設(shè)計(jì)巧妙的實(shí)驗(yàn)思路，一起來發(fā)高分吧！- NCAPD3通過c-myc和E2F1增強(qiáng)Warburg效應(yīng)，促進(jìn)大腸癌的發(fā)生發(fā)展

NCAPD3是凝聚蛋白II復(fù)合物的三個(gè)非SMC亞基之一，在有絲分裂過程中對染色體的凝聚和分離起著重要作用。值得注意的是，在許多體細(xì)胞癌癥中發(fā)現(xiàn)NCAPD3水平升高。然而，NCAPD3在癌癥尤其是結(jié)直腸癌中的臨床作用、生物學(xué)功能和潛在的分子機(jī)制仍不清楚。目前，有研究發(fā)現(xiàn)NCAPD3在結(jié)直腸癌發(fā)生和結(jié)直腸癌進(jìn)展中促進(jìn)糖代謝重編程并增強(qiáng)Warburg效應(yīng)，該文章發(fā)表在《JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH》，IF: 11.161。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. NCAPD3在CRC細(xì)胞和臨床標(biāo)本中過表達(dá)

對人類CRC組織及其對應(yīng)的正常組織進(jìn)行RNA-seq分析，數(shù)據(jù)分析顯示，與正常組織相比，腫瘤組織中NCAPD3的表達(dá)明顯升高（圖1A）。與正常組織相比，NCAPD3在腫瘤組織中顯著過表達(dá)（圖1B, C）。此外，Western blot檢測顯示，與人類正常結(jié)腸黏膜細(xì)胞系FHC相比，CRC細(xì)胞系中NCAPD3的蛋白水平顯著增加（圖1D上圖）。在臨床標(biāo)本中，通過qRTPCR、Western blot和免疫化學(xué)分析，CRC組織中NCAPD3 mRNA和蛋白水平也明顯高于正常組織（圖1D下圖，1E, 1F）。這些結(jié)果表明，NCAPD3在CRC中過表達(dá)，提示NCAPD3與CRC關(guān)系密切。

圖1 NCAPD3在人CRC中表達(dá)較高

2. NCAPD3增強(qiáng)CRC細(xì)胞的糖代謝重編程

在之前的一項(xiàng)研究中，從HT-29（結(jié)腸上皮腺癌細(xì)胞）中免疫沉淀NCAPD3，并用液相色譜-質(zhì)譜分析共沉淀蛋白。通過KOBAS在線平臺對文中發(fā)表的假定的NCAPD3相互作用體進(jìn)行了功能富集分析，揭示了NCAPD3相互作用體在糖酵解和TCA循環(huán)中發(fā)揮作用（圖2A）。與陰性對照相比，HCT116細(xì)胞中NCAPD3過表達(dá)顯著增加了丙酮酸/乳酸/ATP的產(chǎn)生水平、乳酸脫氫酶的活性和2-NBDG的攝取，但降低了丙酮酸脫氫酶的活性，而在NCAPD3敲低的SW480細(xì)胞中，這一結(jié)果顯著逆轉(zhuǎn)（圖2B-G）。此外，NCAPD3過表達(dá)可上調(diào)GLUT1、HK2、ENO1、PKM2和LDHA蛋白水平，但不上調(diào)PGK1和PGAM1蛋白水平。相比之下，NCAPD3敲除PGK1和PGAM1外，降低了這些糖酵解基因的表達(dá)（圖2H）。如圖2I所示，NCAPD3敲低顯著降低了PDK1、PDK3和p-PDHE1α的表達(dá)水平，在NCAPD3過表達(dá)的細(xì)胞中得到了相反的結(jié)果，而PDHE1α的總蛋白水平保持不變。這些結(jié)果表明，NCAPD3增強(qiáng)了CRC細(xì)胞的有氧糖酵解，并減少了葡萄糖衍生碳到TCA循環(huán)的通量。

