宮頸癌(cervical cancer ,CC)是女性最常見的惡性腫瘤之一, PD-1及其配體PD-L1相互結(jié)合啟動(dòng)T細(xì)胞的程序性死亡,使腫瘤細(xì)胞獲得免疫逃逸。派姆單抗(pembrolizumab)是PD-1和PD-L1 抑制劑,已被批準(zhǔn)用于CC,但仍有大量患者表現(xiàn)出先天耐藥性。免疫檢查點(diǎn)抑制劑是免疫治療新方式,使用免疫檢查點(diǎn)抑制劑(immune checkpoint blockade ,ICB)聯(lián)合治療能克服耐藥性,提高治療效果。為了確定靶向哪些受體,并確定最佳的抗體組合,帶來(lái)更好地治療效果,作者對(duì)受體在免疫細(xì)胞和腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)亞群上表達(dá)進(jìn)行了研究。這篇文章2022年2月發(fā)表于《Journal for Immuno Therapy of Cancer》,IF=11.367。
本文技術(shù)路線:
主要結(jié)果:
1.對(duì)PD-1阻斷不敏感的CC患者表現(xiàn)出CD8+ til細(xì)胞CD96高表達(dá)
為建立抗PD-1治療模型,從14例手術(shù)切除的宮頸癌腫瘤組織中分離出單細(xì)胞懸液,并派姆單抗或免疫球蛋白作為對(duì)照處理腫瘤懸液24小時(shí)(Fig1A)。與對(duì)照組相比,派姆單抗治療后細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)和腫瘤細(xì)胞凋亡均有所增加,且增加1.5倍以上的標(biāo)本被認(rèn)為是敏感的。結(jié)果顯示,在14例標(biāo)本中有4例產(chǎn)生了有效的檢查點(diǎn)抑制(Fig1B)。4個(gè)敏感和10個(gè)耐藥的樣本檢查免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)情況,結(jié)果顯示不敏感的宮頸癌樣本的CD8+腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中Tim-3和CD96顯著升高(Fig1C)。從耐藥患者身上收集了原發(fā)手術(shù)腫瘤樣本,利用免疫熒光實(shí)驗(yàn)技術(shù),作者觀察到耐藥的CD8+腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中CD96廣泛表達(dá)(陽(yáng)性比率76.8%)(Fig1D)。為了確定CD96+ CD8+ T細(xì)胞豐度對(duì)宮頸癌的影響,通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)CD96+ CD8+ T與CD96- CD8+ T的比例越高,生存率越低(Fig 1E)。這些數(shù)據(jù)表明CD96+ CD8+ T細(xì)胞在CC腫瘤逃逸中起關(guān)鍵作用。
Fig1. CC患者CD8+ TIL上ir的表達(dá)與pembrolizumab應(yīng)答的關(guān)系
2. CD96在瘤內(nèi)CD8+ 細(xì)胞中上調(diào)并與PD-1共表達(dá)
接下來(lái),他們收集了15個(gè)瘤內(nèi)組織樣本(IT)、5個(gè)配對(duì)的PT(瘤外組織)和血液樣本,進(jìn)一步探索CD96在宮頸癌PD-1阻斷中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)血液中CD8+ T細(xì)胞中PD-1和CD96的表達(dá)極低。與瘤外樣本相比,瘤內(nèi)樣本CD8+ T細(xì)胞中CD96和PD-1的表達(dá)顯著升高(Fig 2A)。流式細(xì)胞圖顯示,在瘤內(nèi)和瘤周的組織中,表達(dá)CD96的CD8+ T細(xì)胞通常同時(shí)表達(dá)PD-1(Fig 2B)。對(duì)派姆單抗不敏感的患者中,同時(shí)表達(dá)PD-1和CD96的CD8+ TIL比僅表達(dá)CD96的CD8+ TIL更常見(Fig 2C)。雖然敏感患者CD8+腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞上CD96的表達(dá)低于不敏感患者,但CD96+ PD-1+ 細(xì)胞百分比是CD96- PD-1+細(xì)胞百分比的兩倍??偟膩?lái)說(shuō),來(lái)自CC患者的CD8+腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中CD96表達(dá)上調(diào),并且大多數(shù)CD8+ TIL共表達(dá)CD96和PD-1。
Fig2. CD96和PD-1在CD8+TIL上的共表達(dá)
3. CD96+ PD-1+ CD8+ TIL 表現(xiàn)出終末耗竭效應(yīng)表型
