與正常細(xì)胞相比,癌細(xì)胞表現(xiàn)出更高水平的氧化應(yīng)激,這種更高水平的氧化應(yīng)激也可以被利用來殺死腫瘤細(xì)胞,而使正常細(xì)胞完好無損。有研究發(fā)現(xiàn)Isovalerylspiramycin I (ISP I),一種新型大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,通過靶向核仁蛋白硒蛋白H (SELH),從而抑制癌細(xì)胞生長和腫瘤轉(zhuǎn)移。該研究于2022年4月發(fā)表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》,IF:11.161。
技術(shù)路線:
主要研究結(jié)果:
1. Carrimycin(卡霉素)的結(jié)構(gòu)與合成
卡霉素,主要由4 -O- (ISP) I、II、III和微量的4 -O-?;菪顾爻煞纸M成(圖1A)。對產(chǎn)生卡里霉素的菌株進(jìn)行基因組測序,發(fā)現(xiàn)了一個大約90 kb的生物合成基因簇 (圖1B)。經(jīng)過糖基化、氧化、?;彤愇旎?/span>post-PKS修飾步驟后,ISP I、II和III的結(jié)果呈多相混合,差異僅在于碳3上羥基的?;〈?/span>(圖1C)。
圖1卡霉素生物合成基因簇的遺傳結(jié)構(gòu)及ISP I生物合成的主要步驟
2. ISP I抑制腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移
為了評估潛在的細(xì)胞毒性,用卡霉素主要成分ISP I、II和III治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株,并評估細(xì)胞活力:50%抑制濃度(IC50)值顯示ISP I最有效,同時膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、腎細(xì)胞癌(RCC)和腦膜瘤在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞株對ISP的細(xì)胞毒性效應(yīng)敏感(圖2A和B)。流式分析顯示,ISP I引起細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)劑量依賴性凋亡(圖2C和D)。進(jìn)一步用研究ISP I在體內(nèi)的腫瘤抑制作用(圖2E)。與對照組相比,使用ISP I的小鼠腫瘤生長顯著降低(圖2F和G)。另外,研究兩種不同的、同基因的小鼠肺轉(zhuǎn)移模型:黑色素瘤(B16)和乳腺癌(4T1)。C57BL/6小鼠靜脈注射B16細(xì)胞,隨機(jī)分為ISP處理組和鹽水處理組(對照組)(圖2H)。在兩種肺轉(zhuǎn)移模型中,ISP I顯著降低了肺腫瘤負(fù)荷。ISP I治療12天后,與鹽水治療的小鼠相比,B16小鼠肺轉(zhuǎn)移的數(shù)量顯著減少(圖2I和J)。總的來說,這些發(fā)現(xiàn)表明,ISP I在體外抑制腫瘤生長。
圖2 ISP I抑制腫瘤生長,減少肺轉(zhuǎn)移
3.ISP I以SELH為靶點(diǎn)
首先,在LN229細(xì)胞中進(jìn)行了藥物親和反應(yīng)靶穩(wěn)定性(DARTS)檢測(圖3A顯示了檢測策略)。質(zhì)譜分析顯示SELH是ISP處理LN229細(xì)胞中最豐富的主要蛋白之一(補(bǔ)充表2)。通過熱穩(wěn)定性分析,發(fā)現(xiàn)ISP I在一系列升高的溫度下保護(hù)了SELH(圖3B),這表明ISP I以SELH為靶點(diǎn)。為了驗(yàn)證ISP I靶向SELH的特異性,設(shè)計了一種表面等離子體共振(SPR)方法來評估ISP I與細(xì)菌中合成的過氧化物酶的相互作用,包括SELH、硫氧還蛋白(TrxA)、過氧化氫酶(KatA)和硫醇過氧化物酶(TpX)。ISP I與SELH緊密結(jié)合,但不與其他過氧化物酶結(jié)合(圖3C)。ISP I在多種腫瘤細(xì)胞株中以劑量依賴的方式降低了SELH蛋白的表達(dá)(圖3D和E)。環(huán)己酰亞胺(CHX)追蹤實(shí)驗(yàn)證實(shí),ISP I處理降低了SELH蛋白的半衰期,這表明ISP I促進(jìn)了SELH蛋白的降解(圖3F和G)。總的來說,這些結(jié)果表明,ISP I靶向SELH并促進(jìn)SELH蛋白降解。