圖2 NCAPD3增強(qiáng)CRC細(xì)胞的糖代謝重編程

3. NCAPD3通過調(diào)控CRC細(xì)胞中的c-Myc及其下游代謝相關(guān)基因促進(jìn)有氧糖酵解

為了確定c-Myc參與了NCAPD3調(diào)控的有氧糖酵解，首先分析了臨床標(biāo)本的RNA-Seq數(shù)據(jù)。通過分析，發(fā)現(xiàn)CRC組織中的轉(zhuǎn)錄因子c-Myc水平明顯高于正常結(jié)直腸組織（圖3A）。如圖3B所示，過表達(dá)NCAPD3的HCT116細(xì)胞中c-Myc的蛋白和mRNA水平顯著升高，而敲低NCAPD3的SW480細(xì)胞中這一變化逆轉(zhuǎn)。為了驗(yàn)證c-Myc對NCAPD3的糖酵解促進(jìn)作用是必要的，在NCAPD3穩(wěn)定過表達(dá)的HCT116細(xì)胞中使用siRNA和c-Myc抑制劑。數(shù)據(jù)顯示，c-Myc敲低和10058-F4 （c-Myc抑制劑）處理可逆轉(zhuǎn)NCAPD3誘導(dǎo)的GLUT1、HK2、ENO1、PKM2和LDHA的高表達(dá) （圖3C）。丙酮酸、乳酸釋放和ATP產(chǎn)生分析的結(jié)果加強(qiáng)了這一結(jié)果（圖3D-F），這表明沉默或抑制c-Myc可以廢除NCAPD3在糖酵解調(diào)節(jié)中的功能。

此外，進(jìn)行了免疫沉淀和western-blot分析，以探索NCAPD3和c-Myc在細(xì)胞核中的潛在相互作用。從數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)anti-NCAPD3抗體可以在HCT116細(xì)胞中共沉淀c-Myc。此外，在NCAPD3敲低的SW480細(xì)胞中，二者的相互作用也得到了支持（圖3G, H）。染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）-PCR檢測進(jìn)一步證實(shí)，HCT116細(xì)胞中過表達(dá)NCAPD3后，GLUT1、HK2、ENO1、PKM2和LDHA基因啟動(dòng)子處c-Myc的結(jié)合富集顯著增加，而在NCAPD3敲低的SW480細(xì)胞中得到的結(jié)果相反（圖3I, J）。

這些結(jié)果表明c-Myc參與了CRC細(xì)胞中NCAPD3的糖酵解促進(jìn)作用。NCAPD3通過增加糖酵解基因GLUT1、HK2、ENO1、PKM2和LDHA的啟動(dòng)子中c-Myc的表達(dá)和招募更多的c-Myc來促進(jìn)Warburg效應(yīng)。

圖3 NCAPD3上調(diào)c-Myc并促進(jìn)其下游代謝基因的表達(dá)

4. NCAPD3通過E2F1介導(dǎo)的丙酮酸脫氫酶抑制減弱CRC細(xì)胞中TCA循環(huán)通量

如圖4A和B所示，NCAPD3過表達(dá)上調(diào)E2F1及其靶基因PDK1和PDK3的水平，進(jìn)而導(dǎo)致p-PDHE1α（但總PDHE1α）的增加和PDH活性的抑制，而用siRNA或抑制劑或抑制E2F1則逆轉(zhuǎn)了NCAPD3過表達(dá)誘導(dǎo)的結(jié)果。此外，免疫沉淀實(shí)驗(yàn)顯示，抗NCAPD3抗體可以在HCT116細(xì)胞或NCAPD3敲除的SW480細(xì)胞中共沉淀E2F1（圖4C, D），這表明NCAPD3和E2F1在CRC細(xì)胞中相互作用。在HCT116細(xì)胞中，抗E2F1抗體不能共沉淀c-Myc，反之亦然，這表明NCAPD3、c-Myc和E2F1不能形成三聚體復(fù)合物（圖4E）。在HCT116細(xì)胞中，NCAPD3過表達(dá)增加了E2F1與PDK1和PDK3基因啟動(dòng)子的結(jié)合富集，而在NCAPD3敲低SW480細(xì)胞中得到了相反的結(jié)果（圖4F, G）。

圖4 NCAPD3通過調(diào)節(jié)葡萄糖代謝切換器E2F1抑制TCA循環(huán)通量

5. NCAPD3具有促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用

NCAPD3過表達(dá)促進(jìn)了HCT116細(xì)胞的增殖和克隆形成（圖5A, B）。此外，劃傷愈合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，與對照相比，NCAPD3異位表達(dá)顯著增加了HCT116細(xì)胞的遷移（圖5C）。在NCAPD3-敲低的SW480細(xì)胞中，細(xì)胞的增殖、集落形成和遷移都被大大削弱（圖5A-C）。此外，NCAPD3可以通過siRNA敲低（圖5D-F）來增強(qiáng)細(xì)胞增殖、集散形成和遷移。組織學(xué)分析顯示，與對照組相比，接受HCT116-NCAPD3亞群的小鼠形成了肺轉(zhuǎn)移灶（圖5G）。與對照組相比，過表達(dá)NCAPD3導(dǎo)致肺轉(zhuǎn)移瘤中Ki67染色更強(qiáng)（圖5H）。這些結(jié)果表明，c-Myc和E2F1參與了NCAPD3在體外促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖和遷移。此外，體內(nèi)數(shù)據(jù)還表明，HCT116細(xì)胞中過表達(dá)NCAPD3可促進(jìn)腫瘤肺轉(zhuǎn)移。