為了解CD96+ PD-1+ CD8+腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的分化狀態(tài),接下來(lái)了檢測(cè)癌組織中CD45RA和CCR7的表達(dá)。根據(jù)CD45RA和CCR7的表達(dá)水平,T細(xì)胞分為以下四類:初始T細(xì)胞、中樞記憶T細(xì)胞、效應(yīng)記憶T(Tem)細(xì)胞和終末分化效應(yīng)記憶T(TEMRA)細(xì)胞。結(jié)果顯示CD96+ PD-1+ CD8腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中TEMRA含量最高(Fig 3A)。耗竭已成為癌癥患者T細(xì)胞功能障礙的公認(rèn)模式。他們進(jìn)一步研究了TIM-3和PD-1在耗竭CD8+ TIL上的表達(dá)模式。雙陰性的CD8+ TIL幾乎不表達(dá)Tim-3;CD96或PD-1陽(yáng)性的CD8+ TIL的Tim-3表達(dá)上調(diào);CD96+ PD-1+ CD8+ TIL的Tim-3+細(xì)胞比例最高,提示CD96和/或PD-1陽(yáng)性的CD8+ TIL具有耗竭的表型(Fig 3B)按CD96和PD-1劃分的CD8+ TIL亞組中eome陽(yáng)性細(xì)胞比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CD96 或 PD-1 單陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)出 TCF-1 的顯著上調(diào)。相反,雙陰性和雙陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)少量的TCF-1,表明CD96? PD-1+ CD8+ TIL表現(xiàn)出干細(xì)胞樣的前體耗竭T細(xì)胞特征(Fig 3C)。此外,淋巴細(xì)胞脫顆粒標(biāo)記物在單陽(yáng)性和雙陽(yáng)性細(xì)胞上的表達(dá)顯著降低(Fig3D)。三種效應(yīng)細(xì)胞因子的細(xì)胞比例在雙陰性 CD8+ 腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞中高表達(dá),而IL-2+、IFN-γ+和TNF-α+細(xì)胞的百分比在CD96+和/或PD-1+ TIL中下降且相似(Fig 3E)。與雙陰性細(xì)胞相比,CD96+ PD-1? 和CD96? PD-1+ CD8+ TIL的細(xì)胞溶解蛋白GZMB和PrF1的表達(dá)降低(Fig3F)。而CD96+ PD-1+ CD8+ TIL的PRF1表達(dá)低于單個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞,而GZMB表達(dá)顯著高于單個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞。這些結(jié)果表明,CD96 PD-1雙陽(yáng)性的CD8+ TIL具有內(nèi)在的終末耗竭效應(yīng)表型。而CD96? PD-1+ CD8+ TIL具有更多的前體衰竭樣表型。
Fig3. CD96+ PD-1+ CD8+ TIL上的記憶、轉(zhuǎn)錄和功能分子的表征。
4. CD96阻斷增強(qiáng)PD-1阻斷體外釋放CD8+TIL功能
接下來(lái),他們通過(guò)檢測(cè)CD8+ TIL的增殖、細(xì)胞因子的產(chǎn)生和脫顆粒來(lái)評(píng)估CD96阻斷是否促進(jìn)了CD8+ TIL的抗腫瘤反應(yīng)。與單一阻斷組相比,雙重阻斷組的IFN-γ+ CD8+ TIL數(shù)量顯著增加(Fig 4B)。同樣,雙重阻斷促進(jìn)CD8+ 腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞的增殖,Ki67+ 細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組和單一阻斷組(Fig 4C)。PD-1和CD96聯(lián)合阻斷導(dǎo)致的細(xì)胞毒性標(biāo)志物(CD107a、GZMB和PRF1)明顯高于單獨(dú)阻斷(Fig 4D)。在PD-1和CD96阻斷的24小時(shí)之后評(píng)估PD-1和CD96的表達(dá)。CD96阻斷對(duì)CD8+ TIL中PD-1的表達(dá)無(wú)影響,提示靶向CD96后受體未受調(diào)節(jié)(Fig 4E)。相反,他們觀察到在PD-1阻斷后,大多數(shù)受試患者的CD8+ TIL中CD96表達(dá)明顯上調(diào)。這些結(jié)果可能表明在阻斷PD-1期間CD8+ TIL具有了PD-1抵抗的表型,并為PD-1和CD96聯(lián)合阻斷提供了理論依據(jù)。
Fig4. PD-1和CD96體外阻斷治療后CD8+TIL功能恢復(fù)
5. CC患者CD226/CD96/TIGIT信號(hào)通路平衡被打破
CD226、CD96和TIGIT共同形成了一個(gè)形成免疫應(yīng)答的途徑,其中CD96和TIGIT傳遞抑制信號(hào),而CD226傳遞激活信號(hào)。作者推測(cè)這兩條信號(hào)通路在宮頸癌患者中免疫平衡可能被破壞,從而達(dá)到只激活或抑制的作用。
