exoASO-STAT6介導(dǎo)的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞基因重編程導(dǎo)致有效的單藥抗腫瘤活性

M2表型的免疫抑制腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）可破壞癌癥檢查點免疫治療的有效性。將TAM重新編程為促炎性M1表型是誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的一種新方法。目前有研究報道了一種獨特的基于外泌體的方法，通過選擇性地將靶向STAT6的反義寡核苷酸（ASO）傳遞給TAMs，將TAMs重新編程為促炎性M1表型。這種新的工程化外泌體exoASO-STAT6在肝臟中表現(xiàn)出最大的生物分布和STAT6沉默活性，并對其他組織中的影響最小。該研究與2022年2月發(fā)表在《Science Advances》，IF：14.136。

技術(shù)路線：

1.設(shè)計外泌體介導(dǎo)ASO傳遞給巨噬細(xì)胞

作者假設(shè)，具有這些特性的外泌體（對M2巨噬細(xì)胞具有趨向性）可能會優(yōu)先向TAMs傳遞ASO，并在TME中優(yōu)先有效地調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞中的基因表達(dá)。為了驗證這一假設(shè)，開發(fā)了一種裝載靶向STAT6轉(zhuǎn)錄因子的ASO外泌體(圖1A)。從HEK293細(xì)胞中可重復(fù)地純化外泌體[野生型（WT）或過表達(dá)的PTGFRN（PTGFRN++外泌體）]，且WT和PTGFRN++外泌體均能有效地將STAT6 ASO裝載在表面，并且在外泌體ASO-STAT6的生物物理性質(zhì)、效力和藥效作用方面沒有觀察到差異（圖1B-D）。此外，添加疏水性膽固醇標(biāo)簽和連接子可實現(xiàn)有效的外泌體加載，從而使每個外泌體在WT或PTGFRN++外泌體上的加載量大于2000個拷貝（圖1D）。

為了確定外源ASO在體內(nèi)的細(xì)胞取向性，使用Cy5標(biāo)記的exoASO-STAT6或freeASO在CT26結(jié)腸癌荷瘤小鼠中的生物分布。瘤內(nèi)給藥后，與freeASO組相比，exoASO-STAT6組在所有分析的組織中始終顯示Cy5信號升高(圖1E)；在血液單核細(xì)胞中，與游離ASO相比，外泌ASO組增強(qiáng)了11倍。在CT26皮下腫瘤中，外泌體也能更有效地將ASO傳遞給髓系細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)表明，外泌體可增強(qiáng)ASO在肝臟、外周血、骨髓和TME中的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和MDSCs的傳遞。

通過比較各組織中與ASO相關(guān)的主要細(xì)胞群的熒光強(qiáng)度，可以清楚地發(fā)現(xiàn)，肝臟Kupffer細(xì)胞顯示的ASO信號明顯高于其他任何亞群 (圖1F)。這一觀察結(jié)果與使用89zr標(biāo)記的PTGFRN++外泌體進(jìn)行組織/器官生物分布研究的結(jié)果一致，該研究顯示，95%的靜脈注射劑量定位于肝臟，而只有4.6和0.6%分別積累于脾臟和股骨(圖1G)。此外，靜脈給藥時，exoASO-STAT6在小鼠的肝臟中有效誘導(dǎo)了STAT6敲除，而在脾臟中未觀察到STAT6表達(dá)的變化（圖1H和I）。等量的游離STAT6 ASO在肝臟中只導(dǎo)致38%的STAT6敲除，這表明外泌體介導(dǎo)的傳遞增強(qiáng)了ASO的效力，并使其優(yōu)先傳遞給巨噬細(xì)胞。

