SRSF3介導(dǎo)的N6-甲基腺苷修飾相關(guān)lncRNA ANRIL剪接調(diào)控促進(jìn)了胰腺癌對吉西他濱的耐藥

富含絲氨酸/精氨酸的剪接因子3 （SRSF3）調(diào)控超過90%的蛋白質(zhì)編碼基因的mRNA選擇性剪接，為生物多樣性提供了必要的來源。目前，有研究建立了SRSF3、m6A修飾、lncRNA剪接與胰腺癌DNA 同源重組修復(fù)（HR）之間的聯(lián)系，表明異常的選擇性剪接和m6A修飾與胰腺癌化療耐藥密切相關(guān)。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果

1. 胰腺癌組織中SRSF3表達(dá)上調(diào)與耐藥有關(guān)

首先培養(yǎng)胰腺癌Pan1和BXPC3細(xì)胞系，通過重復(fù)吉西他濱誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥亞群。與相應(yīng)的親本系相比，吉西他濱在耐藥亞群中的半最大抑制濃度（IC50）值顯著更高（圖1A和圖1B）。在相同吉西他濱濃度下，這些耐藥細(xì)胞的增殖速度明顯快于親本細(xì)胞，表明成功構(gòu)建了Panc1-GR-和BXPC3-GR-耐藥菌株（圖1C和1D）。然后，使用RNA測序（RNA-seq）分析對耐藥和敏感細(xì)胞株之間的基因表達(dá)譜，以及26名預(yù)后較好或較差的晚期胰腺癌患者之間的基因表達(dá)譜（圖1E）。SRSF3被鑒定為唯一過表達(dá)的剪接基因（圖1F-1H）。

免疫組化數(shù)據(jù)顯示，SRSF3表達(dá)在癌組織中顯著上調(diào)（圖1I和1J），這與腫瘤分級的增加相關(guān)（圖1K）。在相同的化療條件下，SRSF3高表達(dá)腫瘤患者的總生存期和無進(jìn)展生存期明顯短于srsf3低表達(dá)腫瘤患者（圖1L）。qPCR和western blot數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了SRSF3在胰腺癌及相應(yīng)正常組織中的表達(dá)數(shù)據(jù)（圖1M-1O）。因此，SRSF3高表達(dá)腫瘤患者接受化療后預(yù)后較差，SRSF3的表達(dá)與胰腺癌的化療耐藥密切相關(guān)。

圖1 SRSF3在人胰腺癌中的表達(dá)及預(yù)后價(jià)值

2. SRSF3與胰腺癌細(xì)胞吉西他濱耐藥相關(guān)

接下來評估SRSF3在吉西他濱耐藥和敏感胰腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SRSF3蛋白在耐藥胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)更高（圖2A）。構(gòu)建四組穩(wěn)定的細(xì)胞系Panc1-Ctrl與Panc1-SRSF3、Panc1-GR-sh載體與Panc1-GRshSRSF3、BXPC3-Ctrl與BXPC3-SRSF3、BXPC3-GRsh載體與BXPC3-GR-shSRSF3，以評估SRSF3在介導(dǎo)耐藥性中的作用。western blot數(shù)據(jù)證實(shí)成功產(chǎn)生了不同的表達(dá)SRSF3的胰腺癌細(xì)胞穩(wěn)定亞系（圖2B和2C）。隨后，平板克隆形成和細(xì)胞活力測定數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)在這些胰腺癌細(xì)胞穩(wěn)定系中，SRSF3的表達(dá)確實(shí)與吉西他濱耐藥相關(guān)（圖2D-2F）。SRSF3的表達(dá)被證實(shí)可以提高胰腺癌細(xì)胞株對吉西他濱的IC50值（圖2E）。

構(gòu)建SRSF3高低表達(dá)的PDX模型，用western blot分析篩選SRSF3高、低表達(dá)的組織進(jìn)行后續(xù)移植。裸鼠PDX模型和腹腔腫瘤細(xì)胞注射模型數(shù)據(jù)顯示，SRSF3高表達(dá)增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞對吉西他濱的耐藥性，而SRSF3低表達(dá)則有相反的效果（圖2G-2N）。總之，SRSF3在胰腺癌細(xì)胞對吉西他濱的耐藥性中起著重要作用。

