METTL3調(diào)控肌肉的維持和生長

骨骼肌的生長是機體健康的基礎(chǔ)?；虮磉_波動對肌肉穩(wěn)態(tài)和對環(huán)境損害的響應(yīng)至關(guān)重要。但是目前，對于調(diào)節(jié)這種波動同時影響肌肉蛋白質(zhì)組的轉(zhuǎn)錄后機制知之甚少。本文報道了在超載誘導(dǎo)應(yīng)激后骨骼肌肥厚性生長的mRNA m6A動態(tài)的全基因組分析。本研究于2022年1月發(fā)表在《Nature Communications》IF：14.919期刊上。

技術(shù)路線：

主要實驗結(jié)果：

1、m6A增加和重塑伴隨著骨骼肌肥厚

為確定m6A在骨骼肌肥厚中的作用，作者首先評估了機械過載小鼠中RNA上的m6A修飾水平，發(fā)現(xiàn)相比于對照小鼠，過載肌肉組織的整體m6A水平增加（圖1a-b），且這種增加源于METTL3的表達增加（圖1c-d），表明成年肥厚肌生長期間METTL3-m6A軸整體增強。為深入鑒定肌肉過載后m6A修飾的mRNA，進行了meRIP-seq（圖1e）。雖然轉(zhuǎn)錄組上的一組核心m6A峰不受肥大刺激的影響，但分析顯示，在1674個mRNA上，過載肌肉中m6A的重塑在870個新轉(zhuǎn)錄本上獲得了1704個m6A峰，并且有804個mRNA 在適應(yīng)過載刺激時喪失了1591個m6A峰（圖1f, g）。對轉(zhuǎn)錄本上m6A位置的分析還發(fā)現(xiàn)，這種修飾在mRNA終止密碼子附近富集，在基線和過載條件下，其密度和頻率略有差異（圖1h, i）。對m6A修飾的肌肉轉(zhuǎn)錄組的GO分析進一步強調(diào)了m6A修飾mRNA編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的穩(wěn)定存在，而最豐富的一類超載響應(yīng)轉(zhuǎn)錄本是由參與磷酸化依賴細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控的蛋白編碼的（圖1j, k）。這些數(shù)據(jù)暗示了m6A依賴的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控、轉(zhuǎn)錄和翻譯后通路之間的相互作用?？傊@些結(jié)果表明，增加的METTL3表達和m6A豐度標志著骨骼肌的肥厚反應(yīng)，在超負荷誘導(dǎo)肥厚過程中，m6A靶向轉(zhuǎn)錄組重塑影響特定的酶促肌肉過程。

圖1 METTL3和m6A重構(gòu)伴隨著肌肉生長

2、METTL3是適應(yīng)肥厚肌肉壓力所必須的

為確定METTL3在成人骨骼肌中的作用以及控制其水平的后果，建立了一個肌纖維特異性METTL3功能缺失小鼠模型(METTL3肌肉敲除，M3-mKO)（圖2a）。METTL3缺失效率表現(xiàn)為肌肉中METTL3的mRNA水平和蛋白水平均顯著下降（圖2b,c）。這種短期敲除策略不影響小鼠的體重、心臟重量和骨骼肌重量（圖2d-h）。為確定METTL3是否對成年骨骼肌肥大有必要，對M3-mKO小鼠和同窩小鼠進行了肌肉超負荷試驗。在超載14天后，M3-mKO小鼠的跖肌重量未能增加到與WT對照組相同的程度（圖2i）。肌肉細胞大小分析進一步表明，M3-mKO小鼠中，過度負荷引起的肌纖維橫截面增加被消除（圖2j, k）。因此，在骨骼肌對機械負荷的肥厚反應(yīng)中，METTL3對肌細胞生長至關(guān)重要。

