FTO通過m6A-YTHDF2依賴性誘導(dǎo)PDGFC自分泌活性促進(jìn)胰腺癌進(jìn)展

m6A是一種新興的mRNA修飾調(diào)節(jié)因子，在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮著新的作用。盡管m6A修飾在病理和生理過程中都具有重要的功能意義，但其在胰腺導(dǎo)管癌（PDAC）中的作用仍不明確。在這里，我們發(fā)現(xiàn)FTO表達(dá)與PDAC患者的不良預(yù)后相關(guān)，并且抑制FTO表達(dá)抑制細(xì)胞增殖。此外，FTO直接靶向PDGFC，并以m6A-YTHDF2依賴的方式穩(wěn)定其mRNA表達(dá)。PDGFC上調(diào)導(dǎo)致Akt信號通路重新激活，促進(jìn)細(xì)胞生長?？傊?，我們的研究表明，FTO下調(diào)導(dǎo)致PDGFC 3?UTR中m6A修飾增加，然后以m6A-YTHDF2依賴性方式調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄水平的降解，突出了PDAC治療和預(yù)后預(yù)測的潛在治療靶點(diǎn)。本文于2022年4月發(fā)表于“Oncogene”（IF=9.867）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）FTO在PDAC中高表達(dá)，與不良預(yù)后相關(guān)

為了解釋m6A在PDAC中的關(guān)鍵作用，我們通過m6A比色分析檢測了10例新鮮人胰腺腫瘤組織及其相應(yīng)正常組織中m6A的整體水平。初步觀察發(fā)現(xiàn)，與相應(yīng)的正常組織相比，PDAC組織中整體m6A豐度顯著降低（圖1A）。然后，為了評估PDAC中主要m6A修飾酶的表達(dá)譜，我們分析了TCGA、GTEx、GSE15471和GSE62452的臨床數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)PDAC組織中FTO mRNA表達(dá)水平顯著高于正常組織（圖1B）。此外，我們驗(yàn)證了復(fù)旦大學(xué)上海癌癥中心（FUSCC）隊(duì)列中的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)。對含有209名患者樣本的組織微陣列（TMA）進(jìn)行免疫組織化學(xué)（IHC）染色（圖1C）。根據(jù)IHC評分，與正常組織相比，F(xiàn)TO在腫瘤組織中的表達(dá)水平更高（圖1D）。Kaplan–Meier生存曲線顯示，F(xiàn)TO高表達(dá)與PDAC患者預(yù)后不良相關(guān)（圖1E）。最后，我們發(fā)現(xiàn)，與人胰腺導(dǎo)管上皮（HPDE）細(xì)胞相比，多個PDAC細(xì)胞系中FTO蛋白表達(dá)上調(diào)（圖1F）。

2）沉默FTO抑制PDAC腫瘤生長

為了研究FTO在PDAC中的作用，用shFTO-a和shFTO-B轉(zhuǎn)染PANC-1和MiaPaCa-2細(xì)胞。FTO敲除效應(yīng)在mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均得到驗(yàn)證（圖2A，B）。FTO敲除導(dǎo)致m6A水平增加（圖2C）。FTO敲除顯著降低PDAC細(xì)胞增殖（圖2D），并降低集落形成效率（圖2E）。同樣，EdU染色分析表明，FTO敲除大大降低了EdU陽性細(xì)胞的百分比（圖2F）。接下來，我們植入了一個皮下胰腺異種移植瘤，以進(jìn)一步確定FTO在體內(nèi)的致癌作用。將具有穩(wěn)定FTO敲除（shFTO-B）的MiaPaCa-2細(xì)胞皮下注射到4周齡雌性BALB/c裸鼠體內(nèi)（圖3A）。與體外觀察結(jié)果一致，FTO沉默組的腫瘤生長大小和重量明顯低于對照組（圖3B，C）。隨后使用抗FTO抗體和增殖標(biāo)記物Ki-67進(jìn)行IHC染色，結(jié)果表明FTO敲除顯著降低了shFTO組的Ki-67染色（圖3D，E）。因此，FTO在促進(jìn)PDAC腫瘤生長中起著關(guān)鍵作用。

3）通過m6A-Seq識別FTO下游靶點(diǎn)