圖2 SRSF3增強(qiáng)人胰腺癌細(xì)胞體內(nèi)外吉西他濱耐藥

3. SRSF3對lncRNA ANRIL剪接和外顯子包含的調(diào)控

為了探究SRSF3的下游分子事件，不同水平的SRSF3表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞進(jìn)行吉西他濱干預(yù)，以確定相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。在吉西他濱處理的細(xì)胞中，SRSF3降低了γH2AX、p53、caspase-3和bcl-2的表達(dá)，而SRSF3過表達(dá)降低了吉西他濱引起的細(xì)胞損傷（圖3A）。另外，SRSF3的功能在DNA修復(fù)調(diào)控中富集（圖3B）。結(jié)合圖1G的結(jié)果來識別SRSF3的共同差異表達(dá)基因以及下游因子：ANRIL是該交叉點(diǎn)唯一與DNA修復(fù)相關(guān)的基因（圖3C）。利用Ensembl數(shù)據(jù)庫，根據(jù)ANRIL的不同轉(zhuǎn)錄本設(shè)計(jì)了引物（圖3D顯示了一些轉(zhuǎn)錄本圖），并評估了ANRIL在Panc1、Panc1-GR、BXPC3和BXPC3-GR中的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)吉西他濱耐藥腫瘤細(xì)胞主要表達(dá)兩種轉(zhuǎn)錄本:ANRIL 208（簡稱ANRIL- l）和ANRIL 223（簡稱ANRIL- s）（圖3E）。根據(jù)ENCORI和RNAct數(shù)據(jù)庫預(yù)測，SR家族蛋白SRSF1、3、7和10具有ANRIL的結(jié)合位點(diǎn)（圖3F）。因此，進(jìn)一步檢測了它們在抗性細(xì)胞（GR）和親本細(xì)胞（野生型[WT]）中的表達(dá)。結(jié)果顯示，GR細(xì)胞中SRSF3表達(dá)較高，SRSF10表達(dá)較低（圖3G）。RNA免疫沉淀試驗(yàn)確認(rèn)了SRSF3和SRSF10對ANRIL的結(jié)合能力（圖3H、3I）。RNA下拉試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SRSF3和SRSF10能夠與ANRIL結(jié)合（圖3J-3L）。通過構(gòu)建內(nèi)生ANRIL pre-mRNA與潛在SRSF3-binding站點(diǎn)，執(zhí)行一個(gè)CLIP-qPCR試驗(yàn)使用Panc-1-GR細(xì)胞（圖3M），發(fā)現(xiàn)構(gòu)建攜帶外顯子1和2的碎片ANRIL能夠綁定到SRSF3蛋白質(zhì)，而片段包含外顯子2和6綁定到SRSF10（圖3N）。的RNA免疫沉淀實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，敲低SRSF10，SRSF3和ANRIL的結(jié)合增加（圖3O），而在敲低SRSF3后，SRSF10和ANRIL的結(jié)合也增加（圖3P和S3K）。這表明SRSF3和SRSF10競爭性結(jié)合ANRIL可調(diào)控ANRIL的剪接。SRSF3 和SRSF10 或在穩(wěn)定的腫瘤細(xì)胞亞系中顯示 SRSF3能夠上調(diào) ANRIL-L 表達(dá)但下調(diào)ANRIL-S 表達(dá)，而 SRSF10 具有相反的效果（圖 3Q 和 3R）。這些數(shù)據(jù)表明 SRSF3 和SRSF10 與 ANRIL 競爭性結(jié)合以調(diào)節(jié) ANRIL 剪接（圖 3S）。

