異戊基螺旋霉素I在核仁中靶向硒蛋白H進而抑制腫瘤和轉(zhuǎn)移
與正常細(xì)胞相比，癌細(xì)胞表現(xiàn)出更高水平的氧化應(yīng)激，這種更高水平的氧化應(yīng)激也可以被利用來殺死腫瘤細(xì)胞，而使正常細(xì)胞完好無損。有研究發(fā)現(xiàn)Isovalerylspiramycin I (ISP I)，一種新型大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，通過靶向核仁蛋白硒蛋白H (SELH)，從而抑制癌細(xì)胞生長和腫瘤轉(zhuǎn)移。該研究于2022年4月發(fā)表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》，IF：11.161。
技術(shù)路線：
主要研究結(jié)果：
1. Carrimycin（卡霉素）的結(jié)構(gòu)與合成
卡霉素，主要由4 -O- (ISP) I、II、III和微量的4 -O-?；菪顾爻煞纸M成(圖1A)。對產(chǎn)生卡里霉素的菌株進行基因組測序，發(fā)現(xiàn)了一個大約90 kb的生物合成基因簇 (圖1B)。經(jīng)過糖基化、氧化、?；彤愇旎?/span>post-PKS修飾步驟后，ISP I、II和III的結(jié)果呈多相混合，差異僅在于碳3上羥基的?；〈?/span>(圖1C)。
圖1卡霉素生物合成基因簇的遺傳結(jié)構(gòu)及ISP I生物合成的主要步驟
2. ISP I抑制腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移
為了評估潛在的細(xì)胞毒性，用卡霉素主要成分ISP I、II和III治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株，并評估細(xì)胞活力：50%抑制濃度(IC50)值顯示ISP I最有效，同時膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、腎細(xì)胞癌(RCC)和腦膜瘤在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞株對ISP的細(xì)胞毒性效應(yīng)敏感(圖2A和B)。流式分析顯示，ISP I引起細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)劑量依賴性凋亡(圖2C和D)。進一步用研究ISP I在體內(nèi)的腫瘤抑制作用(圖2E)。與對照組相比，使用ISP I的小鼠腫瘤生長顯著降低(圖2F和G)。另外，研究兩種不同的、同基因的小鼠肺轉(zhuǎn)移模型：黑色素瘤(B16)和乳腺癌(4T1)。C57BL/6小鼠靜脈注射B16細(xì)胞，隨機分為ISP處理組和鹽水處理組(對照組)(圖2H)。在兩種肺轉(zhuǎn)移模型中，ISP I顯著降低了肺腫瘤負(fù)荷。ISP I治療12天后，與鹽水治療的小鼠相比，B16小鼠肺轉(zhuǎn)移的數(shù)量顯著減少(圖2I和J)?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)表明，ISP I在體外抑制腫瘤生長。
圖2 ISP I抑制腫瘤生長，減少肺轉(zhuǎn)移
3.ISP I以SELH為靶點
首先，在LN229細(xì)胞中進行了藥物親和反應(yīng)靶穩(wěn)定性(DARTS)檢測(圖3A顯示了檢測策略)。質(zhì)譜分析顯示SELH是ISP處理LN229細(xì)胞中最豐富的主要蛋白之一(補充表2)。通過熱穩(wěn)定性分析，發(fā)現(xiàn)ISP I在一系列升高的溫度下保護了SELH(圖3B)，這表明ISP I以SELH為靶點。為了驗證ISP I靶向SELH的特異性，設(shè)計了一種表面等離子體共振(SPR)方法來評估ISP I與細(xì)菌中合成的過氧化物酶的相互作用，包括SELH、硫氧還蛋白(TrxA)、過氧化氫酶(KatA)和硫醇過氧化物酶(TpX)。ISP I與SELH緊密結(jié)合，但不與其他過氧化物酶結(jié)合(圖3C)。ISP I在多種腫瘤細(xì)胞株中以劑量依賴的方式降低了SELH蛋白的表達(圖3D和E)。環(huán)己酰亞胺(CHX)追蹤實驗證實，ISP I處理降低了SELH蛋白的半衰期，這表明ISP I促進了SELH蛋白的降解(圖3F和G)。總的來說，這些結(jié)果表明，ISP I靶向SELH并促進SELH蛋白降解。