圖1 外泌體介導(dǎo)的ASOs在體內(nèi)優(yōu)先傳遞到髓系細(xì)胞

2.免疫抑制M2巨噬細(xì)胞體外有效重編程為促炎M1巨噬細(xì)胞

M2-極化的MDMs分別使用exoASO- stat6、裝載對照exoASO (exoASO- scramble)的外泌體或所示的游離ASO處理。exoASO-STAT6處理(48小時)以劑量依賴的方式降低了STAT6 mRNA的表達(dá)(圖2A)，并且在沉默STAT6 mRNA表達(dá)方面比游離ASO的作用大約強(qiáng)兩倍(圖2A)。此外，96小時后也觀察到STAT6蛋白的劑量依賴性減少，exoASO-STAT6比游離ASO更有效(約75%減少比45%減少)(圖2B)。鑒于M2巨噬細(xì)胞對exoASO的攝取更為優(yōu)越，并通過吞噬作用和清道夫受體介導(dǎo)的機(jī)制進(jìn)行介導(dǎo)（圖S1G、H），比較了在存在吞噬和清除受體抑制劑的情況下，研究exoASO-STAT6和游離STAT6 ASO對STAT6 mRNA的沉默。與攝取過程中觀察到的效果一致(圖S1H)，巖藻多糖（Fucoidin）和poly(I)處理部分降低了exoASO-STAT6的效力，而細(xì)胞松弛素D（Cytochalasin D）處理顯著降低了exoASO-STAT6的效力(IC50)(圖2C)。在游離STAT6 ASO治療組中，抑制劑治療后STAT6 mRNA沉默無明顯變化(圖2C)。這些結(jié)果顯示了巨噬細(xì)胞吸收機(jī)制中游離ASO和外泌ASO之間的重要區(qū)別，這可能是這兩種化合物的效力差異的基礎(chǔ)。

為了研究exoASO-STAT6降低STAT6的表達(dá)是否足以誘導(dǎo)M2到M1重編程，測量了經(jīng)exoASO-STAT6 NanoString分析處理的人M2極化巨噬細(xì)胞的基因表達(dá)變化。exoASO-STAT6處理導(dǎo)致M2基因[如CD206、CD163、轉(zhuǎn)化生長因子(TGFB1)、CSF1R和CEBPB]顯著減少，并伴隨促炎基因如IL12B、IL1B和一氧化氮合酶2 (NOS2)的增加(圖2D和E)。此外，STAT6通路基因[如IL4R、STAT6、MRC1(甘甜受體C-Type 1)和MAFB (MAF BZIP轉(zhuǎn)錄因子B)]也顯著減少(圖2D)。與對照exoASO處理的巨噬細(xì)胞相比，exoASO- stat6處理顯著誘導(dǎo)了M1巨噬細(xì)胞基因標(biāo)記，并使M2巨噬細(xì)胞基因標(biāo)記減少了5倍 (圖2F)。游離STAT6 ASO處理導(dǎo)致巨噬細(xì)胞重編程，但與劑量匹配的exoASO-STAT6相比，重編程程度較低(圖2F)。然后用LPS處理24小時后，分析M2極化的MDMs中細(xì)胞因子的產(chǎn)生。與對照組相比，exoASO-STAT6誘導(dǎo)多種M1細(xì)胞因子腫瘤壞死因子(TNF-)、IL-23、IL-12和IL-1，M2趨化因子(CCL17)降低 (圖2G)。與游離STAT6 ASO組相比，ASO-STAT6處理組M1細(xì)胞因子的誘導(dǎo)和M2細(xì)胞因子的減少更為明顯(圖2G)。這些數(shù)據(jù)證實exoASO-STAT6使抑制性M2巨噬細(xì)胞傾向于促炎癥表型M1。