圖3 SRSF3誘導(dǎo)ANRIL剪接

4. ANRIL剪接分子的m6A修飾

通過對Panc1-WT與Panc1- GR以及Bxpc3-WT與BXPC3-GR的RNA-seq結(jié)果進(jìn)行GO分析，發(fā)現(xiàn)這些基因有m6A修飾（圖4A）。與親本株相比，Panc1-GR和BXPC3-GR中m6A的總體水平升高（圖4B），這表明修改后的m6A水平可能與吉西他濱耐藥有關(guān)。利用m6Avar和SRAMP數(shù)據(jù)庫預(yù)測了ANRIL中m6A的修飾位點(diǎn)（圖4C），并針對ANRIL外顯子1上的m6A位點(diǎn)設(shè)計(jì)了一套序列特異性的morpholino反義寡核苷酸（MAOS）（圖4D）。使用m6A特異性免疫沉淀試驗(yàn)評估了Panc1-GR/BXPC3-GR與其親本系之間ANRIL m6A水平的差異（圖4E）。此外，還發(fā)現(xiàn)SRSF3表達(dá)與ANRIL中的m6A修飾相關(guān)（圖4F、4G），而METTL3和MAOS-ANRIL的過度表達(dá)也顯示了ANRIL中m6A修飾的調(diào)控（圖4H、4I）。將MAOS-ANRIL轉(zhuǎn)移到具有穩(wěn)定敲除SRSF3的Panc1-GR細(xì)胞系中，發(fā)現(xiàn)ANRIL中的m6A修飾水平降低，而在SRSF3敲除后過度表達(dá)MAOS-ANRIL的Panc1-GR細(xì)胞中的m6A修飾水平低于對照細(xì)胞（圖4J、4K）。這些結(jié)果表明，SRSF3和METTL3是ANRIL中m6A修飾的重要調(diào)節(jié)因子，這在Panc1-WT細(xì)胞中得到了進(jìn)一步證實(shí)（圖4L、4M）。這些結(jié)果支持了在ANRIL中SRSF3和m6A修飾之間外顯子1上m6A位點(diǎn)的重要性。ANRIL中m6A修飾的水平對于SRSF3與ANRIL-L結(jié)合至關(guān)重要（圖4N、4O），并且與ANRIL剪接事件的發(fā)生密切相關(guān)（圖4P-4S）。總之， ANRIL和SRSF3表達(dá)中m6A修飾水平在ANRIL- l亞型的產(chǎn)生中同樣重要。

圖4 ANRIL的剪接受m6A RNA甲基化的調(diào)控

5. lncRNA ANRIL亞型對吉西他濱耐藥的不同影響

與親本細(xì)胞相比，Panc1-GR和BXPC3-GR細(xì)胞中ANRIL-L表達(dá)更高，ANRIL-S表達(dá)更低（圖5A）。熒光原位雜交（FISH）實(shí)驗(yàn)顯示，ANRIL-L在Panc1-GR和BXPC3-GR細(xì)胞核中的表達(dá)高于Panc1-WT和BXPC3-WT（圖5B），而ANRIL-S在細(xì)胞核中的表達(dá)高于Panc1-WT和BXPC3-WT。使用Panc1-WT和Panc1-GR生成了穩(wěn)定的ANRIL-L過表達(dá)和ANRIL-S敲除細(xì)胞系，并使用qPCR驗(yàn)證有效轉(zhuǎn)染（圖5C）。ANRIL-L誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞對吉西他濱耐藥，而ANRIL-S對耐藥無顯著影響（圖5D-5I）。ANRIL-L也影響腫瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)。結(jié)果表明，ANRIL-L能夠下調(diào)DNA損傷因子gH2AX的表達(dá)，而彗星實(shí)驗(yàn)證實(shí)ANRIL-L與DNA修復(fù)能力密切相關(guān)（圖5J、5K）。體內(nèi)裸鼠實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)了該體外數(shù)據(jù)（圖5L-5O）。這些結(jié)果總體上證實(shí)了ANRIL-l，而不是ANRIL-S，具有調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞對吉西他濱耐藥和增強(qiáng)DNA修復(fù)能力的能力，表明不同的ANRIL亞型在胰腺癌細(xì)胞中具有不同的功能。

圖5 lncRNA ANRIL-L亞型對吉西他濱耐藥的影響

6. SRSF3通過調(diào)節(jié)ANRIL-L的表達(dá)促進(jìn)吉西他濱耐藥

作者通過過表達(dá)、敲除等實(shí)驗(yàn)證明了ANRIL-L挽救了SRSF3表達(dá)改變的腫瘤細(xì)胞對吉西他濱的耐藥性，而ANRIL-S沒有這種作用。western blot和高含量及彗星實(shí)驗(yàn)證實(shí)ANRIL-L是影響SRSF3相關(guān)DNA修復(fù)過程和耐藥性變化的主要因素（圖6O-6R）。綜上所述，SRSF3的表達(dá)似乎通過ANRIL選擇性剪接和ANRIL- l的表達(dá)增強(qiáng)了胰腺癌細(xì)胞對吉西他濱的耐藥性。