圖5 NCAPD3促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖、遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移

6. NCAPD3通過增強(qiáng)CRC細(xì)胞有氧糖酵解在小鼠皮下移植瘤模型中促進(jìn)腫瘤生長

過表達(dá)NCAPD3組中移植瘤的大小和重量較對照組明顯增大（圖6A, B），而2-DG組過表達(dá)NCAPD3組移植瘤的大小和重量較過表達(dá)NCAPD3組明顯減小（圖6A，B）。與對照細(xì)胞相比，HCT116-NCAPD3細(xì)胞形成的異種移植瘤的乳酸水平明顯升高，而2-DG處理后的HCT116-NCAPD3細(xì)胞形成的腫瘤的乳酸水平較僅HCT116-NCAPD3細(xì)胞形成的腫瘤降低（圖6C）。NCAPD3過表達(dá)對移植瘤中糖酵解相關(guān)蛋白水平的影響與乳酸釋放實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)論一致（圖6D）。

圖 6 NCAPD3 增強(qiáng)異種移植腫瘤小鼠模型中的腫瘤生長和有氧糖酵解

與野生型（WT）小鼠相比，NCAPD3小鼠在三次DSS處理中體重下降較少，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)體重增加，結(jié)腸長度變長（圖7A、B），表明NCAPD3缺陷小鼠對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的易感性低于野生型小鼠。此外，NCAPD3小鼠的腫瘤數(shù)量和腫瘤大小均顯著低于WT同窩小鼠（圖7C）。Western blotting數(shù)據(jù)證實(shí)，敲除NCAPD3導(dǎo)致c-Myc、E2F1及其下游靶基因在蛋白水平顯著下調(diào)，而PDHE1α蛋白總表達(dá)量不變（圖7D）。組織學(xué)上，與NCAPD3±小鼠相比，WT小鼠呈現(xiàn)上皮完整性缺失和幾乎完全的隱窩缺失（圖7E）。此外，IHC分析還顯示，敲除NCAPD3導(dǎo)致c-Myc、E2F1和GLUT1的染色明顯減弱（圖7E），同樣NCAPD3±小鼠的結(jié)直腸腫瘤增殖率顯著降低，Ki-67細(xì)胞核染色比例較低（圖7E）。這些體內(nèi)結(jié)果表明，NCAPD3缺乏可通過抑制糖代謝重編程和糖酵解來減輕AOM/DSS誘導(dǎo)的小鼠模型中結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生。

圖7敲除NCAPD3可降低AOM/ DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)直腸癌發(fā)生

8. CRC患者NCAPD3及其與代謝相關(guān)基因的相關(guān)性的臨床意義

NCAPD3分別與CRC組織中的c-Myc、ENO1、LDHA、E2F1、PDK1和PDK3呈強(qiáng)正相關(guān)，這進(jìn)一步支持了我們的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖8A）。如圖8B-D所示，NCAPD3-High/ PKM2-High、NCAPD3-High/LDHA-High和NCAPD3-High/ PDK1-High患者的總生存期較短。最后，使用Western blot方法評估了6對臨床CRC組織及其相應(yīng)的相鄰正常組織中NCAPD3、c-Myc和E2F1的表達(dá)水平。與相鄰正常組織相比，CRC組織中NCAPD3、c-Myc和E2F1的表達(dá)量較高（圖8E）。這些結(jié)果表明NCAPD3及其誘導(dǎo)Warburg效應(yīng)可能在結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生和結(jié)直腸癌的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，可能是結(jié)直腸癌的潛在標(biāo)記物和臨床治療靶點(diǎn)。

圖8 CRC患者NCAPD3的臨床意義及其與代謝相關(guān)基因的相關(guān)性

結(jié)論：

在體內(nèi)和體外，NCAPD3通過增加c-Myc和E2F1的表達(dá)并將這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子招募到其靶基因的啟動(dòng)子中，從而通過增強(qiáng)糖酵解過程和抑制TCA循環(huán)來重編碼糖代謝，提示NCAPD3在CRC的發(fā)生發(fā)展中調(diào)節(jié)糖代謝起著重要作用。