圖2  exoASO持續(xù)降低STAT6表達(dá)導(dǎo)致M2巨噬細(xì)胞重編程

3. exoASO-STAT6誘導(dǎo)CT26腫瘤模型在瘤內(nèi)給藥后有效的單劑抗腫瘤活性

接著研究了瘤內(nèi)模型中exoASO-STAT6的有效性。使用exoASO-STAT6治療的10只小鼠中有6只觀察到完全的腫瘤緩解(CRs)(圖3 A和B)。Anti-CSF1R單藥治療不能抑制腫瘤生長，且anti-PD-1治療導(dǎo)致腫瘤適度的生長抑制，但腫瘤生長速度沒有顯著降低，沒有觀察到CRs。Anti-PD-1與exoASO-STAT6聯(lián)合使用在抗腫瘤療效上沒有顯示出任何相加或協(xié)同效應(yīng)(圖3A、B)。exoASO-STAT6單藥和聯(lián)合治療分別顯著延長了42天和39天的生存期 (圖3 C)。接下來，評估了CT26模型中exoASO-STAT6的劑量反應(yīng)。在使用exoASO-STAT6治療后，觀察到注射的腫瘤體積呈劑量依賴性下降(圖3D)。在原發(fā)腫瘤細(xì)胞接種后的第42天，對初始腫瘤有CR的動物從反面?zhèn)让娼臃NCT26細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，從原發(fā)腫瘤獲得CR的小鼠均排斥二次CT26細(xì)胞的生長。相反，在na?ve小鼠中觀察到均勻的腫瘤生長(圖3E)。另外，耗盡CD4+ T細(xì)胞只能部分抑制exoASO-STAT6對腫瘤生長的影響(圖3F和G)。相反，anti-cd8抗體治療組沒有觀察到CR，腫瘤生長速度與對照組相當(dāng)(圖3G)。這些數(shù)據(jù)表明CD8+ T細(xì)胞在介導(dǎo)ASO-STAT6抗腫瘤免疫中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。該研究首次證明了巨噬細(xì)胞靶向治療對腫瘤生長有顯著抑制作用，當(dāng)作為單一藥物進(jìn)行評估時，可導(dǎo)致腫瘤完全緩解。

圖3  exoASO-STAT6治療結(jié)果CD8+T細(xì)胞依賴性單一療法對CT26的療效

4. exoASO-STAT6對CT26腫瘤模型中TME的有效重構(gòu)

在CT26腫瘤模型中研究exoASO-STAT6治療的藥效學(xué)效應(yīng)。如圖4A所示，CT26荷瘤小鼠分別接受三種腫瘤內(nèi)劑量的exoASO-STAT6或?qū)φ罩委?。用exoASO-STAT6處理可誘導(dǎo)STAT6 mRNA減少約50%，而用游離STAT6-ASO處理后僅觀察到17%的敲除（圖4B）。此外，exoASO-STAT6使M2基因Arg1的表達(dá)減少了56%，而游離STAT6 ASO介導(dǎo)的Arg1表達(dá)減少20%（圖4B）。

為了更詳細(xì)地評估STAT6敲低對TME髓系室的影響，使用NanoString平臺進(jìn)行了基因表達(dá)分析。與對照組相比，exoASO-STAT6處理組中與M2巨噬細(xì)胞表型相關(guān)的基因下調(diào)高達(dá)80%。類似地，在exoASO-STAT6組中觀察到M1相關(guān)基因（如Nos2）的雙倍增加，表明exoASO-STAT6治療后TAM的體內(nèi)重新編程是有效的（圖4C-E）。等效劑量的游離STAT6 ASO治療并沒有導(dǎo)致M2或M1相關(guān)基因的變化，這表明需要外泌體介導(dǎo)的體內(nèi)傳遞來誘導(dǎo)TAM的有效重編程。

接下來，評估了exoASO-STAT6治療對腫瘤免疫浸潤成分的影響。如圖4A所述，在用exoASO-STAT6或?qū)φ誩xoASO進(jìn)行腫瘤內(nèi)治療后，對CT26腫瘤進(jìn)行免疫表型分析，以評估TME免疫細(xì)胞的整體變化。消化腫瘤的細(xì)胞熒光分析顯示，與對照組相比，exoASO-STAT6組的免疫浸潤顯著增加了兩倍(圖4F)。通過exoASO-STAT6, M2標(biāo)記CD206在F4/80+ TAMs中的表達(dá)降低了60%(圖4F)，這支持了基因表達(dá)分析的結(jié)果(圖4E)。觀察到CD4室中的T調(diào)節(jié)蛋白比例顯著降低，免疫浸潤中的Treg頻率降低3.3倍（圖4F）。

