在KEAP1缺失的肺癌中，靶向CoQ-FSP1軸驅(qū)動鐵死亡和輻射抗性

鐵死亡是脂質(zhì)過氧化引起的一種特殊的細(xì)胞死亡方式，在癌癥治療中，由于對特定癌癥遺傳背景下的鐵死亡機制的不完全理解而受到阻礙。KEAP1在肺癌中經(jīng)常發(fā)生突變或失活，而KEAP1突變型肺癌對包括放療在內(nèi)的大多數(shù)治療方法均有難治性。在本研究中，作者探討了鐵死亡抑制蛋白1 (FSP1，也被稱為AIFM2)在肺癌中的作用機制。本文于2022年4月發(fā)表于《Nature communications》, IF=12.121。

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本文主要內(nèi)容：

1 KEAP1缺乏的肺癌細(xì)胞對不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的鐵死亡有不同的影響

至少有3種不同類型的鐵死亡誘導(dǎo)劑，第一類誘導(dǎo)劑主要為erastin；第二類誘導(dǎo)劑為RSL3 和ML162，是通過抑制SLC7A11和GPX4RSL3引起鐵死亡；第三類誘導(dǎo)劑FIN56通過同時消耗GPX4蛋白和CoQ誘導(dǎo)鐵死亡(Fig. 1a)。在H1299細(xì)胞（KEAP1野生型肺癌細(xì)胞）中，KEAP1缺失顯著增加NRF2以及其的轉(zhuǎn)錄靶點SLC7A1138的水平(Fig 1b)，并使H1299細(xì)胞對erastin引起的鐵死亡產(chǎn)生抗性(Fig 1c)。此外，在H1299細(xì)胞中敲除KEAP1后，GPX4水平顯著降低(Fig 1b)。盡管GPX4在KEAP1缺失的H1299細(xì)胞中表達下降，但KEAP1缺失顯著促進了對RSL3或ML162的抗鐵死亡的能力(Fig 1d）。相比之下，在H1299細(xì)胞中KEAP1卻并不影響鐵死亡對FIN56的敏感性(Fig 1e，f)。脂質(zhì)過氧化是鐵死亡的一個標(biāo)志。KEAP1的缺乏減弱了由erastin、RSL3或ML162引起的脂質(zhì)過氧化，但對FIN56沒有影響。

在KEAP1缺失的H1299細(xì)胞中，GPX4水平的降低并不能解釋為什么這些細(xì)胞對RSL3具有耐藥性(抑制GPX4);另一方面，KEAP1缺失細(xì)胞中SLC7A11水平的增加可能是這些細(xì)胞對RSL3耐藥性增加的原因(Fig. 1b, d)。然而，作者發(fā)現(xiàn)在KEAP1敲除的H1299細(xì)胞中敲除SLC7A11對細(xì)胞中RSL3的鐵死亡敏感性沒有顯著影響(Fig. 1i, j)。使用ML162進行了類似的觀察（Fig 1k)，并通過脂質(zhì)過氧化測定進一步證實了這一觀察結(jié)果(Fig. 1l, m)，然而，在H1299細(xì)胞中敲低GPX4誘導(dǎo)了大量脂質(zhì)過氧化和鐵死亡，KEAP1敲低對應(yīng)著GPX4缺失，沒有表現(xiàn)出明顯的脂質(zhì)過氧化或者細(xì)胞死亡(Fig. 1n–q)。

Fig1 KEAP1在肺癌細(xì)胞中以不依賴SLC7A11/ gpx4的方式調(diào)控鐵死亡

2. 在KEAP1缺失的肺癌細(xì)胞中，FSP1是2類和3類鐵死亡誘導(dǎo)劑差異效應(yīng)的基礎(chǔ)

在KEAP1突變的肺腺癌中，發(fā)現(xiàn)12個過表達基因參與CoQ代謝過程，其中FSP1是上調(diào)最顯著的（Fig 2a）。KEAP1的缺失導(dǎo)致H1299和H23細(xì)胞中FSP1的表達增加（Fig 2b）。進一步表明，降低KEAP1敲除的H1299細(xì)胞中FSP1的表達(達到與對照細(xì)胞相似的水平)可使KEAP1缺失的細(xì)胞對RSL3或ML162重新敏感(Fig 2c–e)。在H1299和H23細(xì)胞中，KEAP1缺失誘導(dǎo)的對RSL3或ML162的抗性在iFSP1處理下基本消除(Fig. 2f, g)。在H1299細(xì)胞中，KEAP1的缺失降低了CoQ/CoQH2比值，而將KEAP1 KO細(xì)胞中的FSP1水平恢復(fù)到到對照組的水平，也可以恢復(fù)CoQ/CoQH2比值(Fig. 2h)。重要的是，在CoQ合成阻斷條件下，KEAP1缺陷誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞對RSL3或ML162的抗鐵死亡能力被大量消除(Fig. 2i–l)。總之，這些結(jié)果都表明KEAP1缺失可上調(diào)FSP1水平，并且在KEAP1缺陷的肺癌細(xì)胞中，CoQ-FSP1信號軸在介導(dǎo)鐵死亡對2類鐵死亡誘導(dǎo)劑的抵抗中發(fā)揮重要作用。

