EZH2通過整合素β1-FAK激活TGFβ信號(hào)促進(jìn)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移

乳腺癌是全世界女性中最常見的癌癥。大約50-70%的乳腺癌晚期患者發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致骨骼相關(guān)事件，包括疼痛、病病性骨折、脊髓受壓、高鈣血癥和其他并發(fā)癥。在本研究中，作者探討了骨轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，可能為骨轉(zhuǎn)移患者提供額外的治療策略。本文于2022年5月發(fā)表于《Nature communications》, IF=12.121。

本文技術(shù)路線：

本文主要內(nèi)容：

1. EZH2促進(jìn)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移，EZH2甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑不能阻止這一過程

為了探討EZH2在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中的作用，作者構(gòu)建了EZH2敲除細(xì)胞系1566.shEZH2及其對(duì)照細(xì)胞系1566.shScr。與注射1566.shScr細(xì)胞的小鼠相比，注射1566.shEZH2的小鼠無(wú)骨轉(zhuǎn)移生存期和總生存期更長(zhǎng)(Fig. 1a)。 生物發(fā)光成像(BLI)、x射線成像和蘇木精和伊紅(H&E)染色均顯示出相同的結(jié)果(Fig. 1b)。

使用CRISPR/CAS9系統(tǒng)，生成了ezh2敲除的MDA-MB-231細(xì)胞亞克隆(231.KO)及其對(duì)照克隆 (231.sgCtrl)。其中的231.KO#1與野生型EZH2(231.KO# 1.EZH2) 或pLenti對(duì)照載體(231.KO#1.pLenti)中穩(wěn)定表達(dá)。231.KO# 1.EZH和231.KO#1.pLenti)分別注射到小鼠中，注射231.KO#1.EZH2的細(xì)胞用載體或GSK126處理，GSK126是一種有效的EZH2小分子甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，而對(duì)照組小鼠注射231.KO#1.pLenti治療。結(jié)果表明，231.KO#1.EZH2組無(wú)骨轉(zhuǎn)移生存率明顯低于231.KO#1.pLenti組(Fig. 1c, d)。出乎意料的是，gsk126處理的231.KO#1.EZH2組無(wú)轉(zhuǎn)移生存率與vehicle處理的231.KO#1.EZH2 組相似(Fig. 1c, d)。與對(duì)照組相比，注射1566.KO細(xì)胞的小鼠無(wú)轉(zhuǎn)移生存期和總生存期均顯著延長(zhǎng) (Fig. 1e,f)。對(duì)照細(xì)胞組小鼠在無(wú)骨轉(zhuǎn)移生存期、總生存期方面，與EPZ-6438組之間沒有顯著差異(Fig. 1e, f）。在體外實(shí)驗(yàn)中，高表達(dá)ezh2的細(xì)胞比低表達(dá)ezh2的細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移和侵襲能力(Fig. 1g）。與對(duì)照231.KO#1相比，野生型EZH2的重表達(dá)(231.KO#1. ezh2)顯著提高了細(xì)胞遷移和侵襲能力。此外，與注射231.KO#1.pLenti細(xì)胞的對(duì)照組相比，野生型EZH2的重表達(dá)(231.KO#1.EZH2)顯著增加細(xì)胞遷移和侵襲(Fig. 1h)。

Fig1 EZH2促進(jìn)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移，EZH2甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑不能阻止這一過程

2.  EZH2調(diào)節(jié)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的惡性循環(huán)

乳腺癌細(xì)胞與RAW264.7破骨前體細(xì)胞和MC3T3成骨細(xì)胞共培養(yǎng)(Fig. 2a)。共培養(yǎng)六天，與MDA-MB-231 和 231.sg對(duì)照細(xì)胞相比，sezh2基因敲除的231.KO # 1和231.KO#2細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯受到抑制(Fig. 2b)。與EZH2敲除的細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，與MDA-MB-231 和 231.sg對(duì)照細(xì)胞相比，成熟破骨細(xì)胞的前體破骨細(xì)胞RAW264.7明顯減少（Fig. 2c)。與231.KO#1相比，231. ko # 1.H689A細(xì)胞重新表達(dá)H689A促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞增殖和破骨細(xì)胞成熟(Fig. 2d, e)。靜脈注射231.KO#1.EZH2和231. ko # 1.H689A細(xì)胞轉(zhuǎn)染小鼠，觀察骨轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)231.KO#1.EZH2和231. KO # 1.H689A細(xì)胞誘導(dǎo)骨轉(zhuǎn)移病變(Fig. 2f)。PTHLH是乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的介質(zhì)。通過qRTPCR檢測(cè)，在MDA-MB-231和4T1細(xì)胞中敲除EZH2可以降低TGFβ處理下的PTHLH mRNA表達(dá), 而GSK126處理4T1細(xì)胞并沒有降低Pthlh mRNA的表達(dá)(Fig. 2g, h).