通過單細(xì)胞RNA測序評估腫瘤浸潤細(xì)胞的基因表達(dá)，證實exoASO-STAT6導(dǎo)致腫瘤中單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞群發(fā)生顯著變化（圖4G和H），并發(fā)現(xiàn)CT26腫瘤中有六個單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞群體具有不同的基因表達(dá)譜（圖4G）。與對照exoASO-STAT6處理相比，Clusters c3和c6顯示exoASO-STAT6誘導(dǎo)的STAT6表達(dá)顯著降低(圖4H)。Clusters c3和c5，在對exoASO-STAT6的反應(yīng)中擴(kuò)展(圖4G)。在exoASO-STAT6處理組中，M1標(biāo)記Nos2的水平顯著增加(圖4I)。相反，通過exoASO-STAT6處理，Clusters c1和c6減少（圖4G）。Clusters c6由表達(dá)高水平Cd163和Retnla（Fizz1）的細(xì)胞代表，該群體主要與M2極化巨噬細(xì)胞相關(guān)（圖4I）。Clusters c1由高水平的Cd206、Trem2和補(bǔ)體亞單位C1q的亞組分表示，補(bǔ)體亞單位C1q是由M2重編程細(xì)胞因子（如IL-4）誘導(dǎo)的先天性炎癥的重要介質(zhì)。綜上所述，在接受exoASO-STAT6治療的CT26腫瘤中，巨噬細(xì)胞和其他浸潤性免疫細(xì)胞發(fā)生了深刻的變化，導(dǎo)致TME向免疫激活和抗腫瘤免疫的重塑。

圖4  exoASO-STAT6對TAMs的有效重編程可導(dǎo)致TME重構(gòu)

5.在肝細(xì)胞癌模型中，全身給予exoASO-STAT6可導(dǎo)致有效的單藥抗腫瘤反應(yīng)

為了評估系統(tǒng)劑量的exoASO-STAT6對HCC的抗腫瘤療效，使用Hepa1-6原位模型(圖5A)。ExoASO-STAT6治療導(dǎo)致62%的腫瘤負(fù)擔(dān)減少，對照組經(jīng)ExoASO處理的動物沒有顯示出任何可測量的腫瘤負(fù)擔(dān)減輕(圖5B)。組織學(xué)切片中對腫瘤細(xì)胞的定量分析也顯示，與單純外泌體對照組相比，外泌體STAT6處理組的腫瘤負(fù)擔(dān)顯著降低(71%)(圖5C)。HE肝切片和組織病理學(xué)評分顯示，exoASO-STAT6治療的小鼠腫瘤島明顯變小，有明顯的免疫浸潤與腫瘤區(qū)域共定位（圖5C）。

通過PCR評估exoASO-STAT6處理對全肝組織中STAT6表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，與外泌體處理組相比，exoASO-STAT6降低了34%的Stat6 mRNA水平，表明有效的靶基因敲除(圖5D)。由于STAT6蛋白在腫瘤細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中都有表達(dá)，專門分析了腫瘤區(qū)域內(nèi)IBA1+巨噬細(xì)胞中STAT6的表達(dá)：在exoASO-STAT6處理組中，STAT6陽性TAMs的百分比明顯低于對照組(圖5J)。為了探究exoASO-STAT6在該模型中具有顯著的抗腫瘤活性的作用機(jī)制，研究結(jié)束時對全肝組織進(jìn)行了基因表達(dá)分析。通過NanoString評估泛癌基因面板的表達(dá)。與外泌體和對照外泌體相比，幾種與抗腫瘤T細(xì)胞應(yīng)答相關(guān)的基因在exoASO-STAT6組中均上調(diào)[如CD3e、CD8、ICOS、CD80和CD86](圖5E和F)。相反，M2基因Cd276、Myc和Ccl17的表達(dá)降低。途徑和細(xì)胞類型分析證實，誘導(dǎo)了有效的抗腫瘤免疫反應(yīng) (圖5 G)。肝切片免疫組化證實TME的改變。結(jié)果顯示，在exoASO-STAT6組中，巨噬細(xì)胞浸潤增加，M1巨噬細(xì)胞標(biāo)記物誘導(dǎo)型iNOS表達(dá)增加 (圖5H)。此外，ASO優(yōu)先與INOS陰性巨噬細(xì)胞共定位，證實了與M1相比，exoASO-STAT6也表現(xiàn)出對M2巨噬細(xì)胞的選擇性趨向性(圖5I)。最后，觀察到升高CD8+ T細(xì)胞浸潤和顯著減少Treg浸潤 (圖5J)。