為了證實(shí)ISP I通過SELH依賴機(jī)制抑制細(xì)胞生長,用CRISPR-Cas9生成了SELH缺失的LN229和RCC細(xì)胞株(分別為786-O和RCC4)。與野生型細(xì)胞相比,SELH缺陷細(xì)胞能抵抗ISP I處理(圖3H)。使用選擇性siRNA敲除,SELH抑制顯著降低了細(xì)胞生長速率,延緩了細(xì)胞增殖,增加了細(xì)胞凋亡(圖3I-K)。為了評估SELH是否在體內(nèi)調(diào)節(jié)腫瘤生長,將野生型或SELH缺失的LN229細(xì)胞原位注射給NSG小鼠:結(jié)果發(fā)現(xiàn)SELH-deficient小鼠總生存期增加了近兩倍(SELH-deficient LN229組:野生型LN229組=51天:28天,圖3L)。C57BL/6小鼠注射野生型B16細(xì)胞或SELH缺陷B16細(xì)胞(圖3M - O)。尾靜脈接種12天后,與注射野生型B16細(xì)胞的小鼠相比,SELH缺陷B16細(xì)胞的小鼠患肺腫瘤的幾率顯著降低(圖3N-O)。因此,ISP I通過抑制SELH抑制原發(fā)和轉(zhuǎn)移性腫瘤的生長。
圖3 ISP I以SELH為目標(biāo)
4. ISP I破壞細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)
由于硒蛋白可以保護(hù)機(jī)體免受活性氧的侵害,因此研究ISP I是否改變了體外氧化還原穩(wěn)態(tài)。首先,評估ISP對谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響:ISP I處理的LN229細(xì)胞谷胱甘肽過氧化物酶活性顯著降低(圖4A)。ROS-Glo H2O2檢測證實(shí),ISP處理過的腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高(圖4B)。MitoSOX染色,然后流式細(xì)胞儀檢測,顯示ISP I處理后的細(xì)胞內(nèi)ROS升高,且呈劑量依賴性(圖4C和D)。
下一步評估ISP I是否改變抗氧化下游信號通路。經(jīng)ISP I處理的LN229細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組分析和GSEA均顯示氧化途徑的廣泛改變以及核因子紅系2相關(guān)因子2 (NFE2L2/NRF2)的特異性上調(diào)(圖4E和F)。在ISP I處理的細(xì)胞中,NFE2L2的表達(dá)顯著上調(diào);ISP I誘導(dǎo)NFE2L2信號通路下游靶蛋白HMOX1和NQO1的增加(圖4G和H)。過表達(dá)SELH降低了NFE2L2蛋白水平,而在SELH沉默的細(xì)胞中NFE2L2蛋白水平升高(圖4I)。NFE2L2 mRNA在SELH沉默的U251細(xì)胞中略有增加(圖4J)。SELH沉默的細(xì)胞HMOX1 mRNA顯著增加,與NFE2L2蛋白的增加一致(圖4K)。通過抑制SELH, ISP I誘導(dǎo)ROS積累并激活抗氧化信號通路,包括NFE2L2通路。
圖4 ISP I觸發(fā)ROS積累和氧化應(yīng)激反應(yīng)通路
5. ISP I觸發(fā)DNA損傷和R-環(huán)的形成