Fig2 EZH2調(diào)節(jié)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的惡性循環(huán)

3. FSP1EZH2在TGFβ刺激下增加pS465/467-Smad2和pY397-FAK水平

PTHLH是一個(gè)眾所周知的TGFβ下游基因，受p-Smad2/Gli2轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體或p38 mapk7,23調(diào)控。為了進(jìn)一步探索EZH2是如何促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞中PTHLH和TGFβ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的，作者檢測(cè)了乳腺癌細(xì)胞中pS465/467-Smad2和pT180/Y182-p38 MAPK水平。在TGFβ刺激下，MDA-MB-231細(xì)胞敲除EZH2可抑制pS465/467-Smad2水平，但Smad2、Smad3、Smad4蛋白水平?jīng)]有顯著變化(Fig. 3a)。與對(duì)照載體相比，H689A EZH2重表達(dá)也增加了pS465/467-Smad2的水平(Fig. 3b)。敲除ezh2基因后進(jìn)行反向蛋白芯片分析，結(jié)果顯示，顯著下調(diào)和上調(diào)的蛋白為激酶，包括酪氨酸激酶(Fig. 3c)。值得注意的是，F(xiàn)AK上酪氨酸397的磷酸化水平(pY397-FAK)顯著降低(Fig. 3c)。通過WB驗(yàn)證了RPPA數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，在MDA-MB-231和MCF7細(xì)胞中敲除EZH2可以抑制TGFβ處理下的pY397-FAK和pS465/467-Smad2水平(Fig. 3d)。

為了檢查pY397-FAK的增加是否與pS465/467-Smad2的增強(qiáng)有關(guān)，作者用不同濃度(1-10 μM)的FAK抑制劑(FAKi、VS-4718或VS-6063)，再經(jīng)TGFβ處理(5 ng/ mL, 2 h) MDA-MB-231細(xì)胞，檢測(cè)pS465/467-Smad2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)FAKi降低了pS465/467-Smad2水平，甚至在TGFβ刺激下也降低了PTHLH mRNA的表達(dá) (Fig. 3e)。此外，在MDA-MB-231細(xì)胞中使用shRNAs敲除FAK (shFAK#2或shFAK#3)也能抑制pS465/467-Smad2的水平(Fig. 3f)。

Fig3 EZH2在TGFβ刺激下增加pS465/467-Smad2和pY397-FAK水平

4. pY397-FAK誘導(dǎo)TGFβ ri酪氨酸磷酸化，增強(qiáng)其與TGFβ rii的結(jié)合，以響應(yīng)TGFβ

在mda - mb - 231細(xì)胞中，評(píng)估FAK是否調(diào)控TGFβRI和TGFβRII的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)無(wú)論有無(wú)TGFβ暴露，F(xiàn)AK IP均可降低TGFβRI，而非TGFβ RII (Fig. 4a)。此外，通過FAKi VS-4718處理阻斷FAK激酶活性，降低了FAK與TGFβRI的結(jié)合(Fig. 4b)。TGFβRII的WB結(jié)果顯示FAK抑制顯著降低了TGFβRI與TGFβ RII的結(jié)合，以響應(yīng)TGFβ的刺激(Fig. 4c)。此外，作者檢測(cè)到TGFβRI上的酪氨酸磷酸化， FAKi VS-6063處理降低了酪氨酸磷酸化(Fig. 4d)。接下來(lái)，作者發(fā)現(xiàn)了一個(gè)未報(bào)道的酪氨酸182 (pY182)上的TGFβRI磷酸化位點(diǎn)，位于甘氨酸和絲氨酸殘基富集區(qū)域(Fig. 4e)。