為了證實ISP I通過SELH依賴機制抑制細(xì)胞生長，用CRISPR-Cas9生成了SELH缺失的LN229和RCC細(xì)胞株(分別為786-O和RCC4)。與野生型細(xì)胞相比，SELH缺陷細(xì)胞能抵抗ISP I處理(圖3H)。使用選擇性siRNA敲除，SELH抑制顯著降低了細(xì)胞生長速率，延緩了細(xì)胞增殖，增加了細(xì)胞凋亡(圖3I-K)。為了評估SELH是否在體內(nèi)調(diào)節(jié)腫瘤生長，將野生型或SELH缺失的LN229細(xì)胞原位注射給NSG小鼠：結(jié)果發(fā)現(xiàn)SELH-deficient小鼠總生存期增加了近兩倍(SELH-deficient LN229組：野生型LN229組=51天：28天，圖3L)。C57BL/6小鼠注射野生型B16細(xì)胞或SELH缺陷B16細(xì)胞(圖3M - O)。尾靜脈接種12天后，與注射野生型B16細(xì)胞的小鼠相比，SELH缺陷B16細(xì)胞的小鼠患肺腫瘤的幾率顯著降低(圖3N-O)。因此，ISP I通過抑制SELH抑制原發(fā)和轉(zhuǎn)移性腫瘤的生長。
圖3 ISP I以SELH為目標(biāo)
4. ISP I破壞細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)
由于硒蛋白可以保護機體免受活性氧的侵害，因此研究ISP I是否改變了體外氧化還原穩(wěn)態(tài)。首先，評估ISP對谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響：ISP I處理的LN229細(xì)胞谷胱甘肽過氧化物酶活性顯著降低(圖4A)。ROS-Glo H2O2檢測證實，ISP處理過的腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高(圖4B)。MitoSOX染色，然后流式細(xì)胞儀檢測，顯示ISP I處理后的細(xì)胞內(nèi)ROS升高，且呈劑量依賴性(圖4C和D)。
下一步評估ISP I是否改變抗氧化下游信號通路。經(jīng)ISP I處理的LN229細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組分析和GSEA均顯示氧化途徑的廣泛改變以及核因子紅系2相關(guān)因子2 (NFE2L2/NRF2)的特異性上調(diào)(圖4E和F)。在ISP I處理的細(xì)胞中，NFE2L2的表達顯著上調(diào)；ISP I誘導(dǎo)NFE2L2信號通路下游靶蛋白HMOX1和NQO1的增加(圖4G和H)。過表達SELH降低了NFE2L2蛋白水平，而在SELH沉默的細(xì)胞中NFE2L2蛋白水平升高(圖4I)。NFE2L2 mRNA在SELH沉默的U251細(xì)胞中略有增加(圖4J)。SELH沉默的細(xì)胞HMOX1 mRNA顯著增加，與NFE2L2蛋白的增加一致(圖4K)。通過抑制SELH, ISP I誘導(dǎo)ROS積累并激活抗氧化信號通路，包括NFE2L2通路。
圖4 ISP I觸發(fā)ROS積累和氧化應(yīng)激反應(yīng)通路
5. ISP I觸發(fā)DNA損傷和R-環(huán)的形成