由于細(xì)胞內(nèi)ROS水平的增加導(dǎo)致氧化性DNA損傷,從而誘導(dǎo)基因組不穩(wěn)定性并抑制細(xì)胞周期進(jìn)展,因此評估ISP I治療是否增強(qiáng)了癌細(xì)胞的DNA損傷。免疫熒光染色和western blot分析顯示,ISP I處理的細(xì)胞顯示出較高數(shù)量的γH2AX,這是DNA損傷的敏感標(biāo)記(圖5A和B)。ISP I處理的細(xì)胞以劑量依賴性的方式顯示R-loop積累增加(圖5C和D)。ISP I以劑量依賴性的方式減少EdU摻入DNA(圖5C和I)。γH2AX和EdU顯示,ISP I處理不僅持續(xù)增加DNA損傷和減少DNA復(fù)制,而且改變R-環(huán)定位(圖5C, E-J)。在ISP I處理的U251細(xì)胞中,R-環(huán)病灶集中在核漿而不是核仁(圖5C)。R-環(huán)位點(diǎn)特異性地定位于DNA損傷位點(diǎn),而不是DNA復(fù)制位點(diǎn)(圖5G和J)。此外,在ISP i處理的U251細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了核仁離域,這是核仁應(yīng)激的證據(jù)(圖5C)。 總的來說,ISP I顯著增加細(xì)胞內(nèi)ROS水平,降低DNA復(fù)制,導(dǎo)致DNA損傷和R-環(huán)的形成。
圖5 ISP I觸發(fā)DNA損傷和R環(huán)形成,并改變R環(huán)的定位
6. ISP I通過JNK2/TIF-IA通路抑制核仁rRNA轉(zhuǎn)錄
免疫熒光成像顯示,ISP I處理的LN229細(xì)胞核仁蛋白分散度增加,核仁內(nèi)SELH表達(dá)顯著降低(圖6A)。ISP I處理LN229細(xì)胞后,NPM1蛋白水平下降,p53(凋亡標(biāo)志物)升高,且呈劑量依賴性(圖6B)。GSEA分析證實(shí)了p53通路的誘導(dǎo)(圖6C和D)。為了評估核糖體生物發(fā)生的改變并探索與核仁功能障礙的潛在聯(lián)系,接著分析了pre-rRNA轉(zhuǎn)錄:ISP I以劑量依賴的方式減少pre-rRNA(POLI轉(zhuǎn)錄本)(圖6E)。ISP I以劑量依賴的方式增加JNK2磷酸化,表明細(xì)胞ros誘導(dǎo)的JNK2激活升高(圖6F)。雖然ISP I處理導(dǎo)致了POLI和TIF-IA表達(dá)的輕微下降趨勢,但免疫共沉淀分析顯示,在ISP I處理或SELH缺失的LN229細(xì)胞中,TIF-IA和POLI之間的生理相互作用被顯著破壞(圖6G):提示激活的JNK2在SELH缺失細(xì)胞中主要削弱了TIFI-IA和POLI的相互作用。CHIP分析顯示,在ISP I處理或SELH缺陷的LN229細(xì)胞中,POLI補(bǔ)充到啟動子和rDNA編碼區(qū)的量減少(圖6H)。這表明,ISP I通過激活ROS/JNK2/TIF-IA通路,抑制了SELH受損的POLI-rDNA相互作用。這些發(fā)現(xiàn)表明,ISP I通過抑制POLI轉(zhuǎn)錄而破壞了核糖體的生物發(fā)生,但并不改變成熟的RNA機(jī)制。
圖6 ISP I誘導(dǎo)核仁應(yīng)激反應(yīng)
結(jié)論:
一種新型的重組大環(huán)內(nèi)酯類抗生素通過抑制特定蛋白質(zhì)SELH在核仁中發(fā)揮有效的抗癌作用。這會破壞RNA聚合酶I,導(dǎo)致輕微但災(zāi)難性的DNA損傷,并導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯和腫瘤細(xì)胞凋亡,從而造成癌細(xì)胞的脆弱性。ISP I對小鼠正常組織的有害影響最小,專門針對SELH。通過利用SELH抑制作用,ISP I揭示了腫瘤細(xì)胞中一種獨(dú)特的脆弱性。通過利用SELH抑制,將ROS穩(wěn)態(tài)的紊亂與核糖體合成功能障礙聯(lián)系起來,ISP I揭示了腫瘤細(xì)胞特有的脆弱性。因此,核仁和SELH是有希望的癌癥治療靶點(diǎn)。
參考文獻(xiàn):
Cui J, Zhou J, He W, et al. Targeting selenoprotein H in the nucleolus suppresses tumors and metastases by Isovalerylspiramycin I. J Exp Clin Cancer Res. 2022; 41(1):126. doi: 10.1186/s13046-022-02350-0.