結(jié)構(gòu)分析顯示，TGFβRI的Y182位點(diǎn)高度暴露于潛在的磷酸化(Fig. 4f)，靠近TGFβRI的兩個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)和一個(gè)絲氨酸位點(diǎn)(T185、T186、S187) (Fig. 4g)，它們被TGFβRII31和32結(jié)合并磷酸化。蛋白質(zhì)對(duì)接結(jié)果表明，TGFβRI的Y182指向TGFβRII的K381（Fig 4g）。

Fig 4 pY397-FAK誘導(dǎo)TGFβ ri酪氨酸磷酸化，增強(qiáng)其與TGFβ rii的結(jié)合，以響應(yīng)TGFβ

5. EZH2增加FAK上游ITGB1的表達(dá)

作者發(fā)現(xiàn)，敲除EZH2導(dǎo)致RNA Pol II與ITGB1(編碼整合素β1)啟動(dòng)子的結(jié)合顯著降低，而與ITGB3(編碼整合素β3)的結(jié)合變化不大(Fig. 5a）。qRT-PCR顯示敲低或敲除EZH2下調(diào)ITGB1 mRNA表達(dá)(Fig. 5b, c)。同時(shí),ITGB1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示，與與231.KO#1 和 231.KO#2相比，ezh2表達(dá)的MDA-MB-231 和 231.sgCtrl 細(xì)胞ITGB1啟動(dòng)子活性較高(Fig. 5d)。

ChIP-qPCR中，使用一系列的PCR引物結(jié)合到ITGB1啟動(dòng)子的不同區(qū)域，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在MDA-MB-231細(xì)胞中，EZH2被招募到ITGB1啟動(dòng)子從P1到P5位點(diǎn)，預(yù)期在231.EZH2與ITGB1啟動(dòng)子位點(diǎn)的結(jié)合缺失（Fig. 5e）。在MDA-MB-231細(xì)胞中。EZH2敲除后，RNA Pol II與ITGB1啟動(dòng)子的結(jié)合也失去了(Fig. 5f)。類似地，在231.shEZH2#3 和231.shEZH2#4細(xì)胞中敲低EZH2能降低ITGB1啟動(dòng)子P1到P4位點(diǎn)的RNA Pol II結(jié)合(Fig. 5g)。

Fig5 EZH2增加FAK上游ITGB1表達(dá)

6.  臨床適用的FAK抑制劑能阻斷治療ezh2誘導(dǎo)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移

使用BLI檢測(cè)產(chǎn)生的骨轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)，這證實(shí)了GSK126治療沒有阻止骨中的腫瘤生長(zhǎng). 令人興奮的是，與對(duì)照組相比，F(xiàn)AKi VS-6063治療顯著阻礙了骨腫瘤的生長(zhǎng)(P = 0.0442)(Fig 6a)。骨轉(zhuǎn)移免疫組化染色顯示FAKi VS-6063顯著降低pS465/467-Smad2水平(P = 0.0066)和骨轉(zhuǎn)移灶中PTHLH表達(dá)(P = 0.0074)，兩種藥物均有效抑制其靶點(diǎn)(Fig. 6b, c)。最后，作者檢查了GSE2603數(shù)據(jù)集并驗(yàn)證了EZH2表達(dá)與乳腺癌患者無(wú)骨轉(zhuǎn)移生存期呈負(fù)相關(guān)(r =?0.2394，P = 0.03) (Fig. 6d), 提示EZH2在原發(fā)性乳腺腫瘤中的高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致患者發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的高風(fēng)險(xiǎn)。作者還研究了EZH2表達(dá)與下游效應(yīng)因子的相關(guān)性，GSE14020數(shù)據(jù)集中乳腺癌患者骨轉(zhuǎn)移組織中PTHLH的含量。作者發(fā)現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移患者中EZH2 mRNA表達(dá)與PTHLH mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(Fig. 6e)

Fig6臨床適用的FAK抑制劑治療阻斷ezh2誘導(dǎo)的乳腺癌骨轉(zhuǎn)移

    綜上所述，作者發(fā)現(xiàn)FAK是EZH2在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移惡性循環(huán)中的下游效應(yīng)因子。發(fā)現(xiàn)FAKi聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)的抗骨吸收藥物、化療或放療可能為骨轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者提供額外的好處。