Fig2 KEAP1通過FSP1調(diào)控鐵死亡敏感性

3. KEAP1通過NRF2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控FSP1

NRF2通常與抗氧化反應(yīng)元素(AREs)結(jié)合在基因啟動子區(qū)域。進一步分析FSP1啟動子，發(fā)現(xiàn)在FSP1基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游1kb范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)了兩個AREs (Fig 3a)。Chip分析顯示，在A549細(xì)胞中，NRF2結(jié)合在兩個AREs上(Fig 3b, c)。同樣，在H1299細(xì)胞中將KEAP1刪除顯著增加了NRF2與這些AREs的結(jié)合(Fig 3d, e)。NRF2誘導(dǎo)劑叔丁基對苯二酚(TBHQ)的處理提高了NRF2和FSP1的水平(Fig. 3f)。相應(yīng)的，FSP1啟動子-熒光素酶活性顯著增強，這一活性可以通過任意一個ARE的突變而部分降低，而兩個AREs的突變則幾乎完全消除(Fig. 3g, h)。同樣，KEAP1的缺失增加了FSP1啟動子熒光素酶的活性，而這種增加被ARE突變所消除(Fig. 3i)。

作者進一步研究了NRF2與KEAP1調(diào)控FSP1和鐵死亡的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)在KEAP1敲低的細(xì)胞中，消除NRF2可以抑制KEAP1缺陷誘導(dǎo)的FSP1啟動子熒光素酶活性和FSP1的表達 (Fig. 3i, j）。重要的是，在KEAP1/NRF2雙敲除的細(xì)胞中FSP1的重新表達(與KEAP1 KO細(xì)胞中相似的水平)恢復(fù)了這些細(xì)胞中的鐵死亡抗性(Fig. 3k, l）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明FSP1是NRF2轉(zhuǎn)錄靶點，肺癌細(xì)胞中KEAP1缺失導(dǎo)致FSP1通過上調(diào)NRF2從而產(chǎn)生鐵死亡抗性。

Fig3 KEAP1通過nrf2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控FSP1

4. 在KEAP1缺乏的肺癌中，FSP1對腫瘤生長至關(guān)重要

通過TCGA數(shù)據(jù)分析，作者研究了FSP1與人類癌癥的潛在相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)FSP1在肺癌、腎透明細(xì)胞癌、腎乳頭狀細(xì)胞癌、腎癌、胃腺癌、肝癌終得表達量明顯高于正常人 (Fig. 4a)。此外，在LUAD、KIRC和卵巢癌中，F(xiàn)SP1的高表達與較短的患者生存期相關(guān) (Fig. 4b)。FSP1缺失顯著抑制KEAP1 敲低的小樹中腫瘤的生長(Fig. 4c, d)。在這些腫瘤樣本中，脂質(zhì)過氧化標(biāo)記物4-HNE顯示KEAP1缺失降低了脂質(zhì)過氧化標(biāo)記物4-HNE的表達，在KEAP1缺失的腫瘤中，這被FSP1的缺失所恢復(fù)(Fig. 4e, f)?？傊贖1299異種移植模型中，F(xiàn)SP1對于KEAP1失活誘導(dǎo)的腫瘤生長是必需的(但可能是不夠的)，此外，F(xiàn)SP1可能通過抑制脂質(zhì)過氧化和鐵死亡促進KEAP1缺失的肺腫瘤生長。

Fig4 FSP1在KEAP1缺陷癌中促進腫瘤發(fā)生

5. 抑制FSP1通過誘導(dǎo)鐵死亡使KEAP1缺陷的肺癌細(xì)胞對輻射敏感

作者發(fā)現(xiàn)，KEAP1的缺失顯著促進了H1299細(xì)胞的抗輻射能力，并進一步表明，NRF2的缺失使KEAP1敲除的細(xì)胞對放療重新敏感，而在KEAP1/NRF2雙敲除的細(xì)胞中重新表達FSP1可恢復(fù)這些細(xì)胞的抗輻射能力(Fig. 5a）。