圖5 全身應(yīng)用exoASO-STAT6可產(chǎn)生有效的單藥抗腫瘤反應(yīng)

6.在HCC中，巨噬細(xì)胞STAT6信號與疾病預(yù)后不良相關(guān)

根據(jù)人類M2巨噬細(xì)胞中exoASO-STAT6誘導(dǎo)的基因表達(dá)變化生成了STAT6信號（圖2D），確定了由exoASO-STAT6治療調(diào)節(jié)的前40個基因，并從TCGA數(shù)據(jù)庫中分析了這組基因在HCC腫瘤中的表達(dá)。從40個基因列表中確定了10個基因的子集，這些基因在HCC腫瘤中一致表達(dá)（圖6A）。根據(jù)基因表達(dá)模式，富含免疫細(xì)胞的腫瘤和富含巨噬細(xì)胞/缺乏CD8 T細(xì)胞的腫瘤中均存在富含STAT6信號的腫瘤（圖6B）。在免疫細(xì)胞浸潤的腫瘤中，STAT6信號在具有高巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞和Treg標(biāo)記物的腫瘤中富集，并且在具有高TIS的腫瘤的子集中富集（圖6B）。STAT6基因列表也在排除CD8的腫瘤子集中表達(dá)，與較高水平的巨噬細(xì)胞基因一致（圖6B）。STAT6信號的高表達(dá)與HCC中較差的生存率相關(guān)(圖6C)?？傊?，這些結(jié)果表明，在HCC中的巨噬細(xì)胞中有一個靶向STAT6通路的臨床機(jī)會，CD8富集和CD8貧乏的腫瘤患者都可以受益于exoASO-STAT6治療。

圖6  巨噬細(xì)胞STAT6信號與疾病預(yù)后不良相關(guān)

基于CT26和Hepa1-6腫瘤模型的結(jié)果，在這里，作者提出了一個模型來描述通過exoASO-STAT6對TAM進(jìn)行基因重編程介導(dǎo)的抗腫瘤活性(圖7)。表達(dá)STAT6的TAM通過促進(jìn)Treg的募集和抑制CD8細(xì)胞毒性T細(xì)胞等機(jī)制，是產(chǎn)生原瘤免疫抑制性TME的決定因素。exoASO在免疫抑制性TAM中敲除STAT6的能力導(dǎo)致有效的M1表型重編程，從而促進(jìn)細(xì)胞毒性免疫反應(yīng)和抗腫瘤TME的誘導(dǎo)。因此，exoASO-STAT6治療不同于其他巨噬細(xì)胞靶向治療，因為它誘導(dǎo)功能失調(diào)的TAM被抗腫瘤TAM替代，而不是造成整個巨噬細(xì)胞群的有害消耗。

圖7  exoASO-STAT6介導(dǎo)TAMs基因重編程的抗腫瘤活性模型

結(jié)論：

這項研究首次描述了一種工程外泌體治療候選藥物，提供靶向控制巨噬細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)錄因子的ASO (exoASO-STAT6)。外泌體介導(dǎo)的傳遞可顯著增強(qiáng)ASO抑制TAMs中STAT6表達(dá)的能力，并誘導(dǎo)TAMs有效地重編程為M1表型。因此， exoASO-STAT6治療觸發(fā)了TME的有效重構(gòu)，使其達(dá)到促炎、抗腫瘤狀態(tài)，并產(chǎn)生CD8 T細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)。exoASO-STAT6的效力和特異性使其具有強(qiáng)大的單藥抗腫瘤活性，這使這種新治療方法有別于其他巨噬細(xì)胞靶向治療，并突出了其臨床潛力。