首先分析三個(gè)因子在宮頸癌患者血液、腫瘤組織和瘤旁樣本的CD8+ T細(xì)胞中的表達(dá)。在腫瘤中,CD96+和TIGIT+亞群的比例顯著增加,而在CD8+ TILs中CD226+細(xì)胞亞群顯著減少。表明CD226+ CD8+ T細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境的影響下可能向CD96+和TIGIT+ CD8+ T細(xì)胞轉(zhuǎn)變(Fig 5A)。接下來(lái),他們?cè)u(píng)估了CD155的表達(dá)。在血液中,樹突細(xì)胞和單核細(xì)胞中CD155細(xì)胞高表達(dá)。 瘤周細(xì)胞中CD155+細(xì)胞的比例較低,而腫瘤細(xì)胞中CD155+細(xì)胞的比例顯著升高(Fig 5B)。 免疫組織化學(xué)和免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)CD155在瘤內(nèi)組織中廣泛表達(dá),而在瘤周組織中低表達(dá)。在對(duì)αPD-1敏感和不敏感的腫瘤標(biāo)本中比較顯示,CD155表達(dá)在各組之間沒(méi)有差異(Fig5 C、E和F)??傊麄兊陌l(fā)現(xiàn)顯示CD8+ 腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞中,CD226/CD96/TIGIT信號(hào)通路的不平衡可能導(dǎo)致CD96在宮頸癌中發(fā)揮負(fù)免疫調(diào)節(jié)作用。
Fig5. CC患者CD226/CD96/TIGIT信號(hào)失衡
6.CD96阻斷增強(qiáng)PD-1阻斷聯(lián)合治療的治療活性
接下來(lái),作者以C57BL/6小鼠為模型,探討CD96阻斷對(duì)體內(nèi)腫瘤進(jìn)展的影響(Fig 6A)。發(fā)現(xiàn)每周注射兩次CD96或αPD-1顯著延緩腫瘤生長(zhǎng)并延長(zhǎng)荷瘤小鼠的存活。此外,與單一阻斷相比,聯(lián)合治療效果更佳(Fig6 BC)。免疫組化證實(shí)了αCD96或αPD-1具有顯著的抑瘤活性且當(dāng)聯(lián)合治療時(shí)具有較好的協(xié)同作用(Fig 6D)。在小鼠模型中,我們觀察到PD-1抑制劑治療的小鼠CD8+腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中CD96表達(dá)顯著上調(diào),但CD96阻滯劑或兩種阻滯劑聯(lián)合治療的小鼠未見明顯上調(diào)。此外,單獨(dú)阻斷PD-1和CD96不影響CD8+腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中PD-1的水平,但雙重阻斷顯著下調(diào)PD-1的表達(dá)。這些結(jié)果支持PD-1的臨床靶向與CD96阻斷具有協(xié)同效應(yīng)(Fig 6E)。接下來(lái)在小鼠中研究了CD96和PD-1阻斷對(duì)CD8+ 腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞功能的影響。分析了產(chǎn)生效應(yīng)細(xì)胞因子或細(xì)胞溶解蛋白的CD8+ TIL的百分比。與體外模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,單獨(dú)阻斷后CD107a和PRF1的表達(dá)較對(duì)照組增加,雙阻斷治療進(jìn)一步增強(qiáng)刺激效應(yīng)。?INF-γ、GZMB和TNF-α在雙阻斷治療后有升高的趨勢(shì),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig 6F)。
Fig6. CD96和PD-1聯(lián)合阻斷可促進(jìn)TC-1荷瘤C57BL/6小鼠的抗腫瘤免疫
對(duì)PD-1阻斷不敏感的CC患者常表現(xiàn)為CD96表達(dá)增加。在瘤內(nèi)CD8+ T細(xì)胞中CD96和PD-1大部分存在共表達(dá)。表型分析顯示, PD-1或CD96單陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)前體耗竭樣表型,而PD-1和CD96共表達(dá)的CD8+TIL多表現(xiàn)為終末耗竭的效應(yīng)表型。此外,CD8+ T細(xì)胞中CD96/TIGIT/CD226信號(hào)通路破壞。表明CD96在CD8+ T細(xì)胞功能和PD-1抵抗中起免疫調(diào)節(jié)作用。在臨床模型中,CD96通過(guò)增強(qiáng)抗腫瘤CD8+ TIL功能來(lái)增強(qiáng)PD-1的阻斷作用,為宮頸癌的治療提供了理論基礎(chǔ)。
參考文獻(xiàn):
Wang, Y., et al., Targeting CD96 overcomes PD-1 blockade resistance by enhancing CD8+ TIL function in cervical cancer. J Immunother Cancer, 2022. 10(3).