圖2 METTL3是響應(yīng)肌肉生長所必須的

3、增強METTL3通路有利于骨骼肌的生長

證明METTL3對肌肉肥大的必要性引出了一個問題，即增加骨骼肌中METTL3的表達是否足以增強對肌肉超負荷的肥厚反應(yīng)。為此，構(gòu)建METTL3過表達質(zhì)粒（M3-OE）和對照質(zhì)粒（Ctrl），電轉(zhuǎn)至小鼠跖肌，隨后對小鼠進行肌肉過載刺激（圖3a）。METTL3過表達后小鼠跖肌中METTL3的表達顯著增加（圖3b），m6A水平顯著增加（圖3c）。令人驚訝的是，METTL3過表達后小鼠跖肌的重量和肌纖維橫截面顯著增加（圖3d-f）。然后，測試了覆蓋METTL3通路是否足以在出生后發(fā)育期間增強骨骼肌生長。為此，將編碼小鼠METTL3或?qū)φ詹《据d體的腺相關(guān)病毒(AAV)注射到出生后第3天的小鼠中（圖3g）。8周后檢測發(fā)現(xiàn)，AAV-METTL3組小鼠的METTL3表達，跖肌的重量和肌纖維橫截面顯著增加（圖3h-j），提示METTL3可驅(qū)動肥厚響應(yīng)。最后，探究METTL3是否可以在沒有肥厚觸發(fā)器的情況下驅(qū)動肌肉質(zhì)量的自發(fā)增加。為此，向5個月大的小鼠脛骨前肌注射AAV-METTL3或?qū)φ詹《据d體（圖3k）。結(jié)果顯示脛骨前肌METTL3有效過表達，較高的METTL3含量伴隨著脛骨前肌重量的增加和肌纖維大小的顯著增加（圖3l-n）。

圖3 METTL3在骨骼肌中是促肥厚的

4、METTL3對于骨骼肌的維持和功能是必須的

保持健康的肌肉量對于預(yù)防老年人和其它慢性疾病群體的發(fā)病率和死亡率至關(guān)重要。為評估METTL3通路的失調(diào)是否足以導(dǎo)致肌肉萎縮，進行了一個慢性缺失實驗，將成人肌肉中的METTL3敲除8個月（圖4a）。雖然METTL3敲除對身體或心臟重量沒有顯著影響(圖4b, c)，但METTL3的慢性長期缺失導(dǎo)致所有分析的骨骼肌質(zhì)量下降（圖4d-h）。通過量化脛骨前肌、足底肌和比目魚肌的橫斷肌纖維面積，在細胞水平上證實觀察到的肌肉萎縮（圖4i-l）。為了確定METTL3缺失8個月后觀察到的肌肉損耗的功能后果，進行了體內(nèi)肌肉扭矩測量，結(jié)果顯示METTL3缺失小鼠的跖屈強直性肌肉力下降（圖4m），并且METTL3缺失小鼠在跑步機代謝試驗中進一步表現(xiàn)出跑步性能缺陷和最大耗氧量降低（圖4n, o）?？傊@些數(shù)據(jù)表明，隨著時間的推移，METTL3對于維持肌肉質(zhì)量和功能是必要的。

圖4 METTL3的慢性缺失會導(dǎo)致肌肉萎縮

5、肌肉m6A-RNA翻譯的METTL3依賴調(diào)節(jié)可調(diào)控肥厚基因調(diào)節(jié)