7. ANRIL-L通過增強(qiáng)DNA HR修復(fù)介導(dǎo)吉西他濱耐藥

作者證明了ANRIL-L介導(dǎo)的化療耐藥機(jī)制：ANRIL-L通過與RING1b和EZH2形成復(fù)合體調(diào)控胰腺癌細(xì)胞的化療耐藥（附圖7A-P）。接下來分析ANRIL-L敲除耐藥細(xì)胞中的HR和NHEJ，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞中的HR活性顯著降低（圖6A、6B），并且qPCR數(shù)據(jù)顯示所選DNA修復(fù)RAD50、BRCA1、BRCA2和RAD51 mRNA的水平顯著改變（圖6C）。敲除ANRIL-L表達(dá)和吉西他濱治療改變了HR修復(fù)相關(guān)分子的表達(dá)，同時(shí)降低了RAD50、BRCA1、BRCA2和RAD51的水平（圖6D）。此外，隨著吉西他濱濃度和耐藥胰腺癌細(xì)胞持續(xù)時(shí)間的逐漸增加，HR分子BRCA1、BRCA2、RAD50和RAD51與ANRIL-L的結(jié)合增加（圖6E 6H）。然而，在EZH2或Ring1B表達(dá)被敲除后，與ANRIL-L的結(jié)合減弱（圖6I-6L）。在耐藥細(xì)胞中敲除ANRIL-L表達(dá)后，GH2AX與BRCA2和BRCA1的結(jié)合減少（圖6M-6P）。基于這些結(jié)果，ANRIL-L能夠與DNA損傷位點(diǎn)結(jié)合，與EZH2和Ring1B形成復(fù)合物，進(jìn)而招募RAD50、BRCA1、BRCA2和RAD51蛋白，在細(xì)胞經(jīng)歷DNA損傷修復(fù)時(shí)促進(jìn)DNA HR修復(fù)過程。

圖6 ANRIL-L復(fù)合物通過增強(qiáng)DNA HR修復(fù)介導(dǎo)吉西他濱耐藥

8. 胰腺癌組織中SRSF3的表達(dá)與ANRIL剪接、Ring1B和EZH2的表達(dá)相關(guān)

與正常組織相比，胰腺癌組織中ANRIL- l表達(dá)水平較高，ANRIL- s表達(dá)水平較低（圖7A和7B），胰腺癌組織中ANRIL外顯子1包涵水平顯著高于非癌胰腺組織（圖7C）。結(jié)合臨床預(yù)后分析，Kaplan-Meier分析顯示高PSI-ANRIL-exon 1腫瘤預(yù)后較差（圖7D、7E）。相比之下，高PSI-ANRIL -1外顯子的患者比低PSI ANRIL-L的患者有更多的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和更大的腫瘤（圖7F和7G）。此外，SRSF3的表達(dá)與METTL3存在相關(guān)性，證實(shí)了SRSF3與m6A修飾之間的相關(guān)性（圖7H）。ANRIL外顯子1內(nèi)含物PSI與腫瘤組織中SRSF3、EZH2和Ring1B的表達(dá)相關(guān)，進(jìn)一步支持了這些因子形成復(fù)合物調(diào)控DNA修復(fù)的可能性（圖7I-7K）。這些數(shù)據(jù)表明胰腺癌組織中SRSF3表達(dá)、ANRIL剪接以及Ring1B和EZH2表達(dá)之間存在相關(guān)性。

圖7胰腺癌組織中SRSF3表達(dá)與ANRIL剪接、Ring1B、EZH2表達(dá)的相關(guān)性

結(jié)論：

綜上所述，本研究揭示了SRSF3在胰腺癌化療耐藥調(diào)控中的作用及其與胰腺癌預(yù)后的關(guān)系。SRSF3表達(dá)通過ANRIL剪接使胰腺癌細(xì)胞對化療藥物脫敏，ANRIL中的m6A甲基化對剪接過程至關(guān)重要。證明了SRSF3和SRSF10在調(diào)節(jié)lncRNA ANRIL可變剪接模式中的作用。此外，m6A甲基化對于lncRNA的剪接過程至關(guān)重要。該研究不僅提供了SRSF3誘導(dǎo)ANRIL-L剪接的分子機(jī)制，進(jìn)而在胰腺癌化療耐藥性中形成DNA HR修復(fù)復(fù)合體，而且還為未來胰腺癌治療的發(fā)展提供了一種策略。