為了確定PDAC中的FTO下游靶點(diǎn)，我們進(jìn)行了甲基化RNA免疫沉淀測序（MeRIP-seq）。主成分分析(PCA)顯示，每個樣本有3個重復(fù)聚類在一起，表明兩組之間重現(xiàn)性良好(圖4A)。在對照和FTO敲除細(xì)胞中，GGAC基序在m6A中高度富集(圖4B)。根據(jù)m6A-seq的結(jié)果，我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)m6A峰主要富集在相鄰的編碼序列(CDS)和3’UTR(圖4C)。我們進(jìn)一步研究了MeRIP-seq表達(dá)數(shù)據(jù)，并探索了m6A和RNA水平均發(fā)生顯著變化的峰值比例。事實(shí)上，在兩組中檢測到292個具有高甲基化m6A峰值以及mRNA表達(dá)降低的基因（圖4D）。在這些差異表達(dá)基因（DEG）中，電壓門控離子通道活性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和質(zhì)膜是GO富集分析中最豐富的條目（圖4E）。KEGG富集分析表明，PDAC中PI3K/Akt通路與FTO依賴轉(zhuǎn)錄相關(guān)（圖4F）。為了驗(yàn)證這一發(fā)現(xiàn)，我們檢測了Akt、P-Akt和P-GSK3β的表達(dá)（圖4G）。FTO敲除顯著降低了PANC-1和MiaPaCa-2細(xì)胞中這些基因的磷酸化水平。在MiaPaCa-2和PANC-1細(xì)胞中，scramble和FTO基因敲除組的PDGFC表達(dá)差異最大。最重要和有趣的是，在FTO敲低組中，一些下調(diào)的轉(zhuǎn)錄本表現(xiàn)出高甲基化的m6A修飾，包括PDGFC。我們關(guān)注PDGFC m6A峰，并發(fā)現(xiàn)其mRNA的3?UTR周圍的富集在FTO敲除后增加（圖4H）。因此，PDGFC被選為FTO介導(dǎo)的m6A 修飾的候選靶點(diǎn)。

4）FTO缺失以m6A-YTHDF2依賴的方式下調(diào)PDGFC mRNA水平

MiaPaCa-2和PANC-1細(xì)胞中的FTO敲除降低了PDGFC mRNA和蛋白質(zhì)水平（圖5A，B）。通過qRT-PCR（圖5C），在異種移植物中也證實(shí)了類似的趨勢。此外，與IgG RIP組相比，FTO敲除顯著促進(jìn)PDGFC mRNA中的m6A水平（圖5D）。與對照細(xì)胞相比，FTO敲除細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低。PDGFC-MUT2幾乎消除了這種誘導(dǎo)，表明PDGFC表達(dá)的調(diào)節(jié)受FTO相關(guān)m6A修飾的控制（圖5F）。由于YTHDF2作為主要m6A讀取器的特異性，我們假設(shè)YTHDF2在PDGFC中的RNA識別和相互作用水平發(fā)揮作用。通過評估TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫，我們發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，PDAC組織中的YTHDF2上調(diào)。事實(shí)上，通過RNA免疫沉淀（RIP）分析評估，YTHDF2與PDGFC有強(qiáng)烈的相互作用。當(dāng)FTO被敲除時，PDGFC轉(zhuǎn)錄本中的YTHDF2富集顯著減少（圖5G）。此外，我們在FTO減少的MiaPaCa-2細(xì)胞中敲除了YTHDF2，并觀察到胰腺細(xì)胞中PDGFC表達(dá)的部分恢復(fù)（圖5H，I）。在FTO敲除條件下，YTHDF2敲除也消除了PDGFC mRNA減少的穩(wěn)定性（圖5J）。因此，我們的數(shù)據(jù)表明FTO以m6A-YTHDF2依賴的方式調(diào)節(jié)甲基化PDGFC mRNA水平。

5）PDGFC是一種促癌因子，與PDAC患者的FTO表達(dá)呈正相關(guān)

TCGA數(shù)據(jù)分析表明，PDGFC水平與PDAC患者的OS呈負(fù)相關(guān)，PDGFC和FTO水平之間呈顯著正相關(guān)（圖6A，B）。值得注意的是，較高的PDGFC水平與較差的OS顯著相關(guān)(圖6C)，并與FTO表達(dá)呈正相關(guān)(圖6D)。此外，利用在TMAs上進(jìn)行的IHC染色，我們進(jìn)一步對PDGFC進(jìn)行存活分析，并驗(yàn)證其在腫瘤和相鄰正常組織之間的表達(dá)差異（圖6F，H）。此外，如圖6G所示，我們還生成了一個包含PDGFC和FTO的新IHC面板來預(yù)測PDAC的預(yù)后。Kaplan–Meier生存分析表明，兩種標(biāo)記物高表達(dá)的患者OS最短。