由于細(xì)胞內(nèi)ROS水平的增加導(dǎo)致氧化性DNA損傷，從而誘導(dǎo)基因組不穩(wěn)定性并抑制細(xì)胞周期進展，因此評估ISP I治療是否增強了癌細(xì)胞的DNA損傷。免疫熒光染色和western blot分析顯示，ISP I處理的細(xì)胞顯示出較高數(shù)量的γH2AX，這是DNA損傷的敏感標(biāo)記(圖5A和B)。ISP I處理的細(xì)胞以劑量依賴性的方式顯示R-loop積累增加(圖5C和D)。ISP I以劑量依賴性的方式減少EdU摻入DNA(圖5C和I)。γH2AX和EdU顯示，ISP I處理不僅持續(xù)增加DNA損傷和減少DNA復(fù)制，而且改變R-環(huán)定位(圖5C, E-J)。在ISP I處理的U251細(xì)胞中，R-環(huán)病灶集中在核漿而不是核仁(圖5C)。R-環(huán)位點特異性地定位于DNA損傷位點，而不是DNA復(fù)制位點(圖5G和J)。此外，在ISP i處理的U251細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了核仁離域，這是核仁應(yīng)激的證據(jù)(圖5C)。 總的來說，ISP I顯著增加細(xì)胞內(nèi)ROS水平，降低DNA復(fù)制，導(dǎo)致DNA損傷和R-環(huán)的形成。
圖5 ISP I觸發(fā)DNA損傷和R環(huán)形成，并改變R環(huán)的定位
6. ISP I通過JNK2/TIF-IA通路抑制核仁rRNA轉(zhuǎn)錄
免疫熒光成像顯示，ISP I處理的LN229細(xì)胞核仁蛋白分散度增加，核仁內(nèi)SELH表達顯著降低(圖6A)。ISP I處理LN229細(xì)胞后，NPM1蛋白水平下降，p53(凋亡標(biāo)志物)升高，且呈劑量依賴性(圖6B)。GSEA分析證實了p53通路的誘導(dǎo)(圖6C和D)。為了評估核糖體生物發(fā)生的改變并探索與核仁功能障礙的潛在聯(lián)系，接著分析了pre-rRNA轉(zhuǎn)錄：ISP I以劑量依賴的方式減少pre-rRNA（POLI轉(zhuǎn)錄本）（圖6E）。ISP I以劑量依賴的方式增加JNK2磷酸化，表明細(xì)胞ros誘導(dǎo)的JNK2激活升高(圖6F)。雖然ISP I處理導(dǎo)致了POLI和TIF-IA表達的輕微下降趨勢，但免疫共沉淀分析顯示，在ISP I處理或SELH缺失的LN229細(xì)胞中，TIF-IA和POLI之間的生理相互作用被顯著破壞(圖6G)：提示激活的JNK2在SELH缺失細(xì)胞中主要削弱了TIFI-IA和POLI的相互作用。CHIP分析顯示，在ISP I處理或SELH缺陷的LN229細(xì)胞中，POLI補充到啟動子和rDNA編碼區(qū)的量減少(圖6H)。這表明，ISP I通過激活ROS/JNK2/TIF-IA通路，抑制了SELH受損的POLI-rDNA相互作用。這些發(fā)現(xiàn)表明，ISP I通過抑制POLI轉(zhuǎn)錄而破壞了核糖體的生物發(fā)生，但并不改變成熟的RNA機制。
圖6 ISP I誘導(dǎo)核仁應(yīng)激反應(yīng)
結(jié)論：
一種新型的重組大環(huán)內(nèi)酯類抗生素通過抑制特定蛋白質(zhì)SELH在核仁中發(fā)揮有效的抗癌作用。這會破壞RNA聚合酶I，導(dǎo)致輕微但災(zāi)難性的DNA損傷，并導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯和腫瘤細(xì)胞凋亡，從而造成癌細(xì)胞的脆弱性。ISP I對小鼠正常組織的有害影響最小，專門針對SELH。通過利用SELH抑制作用，ISP I揭示了腫瘤細(xì)胞中一種獨特的脆弱性。通過利用SELH抑制，將ROS穩(wěn)態(tài)的紊亂與核糖體合成功能障礙聯(lián)系起來，ISP I揭示了腫瘤細(xì)胞特有的脆弱性。因此，核仁和SELH是有希望的癌癥治療靶點。
參考文獻：
Cui J, Zhou J, He W, et al. Targeting selenoprotein H in the nucleolus suppresses tumors and metastases by Isovalerylspiramycin I. J Exp Clin Cancer Res. 2022; 41(1):126. doi: 10.1186/s13046-022-02350-0.