mRNA上m6A的形成可以通過改變修飾后mRNA的翻譯能力來影響基因的轉(zhuǎn)錄后表達。為了從機制上理解METTL3如何調(diào)節(jié)肌肉大小，在骨骼肌動蛋白啟動子的控制下，將M3-mKO小鼠和野生型對照小鼠與含有RPL22的HA標簽的小鼠雜交，從而分離肌纖維特異性核糖體（圖5a）。首先驗證HA-RPL22的表達（圖5b）。使用HA抗體對從總肌肉提取物中提取的肌纖維核糖體進行免疫沉淀，分析核糖體相關(guān)轉(zhuǎn)錄本，然后對“拉下”mRNA進行測序，作為肌纖維特異性“翻譯體”的代表，與總歸一化mRNA對比（圖5c）。核糖體相關(guān) mRNAs 的生物信息學(xué)交叉分析，來自對照肌肉有或沒有 METTL3，與之前由 meRIP-seq 鑒定的所有對照 m6A mRNAs 重疊分析顯示，約39% 的mRNAs經(jīng)歷 METTL3 依賴性差異翻譯，因而直接靶向METTL3 通路（圖5d）。特別是，在557份差異翻譯轉(zhuǎn)錄本中(453份富集于WT，加上104份富集于mKO)，216份含有m6A(178份富集于WT，加上38份富集于mKO)。對這些重疊轉(zhuǎn)錄本的GO分析顯示，TGF-β超家族受體是最豐富的（圖5e）。在這類基因中，激活素2型A受體(Acvr2a)是METTL3 KOs肌肉中翻譯增加的典型轉(zhuǎn)錄本（圖5f）。結(jié)果證實，Acvr2a上的m6A修飾是METTL3依賴的(圖5g)，肌肉中METTL3的缺失導(dǎo)致Acvr2a mRNA翻譯量增加(圖5h)和Acvr2a蛋白合成量增加(圖5i)。含YTH結(jié)構(gòu)域家族(YTHDF)的RNA結(jié)合蛋白是m6A修飾轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵調(diào)控因子。YTHDF2可以特異性結(jié)合Acvr2a mRNA（圖5j）。YTHDF2有利于相互作用轉(zhuǎn)錄本的衰減，表明依賴于METTL3的m6A甲基化可能影響Acvr2a的穩(wěn)定性。事實上，METTL3降低了Acvr2a mRNA的穩(wěn)定性（圖5k）。

圖5 METTL3介導(dǎo)的m6A修飾調(diào)節(jié)肌生成抑制素通路

6、METTL3通過調(diào)控Activin受體的m6A影響TGF-β超家族信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

在肌肉超負荷時，m6A對Acvr2a mRNA的修飾進一步增加(圖6a)，表明在應(yīng)激適應(yīng)過程中，METTL3對該通路的作用增強。Activin受體激活通過細胞內(nèi)SMAD3磷酸化發(fā)揮抗肥厚作用。因此，探究了這種翻譯后修飾，發(fā)現(xiàn)METTL3缺陷小鼠在超負荷的肌肉中有異常的SMAD3磷酸化(圖6b)。在METTL3缺陷的肌肉中，抗肥厚性SMAD3的轉(zhuǎn)錄靶點，如Murf1和Mafbx的表達增加（圖6c, d）。因此，METTL3形成的m6A通過調(diào)控Activin受體mRNA翻譯影響TGF-β超家族信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

圖6 METTL3通過調(diào)控Activin受體的m6A影響TGF-β超家族信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

7、Activin受體通路的抑制可挽救METTL3敲除表型

METTL3 介導(dǎo)的 m6A 修飾對 TGF-β 超家族受體的影響突出了 METTL3 作為肌生長抑制素途徑的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)劑的作用。為了證明Activin受體生物學(xué)和 METTL3 依賴性肌肉質(zhì)量調(diào)節(jié)之間的因果關(guān)系，施用了ACE-031，一種Activin受體配體的抑制劑（即肌肉抑制素，因為這種蛋白質(zhì)是骨骼肌中這些受體的主要配體）（圖7e）。聯(lián)合給藥肌生長抑制素抑制劑完全拯救了M3-mKO小鼠在14天的肌肉過載后觀察到的受損的肥大生長，在器官水平上通過足底重量和肌纖維水平上通過橫截面積評估（圖7f-h）。

圖7 METTL3-mKO小鼠的肥大缺陷被肌生長抑制素抑制劑拯救

總之，本研究表明，METTL3通過微調(diào)激活素受體翻譯影響成人骨骼肌維持、肥厚性生長和功能來調(diào)節(jié)肌肉生長（圖7i）。

參考文獻：

Petrosino Jennifer M., Hinger Scott A., Golubeva Volha A., Barajas Juan M., Dorn Lisa E., Iyer Chitra C., Sun Hui-Lung., Arnold W David., He Chuan., Accornero Federica.(2022). The mA methyltransferase METTL3 regulates muscle maintenance and growth in mice. Nat Commun, 13(1), 168. doi:10.1038/s41467-021-27848-7