6）FTO介導(dǎo)的PDGFC激活與PDAC的腫瘤發(fā)生有關(guān)

為了確定PDGFC是否介導(dǎo)FTO在PDAC生長和進(jìn)展中的作用，我們首先基于PDGFC的內(nèi)源性表達(dá)將編碼人PDGFC插入物的慢病毒載體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。我們發(fā)現(xiàn)PDGFC的過表達(dá)特別增加了PDAC細(xì)胞活力和集落形成，但也消除了FTO敲除條件下的下降（圖7A-C）。接著，我們評估了胰腺癌細(xì)胞中Akt/GSK3β磷酸化、c-Myc和Cyclin D1的表達(dá)。FTO敲除降低了這些基因的表達(dá)，而PDGFC過表達(dá)挽救了這種趨勢（圖7D）。此外，為了進(jìn)一步證實(shí)我們的假設(shè)，我們檢測了Akt抑制劑（MK2206）是否可以消除PDGFC過表達(dá)細(xì)胞中這些基因的表達(dá)。在PDGFC過表達(dá)的細(xì)胞中，Akt/GSK3β磷酸化水平以及c-Myc和Cyclin D1表達(dá)上調(diào)，而在MK2206處理的細(xì)胞中，這些水平降低（圖7E）。

7）FTO誘導(dǎo)PDGFC自分泌活性并與PDAC細(xì)胞增殖相關(guān)

我們在FTO穩(wěn)定的敲除細(xì)胞中過表達(dá)PDGFC，并使用ELISA檢測PDAC細(xì)胞分泌PDGFC的內(nèi)源性水平（圖8A）。正如預(yù)期的那樣，穩(wěn)定敲除FTO后PDAC細(xì)胞釋放的PDGFC減少，過表達(dá)后PDGFC恢復(fù)。FB23-2是一種直接與FTO結(jié)合并選擇性抑制FTO m6A去甲基酶活性的抑制劑，它確實(shí)抑制PDAC細(xì)胞中PDGFC的分泌（圖8B）。CCK-8分析表明，CFPAC-1和MiaPaCa2細(xì)胞中FTO的過表達(dá)增強(qiáng)了細(xì)胞的增殖和活力，而FTO的過表達(dá)與PDGFR抑制劑的結(jié)合顯示出更強(qiáng)的抑制作用（圖8C，D）。此外，對在DMEM（全培養(yǎng)基）中培養(yǎng)的FTO scramble和敲除細(xì)胞進(jìn)行CCK8分析，無論是否用重組人PDGFC（10 ng /ml）處理，也證明了外源性PDGFC的刺激增殖活性（圖8E）。為了進(jìn)一步闡明PDGFC誘導(dǎo)的信號通路，我們用重組人PDGFC（10 ng/ml）處理MiaPaCa-2細(xì)胞。值得注意的是，48小時的重組人PDGFC預(yù)處理可在scramble和FTO敲除條件下誘導(dǎo)Akt/GSK3β激活的磷酸化水平（圖8F）。總之，這些結(jié)果表明，自分泌內(nèi)源性和外源性重組人PDGFC可促進(jìn)PDAC細(xì)胞的生長，其部分由Akt/GSK3β信號驅(qū)動。

結(jié)論：我們的研究揭示了胰腺癌中m6A甲基化水平的降低是由FTO的失調(diào)引起的。FTO和PDGFC的聯(lián)合可作為預(yù)后工具和治療反應(yīng)標(biāo)志物。FTO/PDGFC/PDGFR治療靶點(diǎn)的潛力可用于開發(fā)有效治療PDAC的治療方案。這些發(fā)現(xiàn)為m6A修飾調(diào)控PDAC腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制提供了新的見解。

參考文獻(xiàn)：

Tan Z, Shi S, Xu J, Liu X, Lei Y, Zhang B, Hua J, Meng Q, Wang W, Yu X, Liang C. RNA N6-methyladenosine demethylase FTO promotes pancreatic cancer progression by inducing the autocrine activity of PDGFC in an m6A-YTHDF2-dependent manner. Oncogene. 2022 May;41(20):2860-2872. doi: 10.1038/s41388-022-02306-w.