gal-1促進(jìn)ESCC細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)展。

6）ESCCAL-1通過(guò)Gal-1促進(jìn)ESCC細(xì)胞周期進(jìn)程

考慮到ESCCAL-1直接與Gal-1蛋白結(jié)合，并且它們?cè)谡{(diào)節(jié)ESCC細(xì)胞增殖和周期方面具有相似的生物學(xué)功能，我們假設(shè)ESCCAL-1通過(guò)與Gal-1的相互作用在ESCC中發(fā)揮致癌作用。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們進(jìn)行了拯救實(shí)驗(yàn)，并使用CCK-8試驗(yàn)和EdU染色測(cè)量了其生物學(xué)功能。Gal-1的缺失顯著損害了OE-ESCCAL-1誘導(dǎo)的ESCC中的高細(xì)胞增殖（圖6A，B）。同時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)和western blot分析顯示，ESCCAL-1過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子（CDK4、CCND1和CDKN1A）的影響至少部分被ESCC細(xì)胞中Gal-1的敲除所消除（圖6C，D）。為了探索Gal-1介導(dǎo)的可能信號(hào)通路，我們使用在線工具STRING預(yù)測(cè)Gal-1的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)。在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中，作為與Gal-1蛋白最密切相關(guān)的信號(hào)分子之一，NF-κB引起了我們的注意，因?yàn)橹暗脑S多研究已經(jīng)闡明，NF-κB信號(hào)的異常激活與腫瘤進(jìn)展有關(guān)，包括ESCC。Western blot顯示，ESCCAL-1的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致NF-κB的激活，當(dāng)Gal-1同時(shí)被敲除時(shí)，該信號(hào)顯著減少（圖6E）。這些結(jié)果表明，ESCCAL-1可能通過(guò)Gal-1依賴的NF-κB激活促進(jìn)ESCC細(xì)胞周期進(jìn)程。

7）ESCCAL-1以Gal-1介導(dǎo)的方式促進(jìn)ESCC腫瘤生長(zhǎng)

為了進(jìn)一步闡明ESCCAL-1-Gal-1相互作用在控制ESCC腫瘤發(fā)生中的作用，進(jìn)行了裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，來(lái)源于ESCCAL-1過(guò)表達(dá)細(xì)胞的腫瘤生長(zhǎng)速度更快，腫瘤大小更大，腫瘤重量更重（圖7A-C）。然而，Gal-1的缺失顯著削弱了ESCCAL-1過(guò)表達(dá)對(duì)ESCC腫瘤生長(zhǎng)的促進(jìn)作用（圖7A-C）。然后通過(guò)IHC染色檢測(cè)異種移植瘤中增殖標(biāo)記物Ki-67的水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ESCCAL-1過(guò)表達(dá)組中Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量顯著增加，這進(jìn)一步表明ESCCAL-1過(guò)表達(dá)促進(jìn)了ESCC細(xì)胞在體內(nèi)的增殖（圖7D）。但是，由ESCCAL-1過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞的增加明顯被Gal-1敲除所抵消（圖7D）。接下來(lái)，我們?cè)俅芜M(jìn)行了體內(nèi)拯救實(shí)驗(yàn)，以確認(rèn)ESCCAL-1/Gal-1軸在ESCC生長(zhǎng)中的作用。如圖7E所示，我們發(fā)現(xiàn)Gal-1的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了腫瘤生長(zhǎng)，而Gal-1的敲除抑制了體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)，進(jìn)一步表明Gal-1在ESCC中的致癌作用。此外，ESCCAL-1基因敲除可顯著減輕OE-Gal-1引起的腫瘤促進(jìn)作用，表明ESCCAL-1/Gal-1軸參與了ESCC的進(jìn)展?？傊@些數(shù)據(jù)表明ESCCAL-1以Gal-1依賴的方式促進(jìn)ESCC腫瘤生長(zhǎng)。

8）ESCCAL-1通過(guò)阻斷Smurf1介導(dǎo)的泛素化增強(qiáng)Gal-1蛋白的穩(wěn)定性

鑒于ESCCAL-1直接與Gal-1蛋白相互作用，并與Gal-1蛋白水平呈正相關(guān)，而不影響Gal-1 mRNA水平，我們打算探索ESCCAL-1介導(dǎo)的Gal-1蛋白在ESCC細(xì)胞中增加的潛在機(jī)制。首先，我們發(fā)現(xiàn)在KYSE450和EC9706細(xì)胞中，當(dāng)用CHX處理指定時(shí)間時(shí)，ESCCAL-1的敲除縮短了Gal-1蛋白的半衰期（圖8A，B）。此外，蛋白酶體抑制劑MG132（圖8C）至少部分消除了ESCCAL-1敲除誘導(dǎo)的Gal-1蛋白減少，這表明ESCCAL-1通過(guò)阻斷其泛素化介導(dǎo)的降解來(lái)保護(hù)Gal-1蛋白。進(jìn)一步IP結(jié)合western blot證實(shí)，在MG132存在的情況下，敲除ESCCAL-1可顯著促進(jìn)ESCC細(xì)胞中Gal-1的泛素化（圖8D），表明ESCCAL-1通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑（UPP）防止Gal-1蛋白降解，從而穩(wěn)定Gal-1蛋白。為了初步研究ESCCAL-1缺失通過(guò)UPP導(dǎo)致Gal-1降解的潛在機(jī)制，我們尋找可能介導(dǎo)Gal-1泛素化修飾的E3泛素連接酶。我們重點(diǎn)研究了兩種候選分子Smurf1和CUL4A，以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。進(jìn)一步IP結(jié)合western blot顯示，敲除ESCCAL-1可促進(jìn)Smurf1與Gal-1蛋白的結(jié)合（圖8E），這表明Gal-1蛋白是Smurf1的底物之一。此外，我們發(fā)現(xiàn)siRNA介導(dǎo)的Smurf1消融增加了ESCC細(xì)胞中Gal-1的蛋白水平（圖8F）。這些數(shù)據(jù)表明，ESCCAL-1通過(guò)阻斷Smurf1介導(dǎo)的泛素化來(lái)穩(wěn)定Gal-1蛋白（圖8G）。

結(jié)論：
   我們證明ESCCAL1的過(guò)表達(dá)通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子促進(jìn)ESCC的進(jìn)展。LncRNA ESCCAL-1與Gal-1蛋白發(fā)生物理相互作用，阻止E3泛素連接酶Smurf1和Gal-1蛋白復(fù)合物的形成，從而穩(wěn)定Gal-1蛋白。這種lncRNA與蛋白質(zhì)相互作用的新機(jī)制為ESCC提供了潛在的治療策略。

參考文獻(xiàn)：

Cui Y, Yan M, Wu W, Lv P, Wang J, Huo Y, Lou Y, Ma X, Chang J, Guan F, Cao W. ESCCAL-1 promotes cell-cycle progression by interacting with and stabilizing galectin-1 in esophageal squamous cell carcinoma. NPJ Precis Oncol. 2022 Mar 1;6(1):12. doi: 10.1038/s41698-022-00255-x.