KEAP1缺失顯著降低了放療誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化和鐵死亡標(biāo)記基因PTGS2的表達;這種衰減在KEAP1敲除的細(xì)胞中通過NRF2的缺失而被消除，然后在KEAP1/NRF2雙敲除的細(xì)胞中通過FSP1的重新表達得以恢復(fù)(Fig. 5b, c)。作者進一步研究了FSP1失活是否使KEAP1缺失或突變的肺癌細(xì)胞對鐵死亡誘導(dǎo)劑敏感。作者發(fā)現(xiàn)，從基因上耗盡FSP1可使KEAP1敲除的 H1299細(xì)胞對化療敏感（Fig. 5d），并將化療誘導(dǎo)的KEAP1 敲低的細(xì)胞中脂質(zhì)過氧化和PTGS2表達水平恢復(fù)到與對照細(xì)胞相似的水平(Fig. 5e, f)。同樣，iFSP1處理產(chǎn)生了強大的放射增敏效應(yīng)(Fig. 5g)，并促進了化療誘導(dǎo)的KEAP1缺乏的H1299細(xì)胞中脂質(zhì)過氧化(Fig. 5h)。在KEAP1突變型A549細(xì)胞中，FSP1的缺失也促進了放射增敏和rt誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化(Fig. 5i–k)。通過在幾個KEAP1突變的肺癌細(xì)胞系中使用iFSP1獲得了類似的結(jié)果(Fig. 5l–o).

Fig5 FSP1抑制通過誘導(dǎo)鐵死亡使KEAP1缺陷的肺癌細(xì)胞對輻射敏感

6. 在KEAP1缺乏或突變的肺癌細(xì)胞或腫瘤中，抑制CoQ合成可以克服放射抗性

上述數(shù)據(jù)表明，FSP1是一個重要的治療靶點，iFSP1是治療KEAP1突變型癌癥的一種放射增敏劑。然而，iFSP1不能用于體內(nèi)治療。由于FSP1與CoQ通過相同的途徑抑制亞鐵降解，作者進一步測試了抑制CoQ生物合成對KEAP1失活的肺癌細(xì)胞的放射敏感性是否有影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),4-CBA治療逆轉(zhuǎn)了KEAP1缺失引起的放射耐藥(Fig. 6a)，并在KEAP1 敲除 H1299細(xì)胞中恢復(fù)鐵死亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化(Fig. 6b)。4-CBA處理對KEAP1突變體A549和H460細(xì)胞具有類似的放射增敏作用(Fig. 6c, d)。這些結(jié)果進一步證實了在A549和H460細(xì)胞中COQ2的基因缺失(Fig  6e–g)。重要的是，4-CBA處理沒有發(fā)揮放射增敏作用，也沒有促進化療誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞(HBECs)的脂質(zhì)過氧化（Fig 6h, i);因此，與正常肺上皮細(xì)胞相比，4-CBA在KEAP1敲低的肺癌細(xì)胞中似乎具有更強的促亞鐵降解或放射增敏作用，提示4-CBA與化療聯(lián)合治療存在藥物治療窗。

在A549異種移植瘤模型中，4-CBA治療對腫瘤生長有中度抑制作用，4-CBA聯(lián)合RT治療對腫瘤生長有明顯抑制作用(Fig. 6j, k），與這些腫瘤樣本中4-HNE染色增加相關(guān)(Fig. 6l, m）。作者在具有KEAP1突變(TC494)的肺癌患者源性異種移植(PDXs)中進行了類似的觀察(Fig. 6n–q)?？偟膩碚f，研究表明可以通過使用4-CBA來克服KEAP1失活肺癌的放射耐藥。

Fig6抑制CoQ合成可逆轉(zhuǎn)KEAP1缺失或突變的肺癌細(xì)胞或腫瘤的放射耐藥

綜上所述，通過了解在KEAP1缺陷的肺癌細(xì)胞中不同類型的誘導(dǎo)劑引起的鐵死亡表型的機制，確定了CoQ-FSP1軸是一個關(guān)鍵的下游效應(yīng)因子。在KEAP1缺乏的肺癌中，CoQ-FSP1軸作為KEAP1- nrf2通路的關(guān)鍵下游效應(yīng)因子，介導(dǎo)ferroptosis和輻射抗性。作者進一步提出，利用CoQ-FSP1信號的藥理靶向可以克服KEAP1缺陷引起的放射耐藥，并治療KEAP1突變型肺癌。因此，作者的研究確定了一種治療這種致命疾病的潛在有效的治療策略。

參考文獻：

Koppula, P., et al., A targetable CoQ-FSP1 axis drives ferroptosis- and radiation-resistance in KEAP1 inactive lung cancers. Nat Commun, 2022. 13(1): p. 2206.